Summary
Denne studien hell tilpasses menneske videofluoroscopic svelge studie (VFSS) fremgangsmåter for bruk med murine sykdomsmodeller for det formål å lette translasjonell dysfagi forskning.
Abstract
Denne studien innrettet human videofluoroscopic svelge studie (VFSS) metoder for bruk med murine sykdomsmodeller for det formål å lette translasjonell dysfagi forskning. Vellykkede resultater er avhengig av tre kritiske komponenter: testkamre som tillater selv fôring mens du står uhemmet i et trangt rom, oppskrifter som skjuler motvilje smak / lukt av kommersielt tilgjengelige midler muntlige kontrast og en steg-for-steg testprotokoll som tillater kvantifisering av svelge fysiologi. Eliminering av ett eller flere av disse komponenter vil ha en skadelig innvirkning på forsøksresultatene. Videre vil energinivået evne til gjennomlysning systemet bestemme hvilke svelge parametre kan undersøkes. De fleste forskningssentre har høye energi fluoroscopes designet for bruk med mennesker og større dyr, noe som resulterer i eksepsjonelt dårlig bildekvalitet når du tester mus og andre smågnagere. Til tross for denne begrensningen, har vi identifisert syv VFSS-parametere som er målbare konsekvent hos mus ved bruk av en høyenergi fluoroscope i kombinasjon med den nye murine VFSS protokollen. Vi har nylig fått en lav energi gjennomlysning system med eksepsjonelt høy bildeoppløsning og forstørrelses evner som er designet for bruk med mus og andre smågnagere. Forarbeidet ved hjelp av dette nye system, i kombinasjon med den nye murine VFSS protokollen, har identifisert 13 svelge parametere som er gjennomgående målbar i mus, noe som er nesten dobbelt så mange oppnådd ved anvendelse av konvensjonelle (dvs. høy energi) fluoroscopes. Identifisering av ytterligere svelge parametre forventes som vi optimalisere mulighetene i dette nye systemet. Resultatene så langt viser nytten av å bruke en lav energi gjennomlysning system for å oppdage og kvantifisere subtile endringer i svelge fysiologi som du ellers ville oversett ved bruk av høye energi fluoroscopes å undersøke murine sykdomsmodeller.
Introduction
Dysfagi (svelgeproblemer) er et vanlig symptom på en rekke medisinske tilstander som påvirker mennesker i alle aldre. Eksempler inkluderer hjerneslag, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, cerebral parese, muskeldystrofi, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Batten sykdom, hode og nakke kreft, for tidlig fødsel, og avansert aldring. Dysfagi er sterkt korrelert med dødelighet, typisk som følge av alvorlig underernæring eller lungebetennelse som oppstår når bakterier-laden mat / væske / spytt ned i lungene 1-4. Denne ødeleggende og livstruende medisinsk tilstand påvirker over 15 millioner mennesker hvert år i USA alene tre. Til tross for den høye forekomsten og tilhørende negative resultater, er dagens behandlingstilbud for dysfagi begrenset til palliativ (snarere enn kurativ) tilnærminger, som kosthold modifikasjon (for eksempel unngå spesifikke mat / flytende konsistenser), postural endringer (f.eks TUCKIng haken ved svelging), motor tilnærminger (f.eks øvelser rettet mot musklene i munnhulen, svelget og strupehode), sensoriske tilnærminger (f.eks implementere smak, temperatur, og / eller mekanisk stimulering), og tube fôring (f.eks ernæring og hydrering administreres via nasogastrisk (NG) tube eller perkutan endoskopisk gastrostomi (PEG) tube). Disse behandlingene bare tjene som symptomatisk behandling i stedet rettet mot de underliggende årsakene til problemet. Faktisk, en stor hindring for oppdagelsen av nye, effektive behandlinger for dysfagi er begrenset vitenskapelig kunnskap om de ansvarlige patologiske mekanismer, som trolig forskjellig for hver sykdom.
Dysfagi diagnose er hovedsakelig gjort ved hjelp av en radiografisk prosedyre som kalles en videofluoroscopic svelge studie (VFSS), også kjent som en modifisert barium svelge studien. I løpet av de siste 30 årene eller så har denne diagnostiske testen blitt regnet som gullstandard for evaluating svelge funksjon 5-7. Denne test innebærer at pasientens sitte eller stå i veien for røntgenstråle med en gjennomlysning maskinen mens frivillig inntak av mat og flytende konsistens blandet med en oral-kontrastmiddel, typisk bariumsulfat 8,9 eller iohexol 10. Når pasienten svelger, kan mat og væske som inneholder kontrastmiddel ses i sanntid via en dataskjerm mens du reiser fra munnen til magen. Myke vev strukturer også er synlige, og kan vurderes i forhold til struktur og funksjon. Pasientene blir bedt om å utføre flere svalene av hver mat og flytende konsistens, som alle er video spilt for senere visning og bilde-for-bilde-analyse for å kvantifisere tilstedeværelse og grad av dysfagi. Mange fysiologiske komponentene til å svelge er vanligvis analysert, slik som den anatomiske triggerpunkt av svelg svelge, bolus transitt tid gjennom svelget og spiserøret, omfang og varighet av laryngeal høyde, plassering og mengde etter svelg rest, og forekomsten av og fysiologisk grunn for aspirasjon 7,11.
Aspekter ved den menneskelige VFSS protokollen ble nylig tilpasset for å studere fritt oppfører rotter; Men resultatene var begrenset fordi rottene ikke forbli i videofluoroscopic synsfelt under testing 12. VFSS har ikke tidligere vært forsøkt med mus. Vellykket tilpasning av den humane VFSS protokoll for bruk med mus og rotter ville tilveiebringe en ny metode for forskning for å undersøke de hundrevis av for tiden eksisterende modeller av sykdommer som er kjent for å forårsake dysfagi hos mennesker murine (mus og rotter). Denne nye fremgangsmåten (heretter referert til som murine VFSS) vil derfor påskynde identifisering og validering av murine modeller av dysfagi som er egnet for undersøkelse av den underliggende nevrofysiologiske mekanismer i muskler, nerver, og hjernevev som er patologisk og bidra til dysfagi in mennesker. Videre ville murine VFSS tillate identifisering av objektive mål (biomarkører) av svelge funksjon / dysfunksjon som kan sammenlignes direkte med mennesker. Disse kryssarts videofluoroscopic biomarkører kan da fungere som nye utfallsmål å kvantifisere behandlingseffekten i prekliniske studier med mus og rotter, noe som ville bedre sette til kliniske forsøk med mennesker.
For dette formål ble det murine VFSS protokoll etablert ved hjelp av ~ 100 mus av begge kjønn. Alle musene var enten C57 eller hybrid C57 / SJL stammer. Den C57-mus ble ikke genetisk forandret, mens C57 / SJL var bakgrunnen stamme for en koloni av transgen SOD1-G93A (eller SOD1) mus, den mest brukte dyremodell av ALS. Den SOD1 kolonien var en omtrentlig 50-50 blanding av transgen (dvs. ALS-rammede) mus og ikke-transgen (dvs. upåvirket) kullsøsken.
Muse VFSS protokollen består av tre komponenter:
- Oppskrifter som skjuler motvilje smak / lukt av agenter muntlige kontrast og produserer tilstrekkelig radiodensity å sikre tilstrekkelig visualisering av å svelge,
- En trinn-for-trinn testprotokoll som maksimerer dyr compliance, minimerer total testtid og stråling, og tillater kvantifisering av flere svelge parametere for hvert trinn av svelge (dvs. oral, svelget og spiserøret).
Den kombinerte effekten gir en komfortabel, lav stress, selv fôring undersøkelse miljø som tillater vurdering av typiske fôring og svelger atferd av mus.
Protocol
Muse VFSS protokollen følger en godkjent Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) protokoll og NIH retningslinjer.
1. Konstruer Observasjons Chambers fra polykarbonat Tubing og sheeting (figur 1)
- Skjær 5 cm bredt, firkantet polykarbonat rør (~ 2 mm veggtykkelse) i 16 cm lengder ved hjelp av en manuell fresemaskin. De fleste mus passe tilstrekkelig innenfor disse dimensjonene, noe som resulterer i en smal testkammer som tillater gange og snu rundt som ønsket. En veggtykkelse på ~ 2 mm gir tilstrekkelig stivhet uten vesentlig svekking av røntgenstråle.
- To typer kamre er avgjørende for denne protokollen: "tut rør", designet for å levere væsker via tuten, og "ventilasjon rør", designet for å levere væsker via peg-bolle.
- For "tut rør", lage en liten avlang hull (12 x 8 mm) i toppen av hvert rør nær den ene enden ved hjelp av en manuell fresing machine. Dette hullet blir brukt til å levere drikkevann løsninger via en sipper tube tut under atferds condition og VFSS testing.
- For "ventilasjon rør", bore ni små ventilasjonshull i toppen av hvert rør nær den ene enden. Dette røret brukes under VFSS testing med en pinne-bolle i stedet for sipper tube.
- Det er mulig å bruke tut rør ved levering av væske via peg-bolle; må imidlertid åpningen i kammertaket være blokkert for å hindre forstyrrende utforsk oppførsel av mus (se trinn 6.2.2).
- To typer kamre er avgjørende for denne protokollen: "tut rør", designet for å levere væsker via tuten, og "ventilasjon rør", designet for å levere væsker via peg-bolle.
- Snitt polykarbonatplater (3/4 "tykkelse) i endedekslene (50 x 50 mm, 2 per rør) ved hjelp av en datastyrt fresemaskin, også kalt en datastyrt numerisk kontroll (CNC) maskin.
- Mill en avlang fjær (19 x 6 mm) i nærheten av en kant av den indre flate av hvert endedeksel. Bruk dette sporet for å sikre en pinne-skål for mus å drikke fra under VFSS testing.
- Mill fem runde ventilasjonshull (6 mm diameter) Ved hver endehette.
- Mill en mindre runde hull (5 mm diameter) gjennom endehetten, direkte over den avlange spor. Bruk av dette hullet for å levere væske inn i pinne-bollen under VFSS testing.
- På yttersiden av slutt cap, en 9/16 "diameter forsenkning som er 1/4" mill dyp rundt dette mindre hullet.
- Mill bort 2 mm langs omkretsen av den indre flate av endefestet til en dybde på 7 mm for å gjøre et trinn som lett setter inn i enden av røret.
- Mill en 1 mm spor inn i trinnet med endelokket for å få plass til en O-ring, som er nødvendig for å hindre at endelokket faller ned fra enden av røret.
- Rund av utsatte kanter og skrå alle hjørner av de endestykker for å unngå tygging av mus.
- Gjør peg-boller fra polykarbonat plater ved hjelp av en CNC maskin. Totale dimensjoner skal være 24 x 19 x 6 mm 3, med en 10 x 3 mm 2 skål-form depresjon i den ene enden. En pinne-bollen er needed for hvert rør. Peg-boller bør sette inn godt inn i avlange sporet i sluttstykker (figur 2).
Fig. 1: Observasjon Chambers Observasjons kamrene er utformet for å opprettholde fritt oppfører dyr i gjennomlysning synsfelt. Disse bildene viser kammer komponenter avgjørende for å gjennomføre VFSS. Top: "tut tube", designet for å levere væsker via tut. Bunn: "ventilasjon tube", designet for å levere væsker via peg-bolle. De to endestykker er utskiftbare mellom tut og ventilasjonsrørene.
Fig. 2: peg-skåler Hver pinne-skål smekker inn i et spor i den indre flate av hvert endedeksel. Venstre:umontert komponenter. Middel: sammensatte komponenter. Høyre:. Yttersiden av end-cap Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. Construct Sipper Tube Flasker fra sentrifugerør, Silikon Propper, og Metall tuter (figur 3)
- Bruk en propp borer (5/16 ") for å lage et senter hull gjennom hver silikonpropp.
- Anvende noen få dråper mineralolje inn i borehullet, og manuelt sette inn et metallutløp i den vide ende av proppen. Rette kule tuter er foretrukket fordi rette åpen ende tuter resultere i overdreven lekkasje og sprut av kontrastmidlet i løpet av observasjonskammeret, som kan interferere med visualisering under testing.
- Juster tuten lengde slik at den strekker seg over hele lengden av silikonpropp og strekker seg omtrent 3 cm over den brede enden av stopperen.
- Sett den smale ende av hver propp (inneholdende en sipper rør) i et 30 ml sentrifugerør.
- Kontroller at tuten lengde er tilstrekkelig ved å sette den inn i avlange hull i toppen av observasjonskammeret. Tutens spiss bør ligge omtrent 1 cm fra kammerets tak, som er tilstrekkelig lang for friske, voksne mus å nå.
MERK: Lengre lengder resultere i mus drikking mens du slår / vippe hodet, som tilslører visualisering av svelge under VFSS. - Forlenge tuten lengde for å imøtekomme yngre mus, mindre størrelse musestammer og mus sykdomsmodeller som ikke kan nå tuten på grunn av motor svekkelse av lemmer.
- Vask de nylig gjort tuter før bruk for å fjerne mineralolje, silikonrester, og andre forurensninger under håndtering.
Figur 3: Sipper. Tube Flasker Venstre: umontert komponenter. Middel: sammensatte komponenter. Høyre:. Mus drikking fra sipper rør i observasjonskammeret Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Konstruer en sprøyte Delivery System for bruk med Peg-boller (figur 4)
- Bruk en dreiebenk for å gjøre adaptere for tilkobling av polyetylen (PE) slange til observasjon kammerendestykker, beskrevet som følger.
- Skjær 1/2 "diameter acetal resin stang materiale i en 1/4" lengde seksjoner, her referert til som tube adaptere (eller adaptere).
- I den ene enden av hver adapter, reduserer en 1/2 "lengde delen på spissen til 3/16" diameter, her referert til som den smale ende.
- For de resterende 3/4 "lengde delen av hver adapter (dvs. 1/2" diameter slutten), maskin spor for manuell gripende under osse. Denne delen er heri referert til som den vide enden.
- I den brede enden av hver adapter, bore et senter hull som er 0,098 "diameter og en" dyp.
- Drill og rømme den resterende delen av hullet i midten i hver adapter til 0,096 "å gi en tettsittende passform på PE rør.
- Kutt PE rør (PE 240, indre diameter 1,67 mm) til ønsket lengde ved hjelp av en saks. En 3-4 fot lengde øker tilstrekkelig avstand mellom etterforsker og fluoroscope under VFSS testing for å forbedre strålingssikkerhet.
NOTE: større lengder vil benytte et større volum av kontrastmiddeloppløsningen under VFSS testing, kanskje større enn den standard 30 ml oppskrift. - Sett en stump spiss 15 G nål helt inn i en ende av PE-rør. Beslaget skal være tettsittende.
- Sett den andre (gratis) enden av PE rør gjennom senterhullet av adapterrøret, som starter på than brede enden.
- Trekk PE røret ut av den smale ende av adapteren, slik at den strekker seg ~ 2 mm.
- Sett den smale enden av adapteren (med ~ 2 mm PE-rør som strekker seg fra den) inn i endehetten av en observasjon rør; det bør passe godt inn i motsatt båret hull ligger rett ovenfor den pinne-bollen.
- Juster PE rørlengde ved den smale enden av adapteren, slik at den knapt rager over bollen forsenkning i peg-skål.
- Fyll en 10 ml sprøyte (uten kanyle) med vann fra et beger og fjerne eventuelle luftbobler.
- Fester den fylte sprøyten med nålen ende av PE-rør.
- Sakte presse sprøytestemplet til å levere vann inn i pinne-bollen i observasjonskammeret. Stopp når peg-bollen er nesten full. Unngå overfylling, noe som vil føre til sprut under drikking.
- Dersom peg-bollen ikke fylles på riktig måte, justerer lengden av PE-rør som strekker seg over peg-skål.
- Over-forlengelse av PEtubing vil lokke mus å tygge på det under testing, snarere enn å drikke fra peg-bollen.
- Dersom PE slangen ikke er forlenget langt nok, vil væsken løpe ut på gulvet i observasjonskammeret i stedet for fylling av peg-skål.
- Etter bruk, ta sprøyten og vaske hele leveransen sprøytesystem med såpe og vann. Bruke en 10 ml sprøyte til å presse luft gjennom PE-rør for å fjerne vann. Steriliser ved autoklavering etter behov.
Figur 4:. Sprøyte Delivery System Venstre: umontert komponenter. Middel: sammensatte komponenter. Høyre:. Mus drikking fra peg-bolle i observasjonskammeret Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Konstruer en Motorisert Scisseller Løft Tabell for Remote Plassering av Observation Chamber (Figur 5)
- Bygge en sakselift med en 12 x 12 cm plattform som kan heves og senkes med 5 cm for å få plass til visning mus i ulike stillinger i gjennomlysning synsfelt. Heismaterialet bør være av metall eller plast for å lette rensing av med desinfeksjonsmidler.
- Mount trinnmotorene til å justere høyden og lengdestilling av heisen.
- Par første stepper motor til sakselift mekanisme for å kontrollere høyden ved å oversette en tverrliggeren. Denne koblingen kan være en ledeskrue eller rack-and-pinion gearing.
- Par den andre trinnmotoren til sakseløfterammen for å styre den langsgående stilling ved å oversette hele løfterammen i forhold til bordet. Denne koblingen kan være en ledeskrue eller rack-and-pinion gearing.
- Koble en fjernkontroll system til de stepper motorer å tillate justering av observasjonskammeret posisjon under bildebehandling samtidig minimere undersokelsertor eksponering for stråling.
- Grensesnitt håndholdt knappene på fjernkontrollen med en microcontroller chip for å kontrollere aktivering og retning av hver stepper motor.
Figur 5:. Fjernstyrt Scissor Lift Tabell Venstre: side-visning av sakselift tabellen. Høyre: lift bord med observasjonskammeret plassert i fluoroscope. Heisen tabellen justerer posisjonen til observasjon kammeret for å opprettholde mus i synsfeltet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Utfør Behavioral Conditioning Før VFSS testing for å sikre maksimal deltakelse
- 1-2 uker før VFSS testing, lagt mus til en overnatting (12-16 timer) vann reguleringsperiode for å induseretørst, der tiden vann holdes tilbake fra hjemmet buret. Målet med vannregulering er for dyr til å være tørst, ikke dehydrert. Dyr bør være oppmerksomme og responsive. Denne varighet og tidsrommet er avgjørende for å hindre dehydrering, som kan oppstå som et resultat av to vannregulerings episoder innen en uke (dvs. en for atferdskondisjonering og en annen for VFSS testing).
- Plasser ett enkelt "tut tube" (med den ene enden stengt ved en ende-cap) på gulvet i et hjem bur inneholder frisk strø. Den lukkede ende bør være nærmest tuten åpning i kammertaket. Dette trinnet sikrer tilstrekkelig ventilasjon mens flere mus søvn krøpet i kammeret dybde over natten. Den åpne enden gjør at mus til fritt gå inn / ut av kammeret.
- Fjern annet berikelse materiale (f.eks nestlet og hytta) for å oppmuntre mus å utforske og sove i kammeret over natten (figur 6). Dette trinnet sikrer at muser akklimatisert til å være i kammeret for lange varigheter før VFSS testing.
- Gi et enkelt standard mat pellet per mus på gulvet i buret for natten spise; gir ikke vann eller andre væskekilder.
- Bruke en standard filter topp for å inneholde de mus i buret over natten, så dimensjonene av observasjonskammeret hindre en standard tråd lokket passer i buret. Oppbevar fjernet tråd lokket (inneholdende mat og vann flaske) på toppen av filter toppen for å tynge lokket og hindre mus fra å unnslippe.
- Utføre smakelighet teste følgende morgen, beskrevet som følger.
- Lag en sjokolade-flavored testløsning i en 30 ml sipper tube flaske, uten å legge kontrastmiddel (dvs. erstatning vann for iohexol). Denne oppskrift er beskrevet i tabell 1. Gjør en flaske per bur som skal testes.
- Fjern observasjonskammeret og erstatte standard ledning lokket. Tilby sjokolade-flavoredløsning (romtemperatur, ~ 22 ° C) i 2 min per bur, satt inn gjennom ledningen lokket.
- Vurdere smaken ved å observere drikking atferd i løpet av 2 min testperiode.
- Resultat smakelighet etter følgende kriterier:
- Ventetid før de første muse drinker på tuten i minst 5 sek uten avbrudd.
- Prosent av mus per bur som drikker løsningen.
- Antall mus som samtidig drikke på tuten.
- Oppløsningen anses akseptabel dersom flertallet av mus i hvert bur har flere lang (> 5 s) anfall av drikking og hvis flere mus samtidig drikke fra tuten (figur 7).
- Hvis sjokolade-smakstilsatt løsning er ikke spiselig, gjentar smakstesting med andre smaksforsterkere ved forskjellige konsentrasjoner for å identifisere en enkelt foretrukket løsning.
- Tilby opp til fire forskjellige løsninger (ved ulike konsentrasjoner) en om gangeni randomisert rekkefølge til flere bur av mus i en enkelt test dag, uten en utvaskingsperiode eller utvasking løsning. Egnede smaker Forsterker for å vurdere for mus inkluderer sukker, ost, peanøttsmør, diverse frukt og nøtter smaker, og melk.
MERK: Ikke utfør smakelighet teste mer enn en gang per uke for å unngå dehydrering fra gjentatte vannregulerings episoder. - Det kan ta flere uker for å kunne identifisere den foretrukne løsning for hver stamme av mus. Målet er å identifisere kandidat smaker som resulterer i flere lang (> 5 sek) anfall av drikking av mus umiddelbart (<30 sek) etter eksponering, ettersom disse kompetansen anses avgjørende for å oppnå vellykkede VFSS utfall.
- Etter en foretrukket smaks løsning blir identifisert, returnerer observasjonskammeret til hvert hjem bur for å fortsette atferdskondisjonering, som er beskrevet som følger.
- Feste en ende-cap til observasjonskammeret ved enden nærmestoval (tut) hull.
- Tilby mus sjokolade-smakstilsatt løsning i 2-3 timer ved å sette inn sipper røret flasken gjennom det ovale hull i toppen av kammeret. Dette trinnet sikrer at alle mus har blitt kondisjonert til å drikke dypt inne i observasjonskammeret.
- Fjerne ledningen lokket for å få plass til observasjonskammeret.
- Plasser en mat pellet per mus i buret etasje for ad libitum forbruk i løpet av testperioden.
- Dekk til buret med en standard filter toppen for å hindre mus fra å unnslippe til det gjenværende av de atferdsmessige behandlingsperiode. Oppbevar fjernet tråd lokket (inneholdende mat og vann flaske) på toppen av filter topp til veie lokket ned.
- Gi vann og mat ad libitum i hjemmet buret når atferds condition er fullført.
- Vask observasjonskammerne (rør og slutt caps) og sipper tube flasker (tuter og sentrifugerør) med såpe og vann; Steriliser ved autoklavering etter behov. Unngåved hjelp av aceton for å rense rørene som det fører en permanent uklarhet effekt som gjør røret ugjennomsiktig fremfor gjennomskinnelig.
Figur 6:. Mus Exploring Observation Chambers Mus er naturlig tilbøyelig til å søke ly i små rom. Som følge av de fritt gå inn og utforske observasjonsrøret når den er plassert i hjemburet. De fleste mus er funnet sovende i kammeret i morgen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| INGREDIENSER | Sjokolade Solution (for Palatability Testing) | Sjokolade-flavored Iohexol (for VFSS Testing) |
| 3 ml | 3 ml | |
| Iohexol (350 mg jod / ml) | 0 ml | 15 ml |
| Vann (DI eller filtrert) | Juster til 30 ml sluttvolum (27 ml) | Juster til 30 ml sluttvolum (12 ml) |
| Endelig Volume | 30 ml | 30 ml |
Tabell 1: Sjokolade-flavored Test Solution Foretrukket av C57 og C57 / SJL musestammer.
Fig. 7: Palatability Testing En indikator på smak preferanse under smakstesting er antall mus som drikker samtidig fra en enkelt tut i hjemburet. Dette bildet viser fire mus samtidig drikker en sjokolade-flavored løsning, som ble identifisert somforetrukne smaksforsterker av C57 og C57 / SJL stammer.
6. VFSS Testing Forberedelse
- Lagt mus til en overnatting vann reguleringsperiode (dvs. holde tilbake vann i 12-16 timer), som beskrevet i trinn 5 ovenfor.
- Plasser ett enkelt "ventilasjonsrør" (med den ene enden stengt ved en ende-cap) på gulvet i et hjem bur inneholder frisk strø. Den lukkede enden skal være nærmeste ventilasjonshullene i kammeret taket. Dette trinnet sikrer tilstrekkelig ventilasjon mens flere mus søvn krøpet i kammeret dybde over natten. Den åpne enden gjør at mus til fritt gå inn / ut av kammeret.
- Følgende morgen, fjern skitne observasjonskammerne fra merdene og kort skyll med vann fra springen og helt tørr i forberedelse for VFSS testing.
- Ta av og rengjør bare ett kammer om gangen for å unngå å blande opp kamre mellom bur, noe som kan føre til overdreven utforskende atferd sombetydelig forstyrre VFSS testing.
- Hvis "tut rør" brukes i stedet for "ventilasjonsrørene" for VFSS testing, sette inn et silikonpluggen i tuten åpningen av observasjonskammeret taket for å hindre utforskende atferd (figur 8).
- Merke hvert kammer (f.eks, med hjemmeburet nummer) for å hindre blanding opp.
MERK: Bruk en tørr slette markør for å merke hver renset røret før du legger den tilbake i hjemmeburet. Permanent markør bør unngås fordi det er absorbert av slangen og ikke vaskes av, selv med alkohol eller aceton.
- Forbered sjokolade-flavored iohexol løsning (eller annen spiselig løsning).
- Foreta en enkelt oppskrift (30 ml) av testoppløsningen (tabell 1) i flere merder.
- FORHOLDSREGLER FOR iohexol: Lagre uåpnet iohexol flasker ved romtemperatur, beskyttet mot lys. Bruk åpnet iohexol flasker innen 24time, som viskositet og smak kan endre seg i løpet av en dag eller så etter eksponering for luft. Alternativt fryse porsjoner av single-porsjoner (15 ml) i sentrifugerør for langtidslagring. Preparerte iohexol testløsninger må brukes i løpet av noen timer for å sikre friskhet og hindre unngåelse av mus. Administrere iohexol løsninger ved romtemperatur for å unngå confounding studien på grunn av temperatureffekter på svelge funksjon. Ikke fryse eventuelle gjenværende forberedt test løsning, som sjokolade smaken blir bitter med frysing og resulterer i unngåelse av mus.
- Forberede gjennomlysning miljø.
- Bruke et reserve (tom) målestasjon kammer og peg-bolle (eller sipper tube tut) for å bestemme optimal høyde og posisjon innenfor fluoroscope stråle som muliggjør visualisering av drikkevann i den laterale (horisontalt) plan.
- Still gjennomlysning bildefrekvens til 30 bilder per sekund; høyere (men ikke lavere) bildefrekvenser kan brukes hvis det er tilgjengelig.
- EONTROLLER som et radiopakt kalibrerings markør er hensiktsmessig plassert på fluoroscope kamera / detektor, slik at det er synlig på skjermen skjermen under hele testen. Dette trinnet er nødvendig for å muliggjøre kalibrering av lengdemåling benyttes for å kvantifisere svelge parametere.
Figur 8:. Silikon kontakt ved bruk av Peg-Boller Venstre: silikon plugg. Høyre: En silikonplugg trekkes gjennom røret sipper åpning i toppen av observasjonskammeret. Denne pluggen hindrer mus fra å bli distrahert av tuten åpningen når du bruker en pinne-bolle fremfor sipper røret under VFSS testing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
7. VFSS Testing av Mus
- Løft kammeret ut av buret og forsiktig feste 2. end-cap (med peg-bolle festet, hvis en sipper rør ikke skal brukes), være forsiktig med å klemme mus (spesielt halen).
NB: Denne tilnærmingen reduserer musens stressrespons på grunn av håndtering, noe som er spesielt viktig for mus som blir testet for første gang. - Med gjentatt testing, kan mus bli lett lokket til å gå inn i kammeret når den er plassert foran dem inne i buret, eller når de er suspendert i halen over kammeråpningen.
- Hvis du bruker en pinne-bolle, Levere løsningen via sprøyte leveringssystem er beskrevet i trinn 3 ovenfor. Dette systemet muliggjør rask og enkel påfylling av peg-bollen etter behov.
- Hvis du bruker en sipper tube flaske, setter sipper rør gjennom den ovale åpningen i toppen av observasjonskammeret. Vippe flasken, slik at tuten er rettet mot midten av kammeret.
- Justere plasseringen av observasjonskammeret (ved hjelp av fjernstyrte sakseløftebord som er beskrevet i trinn 4), slik at svelgmekanismen er synlig i synsfeltet.
- Stanse opptaket hver gang musen vender seg bort fra peg-bolle eller tut å redusere varigheten av stråling.
- Fortsette opptaket når musen går tilbake til tuten eller peg-bolle.
- Etterfyll peg-bollen etter behov.
- Slutte å teste om musa ikke drikke innen 5 min. Målet er å spille inn flere long (> 5 s) anfall av kontinuerlig drikkevann, som er typisk for de fleste mus i løpet av de første 2 minutter for testing.
- Returnere noncompliant mus til hjemmet buret (uten vann) for re-testing på et senere tidspunkt samme dag; ikke overstiger en 24-timers vann reguleringsperiode. Mus som forblir ikke-kompatibel for tre forsøk er fjernet fra studien.
- Rengjør peg-bolle (og spissen av PE rør) eller sipper tube tut med et tørt papir håndkle mellom mus.
- Rens observasjonskammeret etter behov mellom mus for å fjerne eventuelle sprutet iohexol på kammerveggene. Skyll kammeret med vann fra springen og tørr med et papirhåndkle.
- Bruk en ny pinne-bolle (eller endre sipper tube tut). Ellers kan mus bli distrahert av lukten av andre mus som drakk fra samme pinne-bolle eller sipper tube. PEG-boller og nippe-rør skal merkes for å unngå forvirring.
8. Video Analysis
- Bruk en video redigering program som tillater frame-by-frame analyse av videofluoroscopy opptakene for å kvantifisere svelge parametere av interesse (tabell 2). Identifisere minst to utdannede lesere til å analysere hver video på en blindet måte: En primær anmelder og en eller to sekundære anmeldelser.
- Primær anmelder: Vis hver video for å identifisere og analysere 3-5 lang (ca 5 sek) drikking anfall. Dette kriteriet er basert på publiserte non-radiografisk svelge studier med mus 13,14 og VFSS med rotter 12 viser at 3-5 tiltak per svelge parameter er tilstrekkelig for statistiske analyser.
- Sekundære lesere: Uavhengig analysere 3-5 tiltak per svelge parameter for hver mus som ble først identifisert og analysert av primær anmelder.
- Identifisere anmeldelse avvik for hver mus. Re-analysere alle avvik som en anmelder gruppe å nå 100% konsensus.
- Snitt de 3-5 konsensus (dvs. ubestridt) verdier for hver svelge parameter for å oppnå en middelverdi for hver mus for bruk i statistiske analyser. Når færre enn tre Måltes oppnås for en enkelt svelge parameter for en gitt mus, skriv en manglende verdi (dvs. ikke null) i den statistiske data base for tilsvarende svelge parameter.
| Swallow PARAMETRE | BESKRIVELSE |
| Inter-Swallow intervall (ISI) | Antallet video rammer mellom to påfølgende, uforstyrret svalene. Starten ramme for beregning av ISI er "resten frame" som umiddelbart forut synlig overføring av bolus fra valleculae til spiserøret. Slutten ramme er "resten ramme" av neste svelge. Antall rammer mellom de to påfølgende svalene er så delt på 30 bilder per sekund (fps) for å konvertere til tid (sek). |
| Kjeve Excursion Rate (Lick Ranger Equivalent) | Tungen er ikke klartsynlig under VFSS å tillate kvantifisering av slikke rate; er imidlertid kjeve utflukt sats lett kvantifiserbare. Under king må kjeven åpnes for å tillate fjæren å stikke frem fra munnen. Derfor, mens drikking er antall kjeve åpne / lukke (utflukt) sykluser per sekund (30 rammer) tilsvarer slikke rate. Hver kjeve ekskursjon syklus begynner med kjeven maksimalt åpnet (som faller sammen med tungen fremspring), og avsluttes når kjeven tilbake til maksimalt åpen stilling. Påfølgende sykluser av kjeven lukking og gjenåpning regnes som individuelle kjeve ekskursjon episoder. |
| Kjeve Excursion Avstand | Avstanden kjeven åpnes under kjeveutflukts sykluser, måle i mm mellom overkjevens og underkjevens fortenner. |
| Lick-Swallow Ratio | Antallet kjeve ekskursjon sykluser som opptrer under hver ISI (dvs. mellom to på hverandre følgende, uforstyrret svelger). |
| Swallow Valuta | Antallet svalene oppstår under hvert 2 sek episode av uavbrutt drikking på tuten. |
| Svelget Transit Tid (PTT) | Tiden det tar bolusen skal svelges gjennom svelget. Starten rammen er identisk med ISI start ramme (dvs. "resten frame" som umiddelbart forut synlig overføring av bolus fra valleculae). Slutten ramme er når halen av bolus er helt passert 2. nakkevirvel (K2), som er den mest åpenbare anatomiske landemerke i cervicalcolumna av musen. Antall rammer mellom start- og slutt rammer er så delt på 30 fps og konvertert til millisekunder (ms). |
| Bolus Fart gjennom Pharynx | Svelget bolus hastighet måles i forhold til TOS (beskrevet ovenfor). Ved hjelp ImageJ programvare, er avstanden (mm) fra valleculae til C2 vertebra målt, skalert ved hjelp av en kalibrerings markør. Dette distance (mm) blir deretter dividert med PTT (msek) å bestemme bolus hastighet (mm / msek). |
| Esophageal Transit Tid (ETT) | Den ETT start rammen er identisk med PTT end ramme (beskrevet ovenfor). Den ETT enderamme er når kapselen er helt kommet inn i magen, som er definert som den forsvinning av kapselen fra spiserøret. Antall rammer mellom ETT start- og slutt rammer er så delt på 30 fps og konvertert til msek. |
| Bolus Fart gjennom spiserør | Esophageal bolus hastighet måles i forhold til ETT (beskrevet ovenfor). Ved hjelp ImageJ programvare, er avstanden (mm) målt fra C2 vertebra til gastroøsofageal krysset, skalert bruker kalibrerings markør. Denne avstanden (mm) blir deretter delt på ETT (msek) å bestemme bolus hastighet (mm / msek). |
| Bolus Fart gjennom svelg og spiserør | Denne parameteren brukes når C2 er ikke en lett synlig anatomisk landemerke; dermeddet er ikke mulig å skille mellom svelg og spiserør stadier av svelge. I slike tilfeller er bolus fart gjennom svelget og strupehode kombinert i en enkelt svelge parameter. Starten rammen er identisk med PTT start ramme (dvs. "resten frame" som umiddelbart forut synlig overføring av bolus fra valleculae). Den enderamme er identisk med ETT enderamme (dvs. når kapselen er fullstendig angitt i magesekken). Antall rammer mellom disse to hendelsene er delt på 30 fps og konvertert til msek. |
| Bolus området | Ved hjelp ImageJ programvare, er bolus område målt ved vallecular "resten frame" før oppstart av svelg svelge, skalert ved hjelp av en kalibrerings markør. |
| Svelget Residue området | Svelget rest området måles ved hjelp ImageJ programvare, skalert ved hjelp av en kalibrerings markør. |
| Volum av væske consuMed | Volumet av væske som forbrukes fra en sipper rør flasken er vanskelig å beregne på grunn av lekkasje fra tuten. Imidlertid kan væskevolumet som forbrukes av en pinne-skål bli mer nøyaktig beregnes som følger: 1) bestemme tettheten (dvs. forholdet av vekt til volum) av det kalibrerte volum av væske som ble administrert inn i pinne-skål, 2 ) bestemme vekten av peg-skål inneholdende den resterende væske, 3) inn disse verdier i en vekt til volum omformer (f.eks http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php . |
Tabell 2: Swallow Parametere kvantifiserbar Under murine VFSS.
Representative Results
Vi har nå utviklet en ny og replikerbart murine spesifikke VFSS protokoll som inkluderer test kamre som tillater selv fôring, oppskrifter for smaksstoffer muntlige kontrast og en steg-for-steg testprotokoll som tillater kvantifisering av svelge fysiologi. Energinivået evne til gjennomlysning system bestemt hvilke svelge parametere kan bli undersøkt hos mus. Vi opprinnelig brukt høye energi fluoroscopes designet for bruk med mennesker og større dyr (f.eks GE Advantx, GE OEC 9600, og Omega Cardiac Cath CS-25, hver med 30 bilder per sekund). Men disse systemer har hatt utilstrekkelig forstørrelse evner for testing av mus, noe som resulterte i dyret fylling bare en liten del av synsfeltet (Figur 9). Som et resultat av bildekvaliteten var usedvanlig dårlig, hvilket gjør det umulig å visualisere de fleste strukturer av svelgemekanismen. Til tross for denne begrensningen, identifiserte vi syv mål VFSS svelge parametere som var konsekvent kvantifiserbare i mus ved bruk av et konvensjonelt (dvs. høy energi) fluoroscope i kombinasjon med den nye murine VFSS protokoll (tabell 3). I tillegg identifiserte vi vallecular plass som den anatomiske triggerpunkt for å svelge hos friske voksne mus (3-17 måneders alder), samt mus med forholdene i høy alder (> 18 måneder) og end-stage ALS.
Figur 9:. High Energy gjennomlysning Systems Venstre: Representant bilde av en mus innhentet ved hjelp av høy energi (dvs. konvensjonelle) fluoroskopiprosedyrer systemer. Legg merke til at musen fyller bare en liten del av den gjennomlysning synsfelt, for derved å demonstrere den manglende evnen til forstørrelse av konvensjonelle fluoroscopes for avbildnings gnagere. Høyre: Samme bilde forstørret post-capture å bruke et videoredigeringsprogram. Svart pil: svelge triggerpunkt (valleculae). Hvit pil:. Bolus i distal spiserøret, umiddelbart før passerer gjennom GE krysset (hvit stjerne) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Swallow PARAMETRE | High Energy System | Low Energy System |
| Inter-Swallow intervall (ISI) | X | X |
| Kjeve Excursion Rate (Lick Ranger Equivalent) | X | X |
| Kjeve Excursion Avstand | X | X |
| Lick-Swallow Ratio | X | X |
| Swallow Valuta | X | X |
| PharyngEAL Transit Tid (PTT) | X | |
| Bolus Fart gjennom Pharynx | X | |
| Esophageal Transit Tid (ETT) | X | |
| Bolus Fart gjennom spiserør | X | |
| Bolus Fart gjennom svelg og spiserør | X | X |
| Bolus området | X | |
| Svelget Residue området | X | |
| Volum av væske Konsumert | X | X |
Tabell 3: Swallow Parametere kvantifiserbar bruker høye Versus Low Energy gjennomlysning Systems.
Vi har nylig fått en lav energi forstørrelse gjennomlysning system kalt The LabScope (Glenbrook Technologies, Randolph, NJ) som ble utviklet spesielt for vår lab for bruk medmus og andre smågnagere (figur 10). Imidlertid er markert større forstørrelsesnivåer av dette systemet gjengitt det umulig å se hele svelgemekanismen av en mus i et enkelt synsfelt. I stedet er to testposisjoner nødvendig, som vist i figur 11. Posisjon 1 tillater visualisering av hele hodet og proksimal thorax-regionen. Denne stillingen er nødvendig for å vurdere de muntlige og svelget stadier av svelge. Posisjon to tillatelser visualisering fra svalen triggerpunkt (dvs. valleculae) til gastroøsofageal (GE) krysset. Denne stilling er nødvendig for å vurdere esophageal trinn svelge. Forarbeid hjelp The LabScope i kombinasjon med den nye muse VFSS protokollen har identifisert 13 objektive svelge parametere som er konsekvent målbar hos mus, noe som er nesten dobbelt så mange fått hjelp av høy energi (dvs. konvensjonelle) fluoroscopes (Tabell 3). Dette o utcome er knyttet til de avanserte forstørrelses mulighetene i The LabScope, som gjør det mulig for visualisering av mange anatomiske strukturer (Figur 12) som var i hovedsak usynlig ved bruk av konvensjonelle systemer: f.eks hyoid bein, luftrøret, og halsvirvler. Som et resultat, vi også var i stand til å analysere videoene etter bevis for strupe penetrasjon og aspirasjon. Verken penetrering eller aspirasjon ble observert for en hvilken som helst mus i denne studien, uavhengig av helsemessige eller sykdomstilstander.
Figur 10:. Den LabScope Venstre: The LabScope utfører som en stasjonær fluoroscope for små dyr. Høyre: Nærbilde av The LabScope med merkede komponenter. Den sakselift tabellen posisjonerer en observasjon kammer innenfor fluoroscope synsfelt. tp_upload / 52319 / 52319fig10highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11:. Low Energy Gjennomlysning System Bilder av en mus innhentet ved hjelp av en lav energi gjennomlysning system. Legg merke til at høy forstørrelse evne hindrer visualisering av hele svelgmekanismen i gjennomlysning synsfelt. Venstre: Posisjon 1 - tillater visualisering av hele hodet og proksimale thorax-regionen. Svalen triggerpunkt (svart pil) er i hovedsak sentrert innenfor synsfeltet. Høyre: Posisjon 2 - tillatelser visualisering fra svalen triggerpunkt (svart pil) til GE krysset (hvit stjerne). Legg merke til bolus som passerer gjennom den distale øsofagus (hvit pil). g11highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12:. Anatomiske strukturer Synlig Ved hjelp av et Low Energy Gjennomlysning System Selv på laveste forstørrelse innstillingen (til venstre), Boney strukturer i hodet og halsen av en mus er lett synlig ved hjelp av vår lavenergi gjennomlysning system (dvs. The LabScope). Anatomiske strukturer i svart firkant er vist (og merket) ved høyere forstørrelse til høyre. Forbedret visualisering av Boney strukturer tillater kvantifisering av flere andre svelge parametere som var umulig å analysere ved hjelp av høye energi fluoroscopes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13:. Foreløpige funn Denne figuren viser representative foreløpige funn for to VFSS svelge parametere tallfestet ved hjelp av muse VFSS protokoll: svelge rate (til venstre) og inter-svelge intervall (til høyre). Svelge var betraktelig lavere for SOD1 mus i forhold til alderen C57-mus og kontroller. Ingen signifikante gruppeforskjeller ble identifisert for inter-svelge interval. Linjer på toppen av stolpene indikerer statistisk signifikante forskjeller (p <0,05) mellom grupper, identifisert ved hjelp av Bonferroni parvise sammenligninger. Feilfelt representerer ± 1 SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Hundrevis av murine (mus og rotter) modeller er kommersielt tilgjengelig for å studere menneskelige sykdommer. Imidlertid har bare tre murine sykdomsmodeller blitt spesielt undersøkt i forhold til dysfagi: en mus modell av ALS 13,14 og rottemodeller av Parkinsons sykdom 12,15-17 og hjerneslag 18. Hver av disse foreløpige studier benyttet ulike metoder for å vurdere dysfagi, rendering det umulig å utlede meningsfulle sammenligninger mellom arter og sykdommer. Denne store begrensningen kan overvinne i fremtidige studier ved å utnytte den nyutviklede murine VFSS protokoll som tillater objektiv kvantifisering av mange svelge parametere i selv mate dyr.
Vellykket VFSS utfall er avhengig av tre kritiske komponenter: 1) test kamre som tillater selv fôring mens du står uhemmet i et trangt rom, 2) oppskrifter som skjuler motvilje smak / lukt av kommersielt tilgjengelig oral kontrast agentene, og 3) en steg-for-steg testprotokoll som tillater kvantifisering av svelge fysiologi. Den kombinerte effekten gir en komfortabel, lav stress, selv fôring undersøkelse miljø som fremkaller typisk fôring og svelger atferd. Eliminering av ett eller flere av disse komponenter vil ha en skadelig innvirkning på forsøksresultatene. Eksempler på negative utfall inkluderer manglende evne til å opprettholde dyr i gjennomlysning synsfelt, uønskede atferd som distraherer fra drikking, aversjon mot den muntlige kontrastmiddel, og manglende evne til å kvantifisere svelge parametere på grunn av utilstrekkelige drikking episoder.
En stor utfordring i å skaffe optimale VFSS utfall var å designe en passende testkammer. Mange revisjoner av vår prototype utforming kulminerte i en observasjon kammer som i tilstrekkelig grad opprettholder mus i synsfeltet og hindrer atferd som distraherer fra drikking. Kamrene ble gjort ved hjelp av fresemaskiner for å oppnå ensartede dimensjoner på the rør og endestykker, og dermed sikre interchangeability av komponenter for flere observasjons kamre med samme diameter. De indre dimensjoner (diameter og lengde) ble tilpasset for å være litt større enn en voksen mus kroppsstørrelse, noe som resulterte i en smal testkammer som i tilstrekkelig grad tillater å gå i en rett linje og snu seg. Den smale utforming, i kombinasjon med strategisk plassering av helletuten og peg-skål bare enden, opprettholder hodet og kroppen hos mus er innrettet langs lengden av kammeret når man drikker. Når engasjert i å drikke, mus forblir bemerkelsesverdig selv-stabilisert seg på tuten eller bolle i noen sekunder av gangen, hvilket resulterer i minimal bevegelsesartefakter å forstyrre testing. Dermed er det mulig å få forvrengning, nærbilde observasjon / video-opptak og videofluoroscopic avbildning av mus mens du drikker i laterale og rygg-ventral flyene.
Mus (og andre smågnagere) er naturlig å sek ly i små rom. Som følge av de fritt gå inn i testkammeret (med den ene ende allerede lukket med en endehette) når den er plassert i hjemburet, og derved eliminere stress / angst forårsaket av håndtering (dvs. manuelt rørt at dyret plasseres i kammeret). Når mus kommer inn i kammeret, er den andre ende er lukket ved å feste en 2. endedeksel. Denne utformingen hindrer flukt mens du oppretter en lav angst testkammer for mus å fritt utforske.
Den firkantede formen av kammeret gir innebygd i bevegelse stabilitet som tillater den å bli brukt i en frittstående måte, og dermed eliminere behovet for testing i en standard gnager bur. Hele apparatet er lett, bærbar, kan stables for lagringsformål, solide, lett å rengjøre, og kan autoklaveres. Mens kamrene ble opprinnelig utviklet for bruk med gjennomlysning, de også er kompatible med spot-film radiografi, neuroimaging (f.eks, MR, PET, CT), og visual observasjon / videoopptak av ulike atferd.
En annen stor utfordring å overvinne var maske motvilje smak / lukt av muntlige kontrastmidler (dvs. bariumsulfat og iohexol). Gitt at smaken følsomhet varierer blant musestammer 19-21 og kanskje med alderen 22,23, var det nødvendig å identifisere en enkelt test-løsning som var akseptabel for alle mus, uavhengig av belastning og alder. Dette resultatet er viktig å tillate direkte sammenligninger av svelge funksjon / dysfunksjon tvers stammer og aldre, mens de eliminerer konfunderende resultater på grunn av forskjeller i reologisk (f.eks, viskositet, tetthet, etc.) og kjemiske egenskapene til testløsninger. For dette formål er det utviklet en enkel, rask smaks screening tilnærming for å identifisere foretrukne smaksforsterker for å maskere motvilje smak / lukt av orale kontrastmidler under murine VFSS. Metoder ble modellert etter den korte eksponeringstesten, noe som krever en slikkmeter i henhold (dvs. slikke sensor) for å spille inn slikke priser under den første 2 min etter en vannreguleringsperiode (dvs. kilde vann over natten) for å indusere tørst 24,25. En lickometer var ikke tilgjengelig for denne studien; derfor preferanse ble vurdert av atferdsobservasjoner, samt standard video-opptak metoder for slikk hastighet som tidligere har blitt validert i vår lab 13,14. Ved hjelp av denne smaken screening tilnærming, ble sjokolade identifisert som den foretrukne smaksforsterker av C57 og C57 / SJL stammer. Nærmere bestemt, 100% av musene i hver merd lett drakk sjokoladesmak løsninger innen 30 sek eksponering, med flere mus samtidig drikking på tuten. Men tilsetning av barium resulterte i bare korte drikke anfall av de fleste mus, uavhengig av barium eller sjokolade konsentrasjon.
Et alternativ til barium er iohexol, en jod-basert kontrastmiddel som bare har nylig blitt anerkjent som en suiTabellen alternativ til bariumsulfat for menneskelig VFSS 10; dermed har det ennå ikke blitt standardisert for dette formålet. Flere ulike konsentrasjoner av sjokolade-flavored iohexol ble tilbudt til mus. Oppskrifter som inneholder opp til en 50% oppløsning av lager iohexol (350 mg jod pr ml) ble lett drakk av de fleste mus etter en natts vannreguleringsperiode. Høyere konsentrasjoner resulterte i unngåelsesatferd. En 50% iohexol (350 mg jod per ml) oppløsning produsert tilstrekkelig radiodensity mens bli slukt av mus, mens lavere konsentrasjoner var betydelig mindre synlig og hindret kvantifisering av svelge fysiologi. Derfor ble den optimale prøveløsning for VFSS med mus som er identifisert som en 50% løsning iohexol med sjokoladesmak tilsatt. Gjenta smakelighet testing resulterte ikke i unngåelsesatferd eller bivirkninger.
En tredje utfordring å overvinne ble hindre mus fra å slå / vippe hodet mens drikking, som tilslører visualiseringav svelgemekanismen under VFSS. Drikker fra en pinne-bolle plassert like over gulvet i den ene ende av kammeret løst dette problemet. Det finnes flere andre fordeler ved hjelp av en pinne-skål i stedet for et rør sipper flaske. For eksempel kan en kalibrert volum av væske bli pipettert over i peg-skålen gjennom et ventilasjonshull i endehetten av observasjonsrøret. Denne tilnærmingen muliggjør kvantifisering av det øyeblikk volumet av testoppløsning forbrukes i løpet av kort VFSS testvarighet. Videre vil den økte overflatearealet av prøveoppløsningen i peg-skål, i forhold til en liten sipper rør åpning, kan gi økt olfaktorisk stimulering for ytterligere å motivere drikking. Peg-skåler kan være bedre egnet for å studere små eller mindre strekk mus, som bollen høyde er en standardisert avstand fra gulvet. I kontrast, må nippe-tube lengder justeres for å imøtekomme forskjellig størrelse mus, som legger en potensielt konfunderende variabel å vurdere. Også, mus-modusls av nevrologiske sykdommer kan ha vansker med å oppnå en sipper tube flaske grunnet motor svekkelse av lemmer, mens de lett kan nå en knagg bolle. Mus med tungen og / eller kjeve dysfunksjon kan være ute av stand til å tilstrekkelig trykk ballen i tuten å få tilgang til væske; ved hjelp av peg-boller kan eliminere dette forvirre. Av disse grunner er bruken av PEG-skåler i løpet nippe-tube flasker den foretrukne metode for murine VFSS testing. Imidlertid ble observasjonskammerne designet for å imøtekomme tut drikking etter behov. En viktig påminnelse til vurdere er at slikke prisene er kjent for å variere mellom tut og bolle drikker 13,26. Derfor må valg av enten tut eller peg-skål for VFSS være konsekvent innenfor og mellom eksperimenter.
En fjerde utfordring var å identifisere målbare svelge parametere for mus som er sammenlignbare med de VFSS parametrene som vanligvis brukes i humane forskningsstudier og klinisk praksis. Våre foreløpige funn vistetype gjennomlysning system bestemmer hvilke svelge parametre kan undersøkes hos mus. De fleste forskningssentre og medisinske innstillinger har høy energi (75-95 kV, 1-5 mA) fluoroscopes designet for bruk sammen med mennesker og større dyr, noe som resulterer i eksepsjonelt dårlig bildekvalitet når du tester mus og andre smådyr. Som et eksempel, en fersk studie ved hjelp av en høy energi fluoroscope med rotter var i stand til å identifisere bare 4 kvantifiserbare svelge parametere 12, og vi var i stand til å identifisere bare 7 svelge parametere for mus i denne studien til stede. For å overvinne denne stor begrensning, vi nylig fått en lav energi gjennomlysning system kalt The LabScope (Glenbrook Technologies). Systemet er en miniatyr fluoroscope som genererer en kontinuerlig konisk stråle av røntgenstråler med fotonenergier mellom 15 og 40 kV og en topprøret strøm på 0,2 mA (8 W maksimal kraft). De lavere energinivå ved dette systemet er bedre svekkes av den tynne ben og mykt vev hos mus, og dermed gi higher kontrast oppløsning enn vanlig (dvs. høy energi) fluoroscopes. Røntgenstråle Den LabScope er rettet på en 5 cm diameter bildeforsterker, som er vesentlig mindre enn 15-57 cm i diameter bildeforsterker av konvensjonelle fluoroscopes. Minste kilde-til-forsterker avstand (SID) av The LabScope er ~ 6 cm (i motsetning til ~ 30 cm for konvensjonelle fluoroscopes), som gir økt forstørrelse evner. I tillegg bruker The LabScope patentert teknologi som digitalt forstørrer bildet opp til 40 ganger i sanntid, uten å endre den SID. Resultatet er i hovedsak en X-ray mikroskop som kan zoome inn og ut i sanntid for å vise små områder av interesse, for eksempel den svelger mekanisme av en mus.
En stor fordel med denne lavenergi gjennomlysning systemet er forbedret strålingssikkerhet. I tillegg til dyrene som fikk lavere stråledoser med The LabScope, er forskerne som bruker systemet utsettes for betydelig less stråling scatter. Stråling rett foran aggregatet på kontrollpanelet er 10.3 mR / t. I en avstand 1 m foran enheten, synker eksponering for 580 μR / time. De fleste andre steder i rommet har svært lav eksponering under 10 μR / time. Til tross for denne forbedringen, har vi tatt ekstra tiltak for å bedre strålingssikkerhet. For eksempel, har blitt lagt blyholdig akryl skjerming rundt The LabScope å blokkere spredte røntgen fotoner, noe som gjør forskerne å gjennomføre murine VFSS testing uten å ha personlig skjerming (f.eks bly forklær, skjoldbrusk skjold og briller). I tillegg tillater den klare akryl visualisering av mus fra en avstand. Ytterligere strålingssikkerhet er levert av en motorisert sakseløftebord, som fjernstyres av utprøver. Fra en avstand opp til 3 m fra fluoroscope, kan forskerne bruke fjernstyrt enhet for å justere den vertikale og horisontale posisjonen til observasjon kammeret i X-ray beam. Som et resultat, kan de anatomiske regioner av interesse holdes innenfor gjennomlysning synsfelt mens musen beveger seg fritt inne i observasjonskammeret. Selv om sakselift er designet for bruk med The LabScope, også er den kompatibel for bruk med konvensjonelle fluoroscopes å forbedre strålingssikkerhet for forskere. En avsluttende trinn for å forbedre strålingssikkerhet under murine VFSS innebærer bruk av et leveringssystem for å sprøyte væske. Dette systemet omfatter en 3-4 fot (eller lenger, hvis nødvendig) lengde av PE rør, som tillater rask og effektiv levering av væsker inn i pinne-bolle fra en avstand. Denne sprøyte leveringssystem for væsker, i kombinasjon med observasjonen kamre, også kan brukes med konvensjonelle fluoroscopes.
Forarbeid hjelp The LabScope, i kombinasjon med den nye muse VFSS protokollen, viser en stor fordel på over konvensjonelle systemer: antall svelge parametere som kan kvantifiseres is nesten doblet. Men bløtvev strukturer av svelgemekanismen (f.eks, tunge, velum, posterior svelget vegg, og epiglottis) av mus er ikke lett synlig når du bruker lav eller høy energi fluoroskopiprosedyrer systemer. Derfor fokuserte vi på å kvantifisere bolus strømnings tiltak i stedet for biomekanikk svelge. Vi var hovedsakelig interessert i parametre som kan bli kvantifisert basert på enheter av tid, område, avstand, volumet, etc., i stedet for å bruke Likert-type skala måler. Tallrike bolus strømningsparametre møte dette kravet har blitt beskrevet i den menneskelige VFSS litteraturen, slik som oral transittid 27-29, svelget transittiden 27 til 33, og esophageal transittid 34-36, for å nevne noen få. Bolus transport gjennom munnhulen ikke var lett synlig i mus, sannsynligvis på grunn av den lille størrelsen bolus under spontan drikking. Men vi var i stand til å pålitelig kvantifisere svelg og spiserør transittider, samtsom flere andre tiltak vedrørende bolus strøm og klaring. Identifisering av ytterligere translasjonsforskning svelge parametre forventes som vi optimalisere egenskapene til The LabScope.
Resultatene fra denne studien viste at mus ta flere rytmiske licks per svelge under spontan drikking, med hver liten flytende bolus sekvensielt fyller vallecular plass før utløser svelg svelge. Denne atferden, noe som er typisk for pattedyr som bruker slikker som den viktigste måten å inges væske 37-40, ligner den rytmiske suge-svelge mønster av menneskelig spedbarn svelger og alle baby pattedyr generelt. Spedbarn svelge fysiologi er preget av flere rytmisk suger etterfulgt av en refleksiv svelget svelge, ofte beskrevet som den suge-svelge syklus 37,41-43. Dermed kan de rytmiske tunge og kjeve bevegelser som er involvert i de inntatt slikking atferd av mus være mer sammenlign inntatt suger atferd av nynneet spedbarn snarere enn kopp å drikke av barn og voksne. Vi har derfor vært å kvantifisere slikke hastighet og slikke-svelge forhold på mus for fremtidige sammenligninger med den suge hastighet og suge-svelge forholdet mellom menneskelige spedbarn. Kanskje murine VFSS forskning vil gi innsikt i utviklingssvelgeforstyrrelser.
Som med alle nye forskningsmetode, har forbedringsområder er identifisert. For eksempel ble det murine VFSS protokoll utviklet ved hjelp av bare C57 og C57 / SJL musestammer; det har ennå ikke blitt testet med rotter. Observasjonskammerne må skaleres opp i størrelse (diameter og lengde) for å romme den større kroppsstørrelse hos rotter. Dessuten er det ukjent om sjokoladesmak iohexol er egnet som en universell murine VFSS testløsning. Derfor er større målestokk testing med flere stammer av mus og rotter berettiget for dette formål. Også, bør bruk av barium som kontrastmiddel for murine VFSS ikke utelukkes. Mus klart foretrakk iohexol oppskrifter enn barium; imidlertid strengere og systematiske forsøk på å maskere motvilje smak / lukt av barium kan gi velsmakende alternativer til iohexol. Fremtidige studier som sammenligner effekten av iohexol og bariumsulfat (samt andre potensielle agenter muntlige kontrast) på smak preferanse og svelge fysiologi hos mus og rotter ville utvilsomt gi viktig informasjon som er direkte relevant og translasjonsforskning til menneskelig VFSS.
VFSS med mennesker omfatter flere konsistenser av mat og væske, og dysfagi er mest tydelig når du svelger tynne væsker og tørre, fast føde 44,45. Muse VFSS protokollen er derfor utvides til å omfatte flere konsistenser som kan fremme deteksjon og kvantifisering av dysfagi i sykdomsmodeller. Det vil også være nødvendig å gjennomføre viskositet testing av væske oppskrifter for murine VFSS for å justere viskositet å matche de som brukes under human VFSS. Adressering disse grenseasjon vil lette identifikasjon av translasjonsforskning VFSS biomarkører av dysfagi som kan sammenlignes direkte mellom mus, rotter og mennesker.
Nytten av murine VFSS kan bli betydelig forbedret ved å implantere radioopake markører i bløtvev strukturer av svelgemekanismen som ellers ikke er synlige, og dermed tillater undersøkelser av biomekanikk svelge. Denne tilnærmingen har blitt brukt i mange år for å studere biomekanikk av å svelge i baby griser, ved hjelp av et utvalg av metallklips og ledninger 37,42. Vi forventer bruk av lignende, men mindre, markører hos mus ville tillate kvantifisering av flere andre svelge parametere for sammenligning med større pattedyr, inkludert mennesker. Vi utvikler metodikk for å implantere radioopake markører i tungen, bløte ganen, svelg, strupehode, og proksimale spiserør av mus for å teste denne hypotesen.
Videoen recording frame rate of The LabScope og konvensjonelle fluoroscopes er begrenset til 30 bilder per sekund (fps). Men våre foreløpige resultatene viste at hele svelget stadium av å svelge for sunn mus forekommer i mindre enn 66 millisekunder (dvs. to rammer), som er omtrent 10 ganger raskere enn mennesker. Dermed oppstår svelg fasen av å svelge i mus så raskt at detaljene ikke er nevneverdig med en 30 fps kamera. En høyere bildefrekvens (sannsynligvis> 100 per sekund) vil være nødvendig for i tilstrekkelig grad å visualisere og kvantifisere de ekstremt hurtige og kompliserte bevegelser av svelget stadium av svelge hos mus og andre gnagere. I forbindelse med en høyere bildefrekvens, ville innlemme biplanar teknologi for 3D gjennomlysning bildebehandling sikkert utvide nytten murine VFSS. Derfor bør fremtidige design hensyn inkluderer en høyere bildefrekvens kamera og biplanar imaging evner.
Til slutt, har lav dose stråling har vist seg å føre til sterilitet hoskvinnelige C57-mus, noe som resulterer i endrede nivåer av eggstokkene stimulert hormoner som kan skamme levetid studier 46. Utfall knyttet spesifikt til effekten av gjentatt lavdose stråling forbundet med VFSS testing har ennå ikke undersøkt hos mus, andre dyr, eller mennesker. Imidlertid har eggstokkreft dysfunksjon (ikke relatert til stråling) i menneskelige hunner vært knyttet til gastrointestinale motilitetslidelser, og spesielt til dysfagi i noen tilfeller 47, noe som gir enda en påminnelse til vurdere når du utformer fremtidige VFSS studier som inkluderer kvinner (dyr og mennesker ). Ekskludering av kvinner bør unngås, som signifikante kjønnsforskjeller i svelge funksjon er rapportert for folk 48,49 og ville være viktig å påvise og karakterisere i dyresykdomsmodeller også. Derfor resultater fra longitudinelle VFSS studier med mus og rotter av begge kjønn har enorm translasjonsforskning potensial for mennesker i forhold til dysphagia, samt risikoen for lavdose stråling forbundet med gjenta VFSS testing.
Disclosures
Open Access for denne artikkelen er sponset av Glenbrook.
Acknowledgments
Vi takker nådigst flere medlemmer av Spak Lab som har bidratt til datainnsamling (Andries Ferreira, Danarae Aleman, Alexis Mok, Kaitlin Flynn, Elizabeth Bearce, og Matan kadosh) og manuskript gjennomgang (Andries Ferreira, Rebecca Schneider, og Kate Robbins). Vi erkjenner også Roderic Schlotzhauer og Edwin Hønse fra MU Physics Machine Shop for sin design innspill og fabrikasjon av de gnager observasjons rør brukt i denne studien. Vi er spesielt takknemlig for Malea Jan Kunkel (Radiology Supervisor i veterinærmedisin og kirurgisk avdeling ved University of Missouri - College of Veterinary Medicine) og Jan Ivey (leder av Forsknings Animal Cath Lab ved University of Missouri - School of Medicine) for å demonstrere konstant tålmodighet og motivasjon når du bruker de høye energi fluoroscopes som vi utviklet muse VFSS protokollen. Finansieringskildene for denne studien inkluderte NIH / NIDCD (TE Lever), NIH / ninds (GK Pavlath), Otolaryngologi - hode- og halskirurgi oppstart midler (TE Lever), MU PRIME Fund (TE Lever), Mizzou Advantage (TE Lever), og MU Senter on Aging (TE Spak).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycarbonate tubing for observation chambers | McMaster-Carr | 3161T41 | Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall |
| Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 9115K71 | End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4" |
| Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 8574K281 | Peg-bowls for observation tubes |
| Silicone O-rings for end-caps of observation chambers | McMaster-Carr | 9396K108 | S1138 AS568-029, pack of 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r |
| Silicone stoppers for observation chambers | McMaster-Carr | 2903K22 | Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at |
| Centrifuge tubes for sipper tube bottles | Evergreen Scientific | 222-3530-G80 | 30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/ |
| Silcone stoppers for sipper tube bottles | Saint-Gobain Performance Plastics | DX263031-10 | Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack; http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS |
| Stopper borers for sipper tube bottles | Thomas Scientific | 3276G40 | Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt |
| Drinking tubes for sipper tube bottles | Ancare | TD-100 | 2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point |
| Iohexol for making oral contrast agent solution | GE Healthcare | 350 mg iodine per ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque |
|
| Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent | Herseys | ||
| 10 ml syringe for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 309604 | Luer lock tip syringe without needle, 100 per box http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp |
| Catheter tubing for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427451 | Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp |
| Needle for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427560 | 15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp |
| Delrin acetal resin rod for syringe delivery system | McMaster-Carr | 8576K15 | 1/2 inch diameter, black http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf |
| Acrylic sheeting for scissor lift | Ponoko | Laser cut http://www.ponoko.com |
|
| 3D printed ABS frame | Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri | ||
| Brass rods for scissor lift | Amazon | TTRB-03-12-03 | made into axles http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M |
| Drawer slide for scissor lift | Richelieu | 10292G116 | Attaches to base of scissor lift http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754 |
| 28BYJ-48 stepper motor for scissor lift | 2 each | ||
| ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift | Toshiba | ULN2003APG | Used as stepper drivers (2 each) |
| ATTINY85 microcontroller for scissor lift | Atmel | ATTINY85-20PU | 2 each http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html |
| Nylon spur gear | McMaster-Carr | 57655K34 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz |
| Nylon spur gear rack | McMaster-Carr | 57655K62 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9 |
| 4-40 nylon machine screws | McMaster-Carr | 95133A315 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q |
| 4-40 nylon hex nuts | McMaster-Carr | 94812A200 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29 |
| Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104 | McMaster-Carr | 9452K318 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7 |
References
- Shigemitsu, H., Afshar, K. Aspiration pneumonias: under-diagnosed and under-treated. Curr Opin Pulm Med. 13 (2), 192-198 (2007).
- Gresham, S. L. Clinical assessment and management of swallowing difficulties after stroke. Med J Aust. 153 (7), 397-399 (1990).
- Marik, P. E., Kaplan, D. Aspiration pneumonia and dysphagia in the elderly. Chest. 124 (1), 328-336 (2003).
- Marik, P. E. Pulmonary aspiration syndromes. Curr Opin Pulm Med. 17 (3), 148-154 (2011).
- Logemann, J. A., Larsen, K. Oropharyngeal dysphagia: pathophysiology and diagnosis for the anniversary issue of. Diseases of the Esophagus. Dis Esophagus. 25 (4), 299-304 (2012).
- Logemann, J. A. Swallowing disorders. Best practice & research Clinical gastroenterology. 21 (4), 563-573 (2007).
- Martin-Harris, B., Jones, B. The Videofluorographic Swallowing Study. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 19 (4), 769-785 (2008).
- Dietsch, A. M., Solomon, N. P., Steele, C. M., Pelletier, C. A. The effect of barium on perceptions of taste intensity and palatability. Dysphagia. 29 (1), 96-108 (2014).
- Stokely, S. L., Molfenter, S. M., Steele, C. M. Effects of barium concentration on oropharyngeal swallow timing measures. Dysphagia. 29 (1), 78-82 (2014).
- Harris, J. A., et al. The Use of Low-Osmolar Water-Soluble Contrast in Videofluoroscopic Swallowing Exams. Dysphagia. , (2013).
- Hillel, A., Miller, R. Bulbar Amyotrophic Lateral Sclerosis: Patterns of Progression and Clinical Management. Head & Neck. 11, 51-59 (1989).
- Russell, J. A., Ciucci, M. R., Hammer, M. J., Connor, N. P. Videofluorographic assessment of deglutitive behaviors in a rat model of aging and Parkinson disease. Dysphagia. 28 (1), 95-104 (2013).
- Lever, T. E., et al. An animal model of oral dysphagia in amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 24 (2), 180-195 (2009).
- Lever, T. E., et al. A mouse model of pharyngeal dysphagia in amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 25 (2), 112-126 (2010).
- Ciucci, M. R., et al. Tongue force and timing deficits in a rat model of Parkinson disease. Behavioural Brain Research. 222 (2), 315-320 (2011).
- Ciucci, M. R., Schaser, A. J., Russell, J. A. Exercise-induced rescue of tongue function without striatal dopamine sparing in a rat neurotoxin model of Parkinson disease. Behavioural Brain Research. 252, 239-245 (2013).
- Plowman, E. K., Kleim, J. A. Behavioral and neurophysiological correlates of striatal dopamine depletion: A rodent model of Parkinson’s disease. Journal of Communication Disorders. 44 (5), 549-556 (2011).
- Sugiyama, N., et al. A novel animal model of dysphagia following stroke. Dysphagia. 29 (1), 61-67 (2014).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Li, X., Beauchamp, G. K. Genetics of sweet taste preferences. Pure Appl Chem. 74 (7), 1135-1140 (2002).
- Ishiwatari, Y., Bachmanov, A. A. NaCl taste thresholds in 13 inbred mouse strains. Chem Senses. 37 (6), 497-508 (2012).
- Pinhas, A., et al. Strain differences in sucrose- and fructose-conditioned flavor preferences in mice. Physiol Behav. 105 (2), 451-459 (2012).
- Midkiff, E. E., Bernstein, I. L. The influence of age and experience on salt preference of the rat. Dev Psychobiol. 16 (5), 385-394 (1983).
- Niimi, K., Takahashi, E. Differences in saccharin preference and genetic alterations of the Tas1r3 gene among senescence-accelerated mouse strains and their parental AKR/J strain. Physiol Behav. , (2014).
- Weijnen, J. A. Licking behavior in the rat: measurement and situational control of licking frequency. Neurosci Biobehav Rev. 22 (6), 751-760 (1998).
- Weijnen, J. A. Lick sensors as tools in behavioral and neuroscience research. Physiol Behav. 46 (6), 923-928 (1989).
- Kobayashi, M., et al. Electrophysiological analysis of rhythmic jaw movements in the freely moving mouse. Physiol Behav. 75 (3), 377-385 (2002).
- Dantas, R., et al. Effect of swallowed bolus variables on oral and pharyngeal phases of swallowing. 258, G675-681 (1990).
- Johnsson, F., Shaw, D., Gabb, M., Dent, J., Cook, I. Influence of gravity and body position on normal oropharyngeal swallowing. American Journal of Physiology. 35 (5), G653-G658 (1995).
- Han, T. T., Paik, N. -J., Park, J. W. Quantifying swallowing function after stroke: A functional dysphagia scale based on videofluoroscopic studies. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 82 (5), 677-682 (2001).
- Molfenter, S. M., Steele, C. M. Kinematic and temporal factors associated with penetration-aspiration in swallowing liquids. Dysphagia. 29 (2), 269-276 (2014).
- Kendall, K. A., McKenzie, S., Leonard, R. J., Goncalves, M. I., Walker, A. Timing of events in normal swallowing: A videofluoroscopic study. Dysphagia. 15, 74-83 (2000).
- Choi, K. H., Ryu, J. S., Kim, M. Y., Kang, J. Y., Yoo, S. D. Kinematic analysis of dysphagia: Significant parameters of aspiration related to bolus viscosity. Dysphagia. 26, 392-398 (2011).
- Molfenter, S. M., Steele, C. M. Variation in temporal measures of swallowing: Sex and volume effects. Dysphagia. 28, 226-233 (2013).
- Alves, L. M. T., Secaf, M., Dantas, R. Effect of a bitter bolus on oral, pharyngeal, and esophageal transit of healthy subjects. Arquivos de gastroenterologia. 50 (1), 31-34 (2013).
- Dalmazo, J., Aprile, L. R. O., Dantas, R. O. Esophageal contractions, bolus transit and perception of transit after swallows of liquid and solid boluses in normal subjects. Arquivos de gastroenterologia. 49 (4), 250-254 (2012).
- Kahrilas, P. J., Dodds, W. J., Hogan, W. J. Effect of peristaltic dysfunction on esophageal volume clearance. Gastroenterology. 94 (1), 73-80 (1988).
- German, R. Z., Crompton, A. W., Levitch, L. C., Thexton, A. J. The mechanism of suckling in two species of infant mammal: Miniature pigs and long-tailed macaques. Journal of Experimental Zoology. 261 (3), 322-330 (1992).
- Herring, S. W., Scapino, R. P. Physiology of feeding in miniature pigs. Journal of Morphology. 141 (4), 427-460 (1973).
- Gordon, K. R., Herring, S. W. Activity patterns within the genioglossus during suckling in domestic dogs and pigs: Interspecific and intraspecific. Brain, Behavior, and Evolution. 30 (5-6), (1987).
- Hiiemae, K. M., Palmer, J. B. Food transport and bolus formation during complete feeding sequences on foods of different initial consistency. Dysphagia. 14 (1), 31-42 (1999).
- Thexton, A. J., Crompton, A. W., German, R. Z. EMG activity in the hyoid muscles during pig suckling. Journal of Applied Physiology. 112, 1512-1519 (2012).
- Thexton, A. J., Crompton, A. W., German, R. Z. Transition from suckling to drinking at weaning: A kinematic and electromyographic study in miniature pigs. Journal of Experimental Zoology. 280 (5), 327-343 (1998).
- Goldfield, E. C., Richardson, M. J., Lee, K. G., Margetts, S. Coordination of sucking, swallowing, and breathing and oxygen saturation during early infant breast-feeding and bottle-feeding. Pediatric Research. 60 (4), 450-455 (2006).
- Ottaviano, F. G., Linhares Filho, T. A., Andrade, H. M., Alves, P. C., Rocha, M. S. Fiberoptic endoscopy evaluation of swallowing in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Braz J Otorhinolaryngol. 79 (3), 349-353 (2013).
- Inamoto, Y., et al. The effect of bolus viscosity on laryngeal closure in swallowing: kinematic analysis using 320-row area detector CT. Dysphagia. 28 (1), 33-42 (2013).
- Spalding, J. F., Thomas, R. G., Tietjen, G. L. Los Alamos National Laboratory. Rein, S. erene , Los Alamos, N.M. (1982).
- Palomba, S., Di Cello, A., Riccio, E., Manguso, F., La Sala, G. B. Ovarian function and gastrointestinal motor activity. Minerva Endocrinol. 36 (4), 295-310 (2011).
- Alves, L. M., Cassiani Rde,, Santos, A., M, C., Dantas, R. O. Gender effect on the clinical measurement of swallowing. Arq Gastroenterol. 44 (3), 227-229 (2007).
- Logemann, J. A., Pauloski, B. R., Rademaker, A. W., Kahrilas, P. J. Oropharyngeal swallow in younger and older women: videofluoroscopic analysis. J Speech Lang Hear Res. 45 (3), 434-445 (2002).
