Summary
Des lignées cellulaires de cancer immortalisées peuvent être cultivées sous forme de cultures de cellules 3D, un modèle précieux pour la recherche biologique. Ce protocole décrit imagerie par spectrométrie de masse des cultures de cellules 3D, y compris l'amélioration de la plate-forme de préparation de l'échantillon. L'objectif de ce protocole est de demander aux utilisateurs de préparer des cultures cellulaires 3D pour la masse analyse de l'imagerie par spectrométrie.
Protocol
1. 3D Culture cellulaire et préparation pour l'imagerie
- Culture d'une lignée cellulaire appropriée, ce est à dire, la lignée cellulaire de carcinome du côlon HCT116, en deux dimensions, de la culture monocouche.
- Cultiver les cellules HCT 116 dans un flacon T-25 avec les supports de McCoy 5A + 10% de sérum bovin fœtal dans un incubateur à CO2 à 5% jusqu'à 50 à 70% de confluence, ce qui prend généralement quelques jours.
- cellules de sortie avec une solution de trypsine-EDTA 0,25% et comptent une partie des cellules en utilisant un hémocytomètre et coloration au bleu trypan pour vérifier la densité et la viabilité cellulaire.
- Après comptage, diluer les cellules avec du milieu complet pour obtenir une densité d'ensemencement appropriée de 6000 cellules / puits, ou 30 000 cellules / ml.
2. Préparer Agarose Coated plaques à 96 puits
- Ajouter 0,19 g d'agarose à 10 ml de milieu standard dans un tube conique de 50 ml (solution d'agarose à 1,5% dans des milieux 10). Veiller à l'incorporation par mélange doux. Autoclave l'agarose dans un bain d'eaupendant 20 min.
- En utilisant une pipette multicanaux, aspirer 50 pi du mélange d'agarose + supports dans les 60 puits centraux du fond 96 puits plaque de culture de plaque plane. Comme les puits au niveau des bords périphériques de la plaque ont des taux légèrement plus élevés d'évaporation, ajouter 200 ul de phosphate 1x solution saline tamponnée (PBS) au lieu de l'agarose à ces bords.
- Une fois le mélange agarose a été ajouté dans les puits intérieurs, réglez la plaque de côté pour refroidir à 37 ~ ° C avant l'addition des cellules.
3. Plutôt semences et la culture tridimensionnelle
REMARQUE: Les cellules plus ou moins peuvent être ensemencées en fonction des exigences de la culture concernée, mais il a été déterminé que ces conditions conduisent à des structures 3D de culture de cellules d'environ 1 mm de diamètre après 10 à 14 jours de culture (données non présentées) .
- Ajouter 200 ul de la solution de cellules appropriée (dilué pour contenir ~ 6000 cellules) de l'agarose enduitePlaque de 96 puits. Couvrir la plaque et mettre dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C pour la croissance cellulaire.
- Changer de support de cellules un minimum de toutes les 48 heures, ou lorsque les médias semble changer de couleur.
- Changer médias en aspirant soigneusement l'ancien médias à travers le petit culture cellulaire 3D (visible à l'oeil nu par jour 2) au fond de l'agarose. Ajouter 200 ul de milieu frais doucement sur la culture de cellules 3D.
- (Étape optionnelle) Au cours de ces changements des médias, ajouter de chimiothérapie ou d'autres médicaments pour les essais. Diluer le médicament de choix à la concentration finale avec les médias complètes et ajouter les nécessaires 200 pi dans chaque puits.
- Surveiller 3D croissance de culture de cellules au microscope optique, jusqu'à ce que les cultures de cellules 3D sont d'environ 1 mm de diamètre.
4. Récolte des cultures de cellules 3D
- Utilisez un 2 ml pipette sérologique pour enlever délicatement la culture cellulaire 3D du lit agarose. <li> Lavez les cultures de cellules en 3D avec PBS en les pipetant doucement dans environ 1 ml de PBS dans une plaque à 24 puits en attente.
- Transfert récolté des cultures de cellules 3D via une pipette sérologique de tubes à centrifuger de protéine ou d'un métabolite extraction, ou de les incorporer dans un support de coupe pour aider à découper pour des applications d'imagerie.
5. Intégrer les cultures de cellules en 3D dans de la gélatine
- Préparer une solution de ~ 175 mg / ml de gélatine dans de l'eau de haute pureté (18 MQ préféré). 22,23 Mélanger la gélatine vigoureusement. Observez la solution devenir visqueux et difficile à manipuler. Placer le tube conique contenant de la gélatine dans un bain d'eau à ~ 60 ° C et au chaud jusqu'à ce que la solution devient limpide et facile à aspirer.
REMARQUE: La solution de gélatine chaude durcit rapidement en se refroidissant, donc effectuer toutes les étapes suivantes rapidement avant de les congeler. - Après il est chauffé, prendre immédiatement la gélatine à la hotte de culture cellulaire. Garder le tube avec de la gélatine dans un beaker avec de l'eau préchauffée à environ 60 ° C pour éviter le durcissement de la solution de gélatine.
- En utilisant une pipette sérologique de 2 ml, déposer 0,6 ml de la solution de gélatine chaude dans le puits d'une plaque à fond plat 24. Ce volume est suffisant pour couvrir le fond d'une couche mince. Déposer doucement sur les cultures de cellules 3D immédiatement au-dessus de la couche de gélatine en utilisant une pipette de 2 ml différent pour éviter la rupture de la structure 3D.
NOTE: Il faut veiller à ce stade de ne pas placer PBS dans la gélatine. Si cela se produit, cependant, enlever le PBS à partir du haut de la gélatine en utilisant une pipette de 200 pi. - Après que les cultures de cellules 3D sont placées sur la surface de la couche de gélatine, une pipette soigneusement autre 0,6 ml du mélange de gélatine chaude sur les cultures de cellules 3D, afin de ne pas perturber la position des cultures. Après la deuxième couche est placé, geler les cultures de cellules 3D gélatine intégré à -80 ° C.
6. Trancher et Thaw mont ee-gélatine intégrée des cultures cellulaires 3D pour l'imagerie par spectrométrie de masse
- Retirer la plaque à 24 puits contenant les cultures de cellules 3D du congélateur. Chauffer le bas de la plaque avec la chaleur de votre main jusqu'à une pince ou d'un scalpel seront faites glisser doucement sur le côté du puits.
- Glisser doucement la pince à épiler ou un scalpel, libérant la gélatine sans décongélation du centre. Prendre une goutte d'eau sur le support de cryostat et l'utiliser pour faire adhérer la gélatine disque sur le support.
- Des cultures de cellules 3D incorporés dans de la gélatine se prêtent le mieux à découper à -30 ° C. Nettoyez la lame de cryostat et le verre avec 70% d'éthanol avant utilisation. Utilisez une autre partie de la lame ou une nouvelle lame pour chaque cellule disque 3D culture gélatine pour empêcher ternissement de la lame.
- Utilisation du cryostat, doucement face à l'excès de gélatine jusqu'à ce que les cultures de cellules 3D deviennent visibles.
- À ce stade couper lentement les cultures de cellules en 3D avec un mouvement lisse 12-16 um sections.
NOTE: Les facteurs critiques à trancher comprennent la distance du verre à la lame, l'angle de la lame, la température du cryostat, et l'angle du disque sur le support, de sorte que tous ceux-ci doivent être vérifiés pour se assurer des résultats cohérents. - Décongeler délicatement les tranches et les monter sur indium oxyde de titane (ITO) lames de verre revêtues d'correctement étiquetés et rangez-la dans un dessiccateur. Utilisez les tranches aussi rapidement que possible pour une qualité maximale.
7. Demande de Matrix et la préparation d'échantillons pour MALDI Imaging
- Avant imagerie MALDI, préparer tranches avec la matrice appropriée.
- Pour l'analyse petite molécule, aucune des étapes de lavage sont généralement nécessaires. Pour la détection de la protéine intacte, laver les tranches dans 100% d'acétone froid, le liquide de Carnoy, ou 70% / 95% d'isopropanol pour éliminer les petites molécules telles que des lipides qui pourraient masquer le signal 24 - 26.
- Lavez délicatement pour pas plus de 30 secondes à la fois. Ne pasdéranger les tranches.
- Préparer matrice dans une solution de solvant organique et d'eau, avec 0,1% de TFA. Pour de petites molécules tels que α-cyano-4-hydroxycinnamique acide (CHCA), utiliser 60% d'ACN: 40% H 2 O: 0,1% de TFA (10 mg / ml). Pour la détection de protéines tels que l'acide sinapique (30 mg / ml), utiliser la même solution dans un solvant. Pour solubilité optimale de l'acide sinapique, dissoudre d'abord dans de l'acétonitrile avant l'addition du TFA: H 2 O solution. D'autres matrices peuvent être utilisées le cas échéant.
REMARQUE: matrice peut être appliquée à plusieurs méthodes différentes, mais il convient de noter certaines matrices ont été trouvées de co-cristalliser avec de la gélatine, tel que l'acide férulique, rendant l'échantillon inutilisable. Les petits cristaux produisent des spectres de masse plus uniforme, ce qui permet d'espèces moléculaires plus être détectés et attribués à des différences biologiques plutôt que des effets de matrice. - Appliquer la matrice par la méthode handspotting.
- Utiliser une seringue de pointe fine pour appliquer 0,5 pi de la matrix solution sur la culture cellulaire 3D tranche et permet la matrice pour cristalliser.
- Vous pouvez également utiliser la méthode de l'aérographe. Remplissez un aérographe de qualité commerciale avec la solution de matrice.
- Tenir le pulvérisateur 8-12 centimètres de la diapositive, viser une fine pulvérisation à la tranche. Entre les passages, la matrice permet de sécher pendant 1 min pour permettre la meilleure formation de cristaux. Jusqu'à 10-20 passes de l'aérographe est nécessaire pour produire une couche optimale de la matrice 22.
- Vous pouvez également utiliser la méthode de sublimation détaillé ailleurs. 25,27
- Lames sécher dans un dessiccateur pendant au moins 30 min avant l'MALDI-MSI, quelle que soit la méthode d'application de la matrice 25.
8. MALDI-MSI analyse à partir d'un système MALDI-TOF (c.-à-AUTOFLEX III)
NOTE: Cette section contient des instructions et des conseils pour le réglage des paramètres pour une expérience d'imagerie MALDI-TOF. Selon les tenantsfabricant et logiciels utilisés trument, le processus peut varier.
- Monter les diapositives dans un adaptateur fait pour tenir solidement 75 mm x 25 diapositives mm à l'image 3D les tranches de culture cellulaire attachés à lamelles recouvertes ITO. Charger l'adaptateur de diapositives dans l'instrument.
- Préparer l'instrument de MALDI-MSI en sélectionnant une norme de calibrage approprié pour la gamme de masse en question. Pour interrogation de petites molécules, les signaux détectés qui correspondent à la matrice utilisée, α-CHCA, sont un groupe commun de étalons. Pour l'analyse de protéines, les normes de protéine connue (ce est à dire, l'ubiquitine, trypsinogène) dans la gamme de masse d'intérêt sont choisis et repérés à proximité des cultures de cellules 3D comme étalons. Calibrer l'appareil avant de procéder à l'élaboration de méthodes.
- Avant imagerie, développer des méthodes d'acquisition de données pour la gamme de masse de choix en utilisant le logiciel fourni par le fabricant de l'instrument. Voir les figures 1 et 2 pourune petite molécule de protéine et d'imagerie. Pour l'imagerie du petit molécule, utiliser le mode réflectron pour la résolution de masse plus élevée.
- Réglez la plage de masse pour l'acquisition de données de petites molécules entre 100-1000 m / z et pour les protéines entre 8,000- 25,000 m / z. Réglez la plage de masse pour englober la région de choix tout en offrant la résolution de masse plus élevée possible avec l'instrument.
- Réglez la puissance du laser, la fréquence, le nombre de tirs laser et taille de la tache à l'aide de la solution d'étalonnage et une «sacrificielle» culture cellulaire 3D tranche à proximité. Observez ces paramètres dans le logiciel de commande principal de l'instrument. Utilisez les paramètres suivants comme point de départ recommandée: puissance de 60%, 400 tirs laser, ultra petite taille de spot. Ces paramètres varient selon les instruments et méthodes, afin d'optimiser les paramètres de l'appareil pour donner le spectre de la plus haute qualité pour chaque instrument spécifique. D'autres paramètres qui peuvent être ajustés comprennent le gain du détecteur, la fréquence d'échantillonnage, et le gain électronique. Save cette méthode pour une utilisation dans le logiciel d'imagerie (ie., Exécution automatique Méthode qui se appuiera sur FlexImaging).
REMARQUE: Supprime les ions ci-dessous la gamme de masse d'intérêt (à nouveau trouvé dans le contrôle de l'instrument) afin de ne pas interférer avec la détection. - Développer protéines méthodes d'acquisition de données pour la gamme de masse de choix. Suivez les mêmes étapes décrites ci-dessus, mais pour les gammes milieu à la masse élevée, supérieure à environ 3 kDa, utiliser le mode linéaire.
REMARQUE: Les paramètres diffèrent de ceux utilisés pour les petites méthodes de molécules.
- paramètres de l'appareil de configuration spécifiques MS en utilisant le logiciel d'imagerie fournie par le fabricant de l'instrument, comme FlexImaging pour les systèmes Bruker MALDI-TOF.
- Créez un nouveau fichier d'imagerie et le dossier, en utilisant les méthodes développées avant et enregistrés. Sélectionnez les paramètres de l'appareil tels que la taille du spot de trame (de changement de la valeur par défaut environ 200 um à 50 um), mis en place la méthode de contrôle d'instruments (de configuration de l'étape 8.3.2 ou 8.3.3), et Position où numériser sur la culture cellulaire 3D.
- Sélectionner trois points enseignent appropriées sur l'échantillon, le déplacement du laser à chaque tour à tour. Obtenir la photographie optique depuis le logiciel de commande de laser MALDI-TOF utilisant 'écran d'impression'.
NOTE: De nombreux logiciels d'imagerie nécessitent une photographie optique de l'échantillon à «enseigner» le logiciel où le laser est situé, qui peut être obtenu avec un scanner ou souvent la caméra de l'appareil.
- Puis démarrer le processus d'imagerie à partir du logiciel d'imagerie (pas le contrôle de l'instrument) et d'acquérir des spectres de masse de chaque tranche. Observez la plupart des masses à travers la culture cellulaire 3D et d'autres localisés à des zones particulières.
9. Facultatif Méthodes d'analyse de données
- Pour l'analyse ciblée, effectuer une analyse manuelle des spectres en cliquant sur une masse dans le spectre de moyenne, ou de permettre le logiciel d'imagerie de récupérer automatiquement des masses dessus d'un seuil particulier (par exemple., Pics above haut seuil de 20%). Pour le contrôle de qualité, examiner la distribution des pics de la matrice ou le spectre moyen.
- Effectuer des analyses statistiques avec des données extraites des logiciels mathématiques tels que R ou Matlab.
- Export spectres unique, au format ASCII, un fichier texte lisible, pour charger dans le logiciel de choix.
- Convertir les différents spectres en ASCII, mzXML, format mzML pour la lecture de plusieurs logiciels différents, 28 -. 31 ou exporter les données comme un Analyser (.img) de format, un format couramment utilisé pour d'autres applications d'imagerie telles que l'IRM 32 Deux options open-source pour l'analyse sont MSiReader et BioMap 32,33.
- Une fois les fichiers sont exportés dans un format lisible par le logiciel, charger l'ensemble de données via les instructions du logiciel respectif. Après le chargement, effectuer un traitement post-acquisition, comme l'enlèvement de base et de la normalisation.
- Avec cet ensemble de données, effectuer des statistical traitements tels que l'analyse en composante de classification hiérarchique en utilisant des scripts ou construites dans les algorithmes des logiciels tels que Matlab 18 personnalisés.
Representative Results
MSI imagerie a le potentiel de révéler beaucoup distribution moléculaire différente dans des cultures de cellules 3D. En utilisant la méthode décrite ci-dessus, les espèces de petites molécules (figure 1) à de grandes protéines (Figure 2) peuvent être suivis à travers la culture. Ces résultats montrent la visualisation d'un seul ion avec l'outil MSiReader libre. 32 Les résultats peuvent être analysés pour les ions uniques d'intérêt dans la culture cellulaire 3D avec un logiciel de visualisation, soit dans une région d'intérêt ou la totalité de la région balayée. En outre la plupart des logiciels de visualiser automatiquement ions dessus d'un certain seuil fixé par l'utilisateur, ce qui peut aider les efforts de découverte. Une fois les cartes d'ions uniques sont obtenus, la plupart des logiciels comprend une possibilité de superposer les images pour voir la colocalisation des ions. Soit dans la découverte approches fondées ou de manière ciblée, l'imagerie par spectrométrie de masse est un outil puissant pour analyser les cultures de cellules 3D.
Figure 1. Les résultats représentatifs de 3D croissance de culture de cellules et de sectionnement. Gauche) de l'image optique d'une structure de culture de cellules intactes colorectal HCT-116 en 3D tel que vu à 14 jours avant la récolte. Droite) optique de l'image d'une tranche d'environ équatoriale d'une 3D dégel de culture cellulaire colorectal monté sur une glissière ITO pour l'imagerie. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les résultats représentatifs de petite molécule MALDI-MSI d'une section équatoriale d'une culture cellulaire 3D. Haut) de spectres de masse moyenne obtenue avec α-CHCA dans la gamme faible masse (petite molécule). Bas) images représentatifs deune seule masse: 327,8 m / z principalement localisée à l'intérieur de la culture de la cellule 3D et 429,7 m / z principalement localisé sur le bord de la culture de cellules 3D. La ligne pointillée indique le bord approximative du sphéroïde. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les résultats représentatifs de l'imagerie des protéines par MALDI-MSI d'une section équatoriale d'une culture cellulaire 3D. Haut) de spectres de masse moyenne atteint avec de l'acide sinapique dans le supérieur (gamme de protéines) de masse. Bas) représentatifs des images d'une seule masse: 10 871 m / z principalement localisé sur le bord de l'ellipsoïde, et 12 184 m / z localisée plus vers l'intérieur de l'ellipsoïde. La ligne pointillée indique le bord approximative du sphéroïde. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
En utilisant les procédés décrits ci-dessus, les cultures cellulaires peuvent être cultivées en 3D et analysés par MALDI-MSI. Beaucoup de lignées cellulaires immortalisées seront former des structures 3D lorsqu'elles sont cultivées de façon appropriée. 9,10 Il faut prendre soin de cultiver des cellules qui ne ont pas été transmis trop de fois, ce est avoir un faible nombre de passages. En général, les cellules ayant les numéros de passage de dix et inférieur sont optimales pour des cultures de cellules en croissance 3D. La croissance des cultures de cellules en 3D dans un support traditionnel agarose fournit un moyen rentable pour les groupes de recherche intéressés par la culture cellulaire 3D pour essayer ce système. Cette méthode utilise peu de composants ne sont pas déjà dans la plupart des laboratoires de mammifère en culture cellulaire. Une attention particulière doit être accordée à la préparation des plaques d'agarose pour la croissance afin que les cultures de cellules 3D sont compatibles en taille et en forme; certains aspects qui nécessitent une attention particulière comprennent la vérification qu'aucune des bulles d'air sont piégées dans le mélange et en ce qu'un ménisque appropriée est formée au fond de chaque well. Si le ménisque ne se forme pas correctement, les cellules peuvent croître dans des formes non sphéroïde ou en petits amas. De plus, il faut prendre soin de ne pas placer dans le PBS gélatine avec les sphéroïdes. Si cela se produit, enlever le PBS à partir du haut de la gélatine en utilisant une pipette de 200 pi. Si le coût ne est pas un facteur, ultra-faible plaques à fond rond contraignantes sont commercialement disponibles et offrent la simplification de ces étapes. Bien que d'autres méthodes d'incorporation de tissu peuvent également être coûteux et spectrométrie de masse non-compatible, la gélatine-enrobage a été démontré à la fois peu coûteux et versatile. stratégies de préparation décrites ci-dessus ont été optimisés pour les cultures cellulaires 3D pour obtenir des données de la plus haute qualité. Alors que la gélatine-enrobage a été montré pour être compatible avec l'analyse par spectrométrie de masse, ce processus fait rétrécir les matrices disponibles en raison de co-cristallisation. Une fois congelés, les cultures de cellules en 3D sont stables pendant des mois tant qu'ils ne sont pas congelé et décongelé. La gélatine devient opaque quand ils sont gelés, et la cellule 3Dcultures sont d'une couleur similaire, il est donc conseillé avant de les congeler pour documenter la 3D placement de culture cellulaire pour aider à trancher.
Lors de la préparation des diapositives, la matrice peut être appliquée à plusieurs méthodes différentes, mais il convient de noter que certaines matrices ont été trouvées de co-cristalliser avec de la gélatine, tel que l'acide férulique, rendant l'échantillon inutilisable. Les petits cristaux de matrice produisent des spectres de masse plus cohérente. Alors que handspotting est la méthode la plus simple d'application de la matrice, le plus grand volume de solvant peut entraîner de plus grandes tailles de cristal et de la migration de l'analyte significatif.
Au spectromètre de masse, les progrès dans les technologies MALDI-MSI ont réduit l'expertise nécessaire pour les analyses début. L'acquisition et l'analyse des données est simple sur la plupart des systèmes, permettant même un novice d'obtenir des informations de haute qualité à partir de diapositives ITO. Une sélection rigoureuse des paramètres de l'appareil, à proximité optimisé sur non-image 3D digne cellule cultures, est essentielle pour obtenir des données de haute qualité. Par exemple, l'augmentation de la puissance du laser peut augmenter l'intensité de pointe, mais la baisse du pouvoir laser peut améliorer la résolution et de donner les formes des pics plus symétriques. Cultures de cellules en 3D doivent être utilisés rapidement après la coupe pour assurer la qualité optimale de l'échantillon. Dégradation de signal de la protéine peut être vu en moins d'une semaine sans stockage approprié (dessiccateur / -80 ° C congélateur), en particulier dans la région de masse élevée (supérieure à 20 kDa). En raison de la demande croissante, de nombreux logiciels de visualisation différents ont été développés et sont gratuits pour le public de recherche. La plupart des spectromètres de masse d'imagerie ont installé le logiciel nécessaire pour visualiser les masses simples avec les formats propriétaires utilisés sur chaque instrument. Ces logiciels peuvent être utilisés pour obtenir des images de masse unique et exporter les données. La plupart des logiciels permettra également la superposition de deux ou plusieurs masses d'intérêt. En outre, de nombreux téléspectateurs différents pour les données MSI sont téléchargeables gratuitement, comme un MSiReaderd BioMap. 32,33 Les données de spectrométrie de masse obtenus peuvent également être traitées post-acquisition avec facilité, apportant des informations plus utiles à l'avant-garde.
Des produits pharmaceutiques à des lipides des protéines, le système décrit ci-dessus permet l'acquisition rapide de données pour évaluer la distribution de molécules d'intérêt à travers une structure de culture de cellules 3D. Des coupes en série peuvent être prises pour l'image entière de la structure 3D de la construction à partir de chaque image en 2D d'une tranche de la culture de cellules 3D. Les techniques et les notes dans le protocole seront utiles aux chercheurs désireux de commencer la culture de cellules en trois dimensions comme un pont entre culture monocouche et des modèles animaux. Une fois maîtrisé, ces techniques peuvent être appliquées à de multiples types de cultures 3D de cellules, les tissus et les cultures de cellules, permettant aux chercheurs de l'image selon échantillons qu'ils choisissent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCT116 Cell line | ATCC | ATCC CCL-247 | Potential hazard, handle with care |
| McCoy's 5A media | Gibco | 16600-108 | |
| Fetal Bovine serum | HyClone | SH30071.03 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA solution | Gibco | 25200-056 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010049 | |
| Gelatin, unflavored | Knox | Available at most grocery stores in single-packets | |
| ITO-coated glass slides | Delta Technologies, Limited | CG-90IN-S115 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Sinapic Acid | Sigma-Aldrich | 85429 | |
| 0.3 mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set | RoyalMax Airbrush | Many options available on sites such as Amazon.com |
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