Summary
Denna studie framgångsrikt anpassat mänskliga videofluoroscopic svälja studien (VFSS) Metoder för användning med musmodeller sjukdoms i syfte att underlätta translationell dysfagi forskning.
Abstract
Denna studie anpassad mänsklig videofluoroscopic svälja studie (VFSS) metoder för användning med musmodeller sjukdoms i syfte att underlätta translationell dysfagi forskning. Framgångsrika utfall är beroende av tre viktiga komponenter: testkammare som tillåter självmatning medan stående ohämmad i ett trångt utrymme, recept som maskerar obehaglig smak / lukt av kommersiellt tillgängliga orala kontrastmedel och en steg-för-steg-testprotokoll som medger kvantifiering av swallow fysiologi. Eliminering av en eller flera av dessa komponenter kommer att ha en skadlig inverkan på studieresultaten. Dessutom kommer förmågan energinivån hos fluoroskopi systemet bestämma vilken svälja parametrar kan undersökas. De flesta forskningscentra har höga energi fluoroscopes utformade för användning med människor och större djur, vilket resulterar i exceptionellt dålig bildkvalitet vid provning möss och andra små gnagare. Trots denna begränsning, har vi identifierat sju VFSS-parametrar som är konsekvent kvantifierbar i mus vid användning av en hög energi fluoroskop i kombination med den nya murina VFSS protokoll. Vi fick nyligen en lågenergi genomlysning system med exceptionellt höga bildupplösning och förstoringsfunktioner som utformats för användning med möss och andra små gnagare. Förberedelser använder detta nya system, i kombination med den nya murina VFSS protokoll, har identifierat 13 svälja parametrar som är genomgående kvantifierbara hos möss, vilket är nästan dubbelt så många som erhållits med hjälp av konventionella (dvs, hög energi) fluoroscopes. Identifiering av ytterligare svälja parametrar beräknas som vi optimerar funktionerna i det nya systemet. Resultaten visar hittills nyttan av att använda en låg fluoroskopi energisystem att detektera och kvantifiera subtila förändringar i svala fysiologi som annars kan förbises när man använder hög energi fluoroscopes att undersöka musmodeller sjukdoms.
Introduction
Dysfagi (svälj nedskrivning) är ett vanligt symptom på många medicinska tillstånd som påverkar människor i alla åldrar. Exempel innefattar stroke, Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, cerebral pares, muskeldystrofi, amyotrofisk lateralskleros (ALS), Batten sjukdom, huvud- och halscancer, för tidig födsel, och avancerad åldrande. Dysfagi är starkt korrelerad med dödlighet, vanligtvis som en följd av svår undernäring eller lunginflammation som utvecklas när bakteriebemängd mat / vätska / saliv sugs in i lungorna 1-4. Denna försvagande och livshotande medicinskt tillstånd drabbar över 15 miljoner människor varje år enbart 3 i USA. Trots den höga prevalensen och tillhörande negativa utfall, är nuvarande behandlingsalternativ för dysfagi begränsad till palliativ (snarare än botande) närmar såsom kostförändringar (t.ex. undvika specifika livsmedel / flytande konsistenser), förändrad kroppshållning (t.ex. tucking hakan när man sväljer), motor metoder (t.ex. övningar riktar muskler i munhålan, svalget och struphuvudet), sensoriska metoder (t.ex. genomförande smak, temperatur och / eller mekanisk stimulering), och sondmatning (t.ex. näring och hydra administreras via nasogastrisk (NG) rör eller perkutan endoskopisk gastros (PEG) rör). Dessa behandlingar enbart fungera som symtomatisk behandling snarare än att rikta de underliggande orsakerna till problemet. Faktum ett stort hinder för upptäckten av nya, effektiva behandlingar för dysfagi är den begränsade vetenskapliga kunskapen om de ansvariga patologiska mekanismer som sannolikt olika för varje sjukdom.
Dysfagin diagnos huvudsakligen gjord med användning av en radiografisk procedur som kallas en videofluoroscopic svälja studie (VFSS), även känd som en modifierad barium swallow studie. Under de senaste 30-plus år, har detta diagnostiskt test ansetts guldstandard för evaluating svälja funktion 5-7. Detta test innebär att patienten sitta eller stå i vägen för röntgenstråle av en genomlysning maskinen medan frivilligt intag mat och flytande konsistenser blandas med en muntlig kontrastmedel, typiskt bariumsulfat 8,9 eller johexol 10. Som patienten sväljer, kan mat och vätska innehållande kontrastmedel ses i realtid via en datorskärm under resa från munnen till magsäcken. Mjukvävnadsstrukturer är också synliga och kan bedömas i förhållande till struktur och funktion. Patienterna uppmanas att utföra flera klunkar varje livsmedel och flytande konsistens, som alla är video inspelad för senare visning och bild-för-bildruta-analys för att kvantifiera förekomsten och graden av dysfagi. Många fysiologiska komponenter i svälja typiskt analyseras, såsom anatomiska brytpunkt i svalg svalan, bolus transittiden genom svalget och matstrupen, omfattning och varaktighet larynGEAL höjd, placeringen och mängden av post-swallow rest, och förekomst av och fysiologisk orsak till aspiration 7,11.
Aspekter av det mänskliga VFSS protokollet har nyligen anpassats för att studera fritt beter råttor; var dock resultaten begränsad eftersom råttorna inte kvar i videofluoroscopic synfältet under testning 12. VFSS har inte tidigare försökt med möss. Framgångsrik anpassning av människans VFSS protokollet för användning med möss och råttor skulle ge en ny forskningsmetod för att undersöka de hundratals närvarande existerande murina (mus och råtta) modeller av sjukdomar som är kända för att orsaka dysfagi hos människor. Denna nya metod (hädanefter kallat murina VFSS) skulle därför påskynda identifiering och validering av musmodeller av dysfagi som är lämpliga för att undersöka de underliggande neurofysiologiska mekanismer inom muskler, nerver och hjärnvävnad som är patologisk och bidra till dysfagi in människor. Dessutom skulle murina VFSS medge identifiering av objektiva mått (biomarkörer) av swallow funktion / dysfunktion som kan direkt jämföras med människor. Dessa kors arter videofluoroscopic biomarkörer kan sedan fungera som nya utfallsmått för att kvantifiera behandling effekt i prekliniska försök med möss och råttor, som bättre skulle översätta till kliniska prövningar med människor.
För detta ändamål har den murina VFSS protokoll som upprättades med hjälp av ~ 100 möss av något kön. Alla möss var antingen C57 eller hybrid C57 / SJL stammar. De C57 möss inte genetiskt förändrade, medan C57 / SJL var bakgrunden stam för en koloni av transgen SOD1-G93A (eller SOD1) möss, den mest använda djurmodell av ALS. Den SOD1 kolonin var en ungefärlig 50-50 blandning av transgena (dvs ALS-drabbade) möss och icke-transgena (dvs, opåverkade) kullsyskon.
Den murina VFSS protokollet består av tre delar:
- Recept som maskerar obehaglig smak / lukt av orala kontrastmedel och producera tillräckligt radiodensitet för att möjliggöra adekvat visualisering av svälj,
- En steg-för-steg-testprotokoll som maximerar djur efterlevnad, minimerar total provtid och strålning, och medger kvantifiering av flera svälja parametrar för varje skede av svälj (dvs, mun, svalg och esofagus).
Den kombinerade effekten ger en bekväm, låg stress, själv utfodring undersökning miljö som tillåter bedömning av typiska utfodring och svälj beteenden hos möss.
Protocol
Den murina VFSS protokoll följer en godkänd Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) protokoll och NIH riktlinjer.
1. Konstruera Observations Chambers från polykarbonat Slangar och Ningen (Figur 1)
- Klipp 5 cm bred, fyrkantig polykarbonat slang (~ 2 mm väggtjocklek) i 16 cm längder med hjälp av en manuell fräsmaskin. De flesta möss passar adekvat inom dessa dimensioner, vilket resulterar i en smal testkammare som tillåter promenader och vända som önskat. En väggtjocklek ~ 2 mm ger tillräcklig styvhet utan signifikant dämpning av röntgenstråle.
- Två typer av kamrarna är väsentliga för detta protokoll: "pip rör" som är konstruerade för att leverera vätskor via pipen och "ventilationsrören", konstruerade för att leverera vätskor via peg-skål.
- För "pip tuber", gör ett litet avlångt hål (12 x 8 mm) i toppen av varje rör nära ena änden med en manuell fräs machine. Detta hål används för att leverera dricksvatten lösningar via en sipper tube pip under beteendekonditionering och VFSS testning.
- För "ventilationsrören", borra nio små ventilationshålen i toppen av varje rör nära ena änden. Detta röret används under VFSS testning med en peg-skål istället för sipper röret.
- Det är möjligt att använda pip rör vid leverans vätska via peg-skål; måste dock öppningen i kammartaket blockeras för att förhindra störande undersökande beteenden från möss (se steg 6.2.2).
- Två typer av kamrarna är väsentliga för detta protokoll: "pip rör" som är konstruerade för att leverera vätskor via pipen och "ventilationsrören", konstruerade för att leverera vätskor via peg-skål.
- Klipp polykarbonat folie (3/4 "tjocklek) i slut lock (50 x 50 mm, 2 per rör) med hjälp av en datoriserad fräsmaskin, även kallad en datoriserad numerisk styrning (CNC) maskin.
- Mill en avlång skåra (19 x 6 mm) nära en kant av den inre ytan hos varje ändtätningen. Använd detta spår för att säkra en peg-skål för möss att dricka ur under VFSS testning.
- Mill 5 runda ventilationshålen (6 mm diameter) Genom varje ändkåpa.
- Mill en mindre runda hål (5 mm i diameter) genom ändhuven, direkt ovanför den avlånga spåret. Använd detta hål för att leverera vätska i peg-skål under VFSS testning.
- På den yttre ytan av ändhuven, fräsa en 9/16 "diameter försänkning som är 4/1" djup runt denna mindre hål.
- Mill bort 2 mm längs omkretsen av den inre ytan av ändhuven till ett djup av 7 mm för att göra ett steg som lätt sätts in i änden av röret.
- Mill en 1 mm spår i steget att ändhuven för att rymma en O-ring, vilket är nödvändigt för att förhindra ändhuven från att falla av änden på röret.
- Avrunda exponerade kanter och en avfasning alla hörn av slut lock för att förhindra tugga av möss.
- Gör peg-skålar från polykarbonat folie med en CNC-maskin. Utvändiga mått bör vara 24 x 19 x 6 mm 3, med en 10 x 3 mm 2 skålform depression i ena änden. En peg-skål är needed för varje rör. Peg-skålar bör sätta in ordentligt i det avlånga spåret i slut locken (Figur 2).
Figur 1:. Observation Chambers Observationskamrarna var utformade för att bibehålla fritt beter djur i fluoroskopi synfältet. Dessa bilder visar kammar komponenter som är nödvändiga för att genomföra VFSS. Top: "tappningsrör", designad för att leverera vätskor via pipen. Botten: "ventilationsrör", designad för att leverera vätskor via peg-skål. De två gavlar är utbytbara mellan pip och ventilationsrören.
Figur 2:. PEG-skålar Varje peg-skål snäpper in i ett spår i den inre ytan hos varje ändtätningen. Vänster:omonterade komponenter. Middle: monterade komponenter. Höger:. Yttre ansikte gaveln Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Konstruera Sipper Tube Flaskor från Centrifugrör, Silikon Proppar och Metal Pipar (Figur 3)
- Använd en propp borrare (5/16 ") för att göra ett centrumhål genom varje silikonpropp.
- Applicera några droppar mineralolja i borrhålet och manuellt infoga en metall pip i den breda änden av proppen. Raka boll-punkts pipar är att föredra eftersom raka obestämd pipar resultera i stort läckage och stänk av kontrastmedlet inom observationskammaren, vilket kan störa visualisering under testningen.
- Justera pipen längd så att det sträcker sig över hela längden av silikon proppen och sträcker sig ca 3 cm över den breda änden av proppen.
- För in den smala änden av varje propp (innehållande en sugdel rör) i en 30 ml centrifugrör.
- Verifiera att pipen längden är adekvat genom att sätta in den genom det avlånga hålet i toppen av observationskammaren. Pipen spetsen ska vila ca 1 cm från kammaren taket, som är tillräckligt lång för friska vuxna möss att nå.
OBS: Längre längder resultera i möss som dricker när du svänger / luta huvudet, vilket skymmer visualisering av svälj under VFSS. - Förläng pipen längd för att rymma yngre möss, mindre storlek musstammar och mus sjukdomsmodeller som inte kan nå pipen pga motor nedskrivning av armar och ben.
- Tvätta de nygjorda pipar före användning för att avlägsna mineralolja, silikon skräp och andra föroreningar under hanteringen.
Figur 3: sipper. Tube Flaskor Vänster: omonterade komponenter. Middle: monterade komponenter. Höger:. Mus som dricker från sipper röret i observationskammare Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Konstruera en spruta Delivery System för användning med Peg-skålar (Figur 4)
- Använd en svarv för att göra adaptrar för anslutning av polyeten (PE) slang till observationskammarslut mössor, beskrivas på följande sätt.
- Skär 1/2 "diameter acetalplast stav material i 1 1/4" längd sektioner, nedan kallade röradaptrar (eller adaptrar).
- Vid ena änden av varje adapter, minska en "sektionslängd vid spetsen till 16/03" 02/01 diameter, hänvisas till häri som den smala änden.
- För de återstående 3/4 "längd avsnitt av varje adapter (dvs 1/2" end diameter), maskin spår för manuell grip under osse. Detta avsnitt är häri kallad den breda änden.
- I den breda änden av varje adapter, borra ett hål i mitten som är 0,098 "diameter och 1" djupt.
- Borra och brotscha den återstående delen av centrumhålet i varje adapter till 0,096 "för att ge en bra passform på PE-slang.
- Klipp PE slang (PE 240, innerdiameter 1,67 mm) till önskad längd med hjälp av en sax. En 3-4 fots längd ökar tillräckligt avståndet mellan utredare och fluoroscope under VFSS testning för att förbättra strålsäkerheten.
NOT: Längre längder kommer att använda en större volym av kontrastmedlet lösningen under VFSS testning, kanske större än standard 30 ml recept. - Sätt i en trubbig spets 15 G nål helt i den ena änden av PE-slang. Beslaget ska sitta.
- Sätt in den andra (fria) änden av PE-slang genom centrumhålet av adapterröret, med början vid tHan breda änden.
- Dra PE slang ur den smala änden av adaptern så att den sträcker sig ~ 2 mm.
- Sätt den smala änden av adaptern (med ~ 2 mm PE-slang som sträcker sig från den) i slut locket en observation rör; Det bör passa väl in i försänkt hål ligger direkt ovanför den peg-skålen.
- Justera PE slanglängden i den smala änden av adaptern, så att den knappt sträcker sig ovanför skålen depression hos peg-skål.
- Fyll en 10 ml spruta (utan nål fastsatt) med vatten från en bägare och avlägsna eventuella luftbubblor.
- Fäst den fyllda sprutan till nåländen av PE-slang.
- Tryck långsamt sprutkolven för att leverera vatten till peg-skålen i observationskammaren. Stanna när PEG-skålen är nästan full. Undvik överfyllning, vilket kommer att orsaka stänk under dricka.
- Om PEG-skålen inte fyller korrekt justera längden hos PE slang sträcker sig ovanför den peg-skål.
- Över förlängning av PEslang kommer att locka möss att tugga på den under provningen, i stället för att dricka från peg-skålen.
- Om PE-slang inte förlängs tillräckligt långt, kommer vätska köra på golvet av observationskammaren i stället fylla peg-skålen.
- Efter användning, ta bort sprutan och tvätta hela sprutleveranssystem med tvål och vatten. Använd en 10 ml spruta för att driva luft genom PE-slang för att avlägsna vatten. Sterilisera i autoklav vid behov.
Figur 4:. Syringe Delivery System Vänster: omonterade komponenter. Middle: monterade komponenter. Höger:. Mus som dricker från peg-skål i observationskammare Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Konstruera en Motoriserad SCISSeller Lyft Tabell för Remote Placering av observations avdelningen (Figur 5)
- Bygg en saxlift med en 12 x 12 cm plattform som kan höja och sänka med 5 cm för att rymma tittar möss i olika positioner inom genomlysning synfältet. Hissmaterial bör vara av metall eller plast för att underlätta rengöring med desinfektionsmedel.
- Montera stegmotorer för att justera höjden och longitudinella positionen av hissen.
- Par den första stegmotorn till den sax lyftmekanism för att kontrollera höjden genom att översätta en tvärstång. Denna koppling kan vara en ledarskruv eller rack-and-pinion utväxling.
- Par den andra stegmotorn till saxlift ramen för att styra den längsgående positionen genom att översätta hela lyftramen i förhållande till bordet. Denna koppling kan vara en ledarskruv eller rack-and-pinion utväxling.
- Wire ett fjärrstyrningssystem till stegmotorerna för att medge justering av observationskammaren position under avbildning samtidigt minimera undersöktor exponering för strålning.
- Gränssnitt handhållen fjärrkontroll knappar med en mikrokontroller chip för att styra aktiveringen och riktning på varje stegmotor.
Figur 5:. Fjärrstyrd lyftbord Vänster: från sidan av lyftbord. Höger: lyftbord med observationskammare placerad i fluoroskop. Lyftbordet justerar positionen av observationskammaren för att hålla möss i synfältet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Utför Behavioral Conditioning Innan VFSS Testing för att säkerställa maximal Deltagande
- 1-2 veckor före VFSS testning, ämnes möss till en övernattning (12-16 timmar) vattenreglering period för att framkallatörst, under vilken tid vatten innehålls från hemmaburen. Målet för vattenreglering är för djur ska vara törstig, inte uttorkad. Djur bör vara uppmärksamma och lyhörda. Denna varaktighet och tidsramen är viktigt att förhindra uttorkning, som kan inträffa som en följd av reglering episoder 2 vatten inom 1 vecka (dvs, en för beteendekonditionering och en annan för VFSS testning).
- Placera ett enda "tappningsrör" (med en ände sluten av en slut cap) på golvet i ett hem bur som innehåller nytt strö material. Den slutna änden bör vara närmast sprutöppningen i kammartaket. Detta steg säkerställer tillräcklig ventilation medan flera möss sova hopkrupen i kammaren djupet över natten. Den öppna änden gör möss att fritt komma in / ut ur kammaren.
- Avlägsna annan berikning material (t.ex., nestlet och koja) uppmuntra möss att utforska och sova i kammaren under natten (Figur 6). Detta steg säkerställer att mössär acklimatiserad till att vara i kammaren för långa löptider före VFSS testning.
- Ge en enda standard mat pellets per mus på golvet i buren för övernattning äta; ger inte vatten eller andra vätskekällor.
- Använd en standardfiltertopp för att innehålla de möss i bur under natten, eftersom dimensionerna hos observationskammaren hindra en standard tråd lock från att passa i buren. Förvara avlägsnades tråd lock (innehållande mat och vattenflaska) ovanpå filtertoppen att tynga locket och förhindrar möss från att fly.
- Utför smaklighet testa följande morgon, beskrivs på följande sätt.
- Gör en chokladsmakande testlösning i en 30 ml sipper tube flaska, utan att lägga kontrastmedel (dvs ersätta vatten för johexol). Detta recept beskrivs i tabell 1. Gör en flaska per bur som ska testas.
- Ta observationskammaren och ersätta den vanliga tråd locket. Erbjud choklad smaksattlösning (rumstemperatur, ~ 22 ° C) under 2 min per bur, införd genom tråd locket.
- Bedöm smaklighet genom att observera dricka beteenden under 2 min testperioden.
- Betyg smaklighet enligt följande kriterier:
- Latency tills de första mus drinkar i pipen i minst 5 sek utan avbrott.
- Andel möss per bur som dricker lösningen.
- Antal möss som samtidigt dricka på pipen.
- Lösningen bedöms välsmakande om majoriteten av möss i varje bur har flera långa (> 5 sek) anfall av dricka och om flera möss dricka samtidigt från pipen (Figur 7).
- Om chokladen smaksatt lösning är inte välsmakande, upprepa smaklighet testning med andra smakförstärkare vid olika koncentrationer för att identifiera en enda föredragen lösning.
- Erbjuda upp till fyra olika lösningar (vid olika koncentrationer) en i tageti randomiserad ordning till flera burar av möss i ett enda test dag, utan en washout period eller washout lösning. Lämpliga smaker förstärkare att tänka för möss inkluderar socker, ost, jordnötssmör, olika frukter och nötter smaker, och mjölk.
OBS: Utför inte smaklig testa mer än en gång per vecka för att förhindra uttorkning från upprepade vattenreglerings episoder. - Det kan ta flera veckor att framgångsrikt identifiera den föredragna lösningen för varje stam av möss. Målet är att identifiera kandidat smaker som resulterar i flera långa (> 5 sek) anfall av dricksvatten från möss omedelbart (<30 sek) efter exponering, eftersom dessa kvalifikationer bedöms nödvändig för att få lyckade VFSS utfall.
- Efter en föredragen smak lösning identifieras, tillbaka observationskammaren till varje hem bur för att fortsätta beteende conditioning, beskrivas på följande sätt.
- Fäst ett ändtätningen till observationskammaren vid den ände som är närmastoval (pip) hål.
- Erbjud möss den chokladsmaksatta lösning för 2-3 h genom att sätta in sipper röret flaskan genom det ovala hålet i toppen av kammaren. Detta steg säkerställer att alla möss har villkorat att dricka djupt inom observationskammaren.
- Avlägsna tråd locket för att inrymma observationskammaren.
- Placera 1 mat pellets per mus på burgolvet för ad libitum konsumtion under testperioden.
- Täck buren med ett standardfiltertopp för att hindra möss från att fly för återstoden av den beteendeanpassningstider. Förvara bort tråd lock (innehållande mat och vattenflaska) ovanpå filtertoppen att tynga locket.
- Ge vatten och mat ad libitum i buren när beteendekonditione är klar.
- Tvätta observationskammare (rör och slut caps) och sipper tube flaskor (pipar och centrifugrör) med tvål och vatten; sterilisera i autoklav vid behov. Undvikanvändning av aceton för att rengöra rören eftersom det orsakar en permanent grumling effekt som gör röret ogenomskinlig snarare än genomskinligt.
Figur 6:. Möss Exploring Observation Chambers Möss är naturligtvis benägna att söka skydd i små utrymmen. Som ett resultat, de fritt gå in och utforska tuben när den är placerad i hemmaburen. De flesta möss hittas sovande i kammaren på morgonen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| INNEHÅLL | Choklad Solution (för smaklighet Testing) | Choklad-Smaksatt Johexol (för VFSS Testing) |
| 3 ml | 3 ml | |
| Johexol (350 mg jod / ml) | 0 ml | 15 ml |
| Vatten (DI eller filtrerade) | Justera till 30 ml slutlig volym (27 ml) | Justera till 30 ml slutlig volym (12 ml) |
| Slutlig volym | 30 ml | 30 ml |
Tabell 1: Choklad smaksatt testlösning Önskad av C57 och C57 / SJL musstammar.
Figur 7:. Smaklighet Testing En indikator på smakpreferens under smaklighet testning är antalet möss som samtidigt dricka från en enda pip i hemmaburen. Denna bild visar fyra möss samtidigt dricka en choklad smaksatt lösning, som identifierades som denföredra smakförstärkare från C57 och C57 / SJL stammar.
6. VFSS Testning Framställning
- Subject möss till en över natten vattenreglering period (dvs undanhålla vatten för 12-16 h), såsom beskrivits i steg 5 ovan.
- Placera ett enda "ventilationsröret" (med en ände sluten av en slut cap) på golvet i ett hem bur som innehåller nytt strö material. Den slutna änden ska vara närmast ventilationshålen i kammaren taket. Detta steg säkerställer tillräcklig ventilation medan flera möss sova hopkrupen i kammaren djupet över natten. Den öppna änden gör möss att fritt komma in / ut ur kammaren.
- Följande morgon, ta bort nedsmutsade observationskammare från burar och kort skölja med kranvatten och helt torr som förberedelse för VFSS testning.
- Ta bort och rengör bara en kammare i taget för att undvika att blanda upp kamrar mellan burar, vilket kan orsaka alltför stora undersökande beteenden somsignifikant interferera med VFSS testning.
- Om "pip rör" används i stället för "ventilationsrören" för VFSS testning, sätt in en silikon kontakt i pipen öppning observationskammartaket för att förhindra undersökande beteende (Figur 8).
- Märk varje kammare (t.ex. med buren nummer) för att förhindra blandning upp.
OBS: Använd en torr radera markör att märka varje rengjorda röret innan du lägger tillbaka den i buren. Permanent markör bör undvikas eftersom den absorberas av rörmaterial och inte tvätta bort, även med alkohol eller aceton.
- Förbered den chokladsmaksatta johexol lösning (eller annan välsmakande lösning).
- Gör samma recept (30 ml) av testlösningen (tabell 1) för flera burar.
- FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER FÖR Johexol: Förvara oöppnad johexol flaskor vid rumstemperatur, skyddat från ljus. Användning öppnade johexol flaskor inom 24h, då viskositeten och smak kan förändras inom en dag eller så efter exponering för luft. Alternativt, frysa portioner av enkel portioner (15 ml) i centrifugrör för långtidsförvaring. Beredda johexol testlösningar måste användas inom några timmar för att säkerställa friskhet och förhindra undvikande av möss. Administrera Johexol lösningar vid rumstemperatur för att undvika confounding studien på grund av temperatureffekter på swallow funktion. Frys inte någon kvar beredd testlösning, eftersom chokladsmak blir bitter med frysning och resulterar i undvikande av möss.
- Förbered genomlysning miljön.
- Använd en extra (tom) observationskammare och peg-skål (eller sipper tube pip) för att fastställa den optimala höjden och position inom fluoroskop trålen som tillåter visualisering av dricka i sidled (horisontell) plan.
- Ställ genomlysningsbildhastighet till 30 bilder per sekund; högre (men inte lägre) bildhastigheter kan användas om det finns.
- ENsure att en röntgentäta kalibreringsmarkör lämpligt placerad på fluoroskop kamera / detektor så att det syns på bildskärm under hela testet. Detta steg är nödvändigt för att möjliggöra kalibrering av längdmått som används för att kvantifiera svälja parametrar.
Figur 8:. Silikon Plug vid användning Peg-Skålar Vänster: silikonplugg. Höger: En silikonplugg dras genom sugdel röret öppning i toppen av observationskammaren den. Denna kontakt förhindrar möss från att bli distraherad av sprutöppningen när du använder en peg-skål i stället sipper röret under VFSS testning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. VFSS Testning av möss
- Lyft kammaren ut ur buren och försiktigt fästa 2: a end-cap (med peg-skål fäst, om en sipper tube inte kommer att användas), var försiktig så att du inte klämmer musen (speciellt svansen).
OBS: Detta tillvägagångssätt minimerar musens stress pga hantering, vilket är särskilt viktigt för möss som testas för första gången. - Med upprepad testning, kan mössen lätt lirkade att komma in i kammaren när den placeras framför dem inne i buren, eller när upphängd i svansen över kammaröppningen.
- Om du använder en peg-skål, Leverera lösningen via spruta leveranssystemet som beskrivs i steg 3 ovan. Detta system medger snabb och enkel påfyllning av peg-skål som behövs.
- Om du använder en sipper tube flaska, sätt in sipper röret genom den ovala öppningen i toppen av observationskammaren. Vippa flaskan så att pipen är riktad mot centrum av kammaren.
- Justera positionen på observationskammaren (med användning av fjärrstyrda lyftbord beskrivits i steg 4), så att svälja mekanismen är synlig i synfältet.
- Pausa inspelningen varje gång musen vänder sig bort från peg-skål eller pip för att minimera längden på strålningsexponeringen.
- Återuppta inspelningen när musen återgår till pipen eller peg-skål.
- Fyll på peg-skål som behövs.
- Sluta testa om musen inte dricker inom 5 minuter. Målet är att spela in flera long (> 5 sek) anfall av kontinuerlig drickande, vilket är typiskt för de flesta möss inom de första 2 min av att testa.
- Återgå noncompliant möss till buren (utan vatten) för återtestning vid ett senare tillfälle samma dag; inte överstiger en 24 hr vattenreglering period. Möss som förblir noncompliant för tre försök tas bort från studien.
- Rengör peg-skålen (och dricks av PE-slang) eller sipper tube pip med en torr pappershandduk mellan möss.
- Rengör observationskammare som behövs mellan möss att ta bort eventuella befläckade johexol på kammarens väggar. Skölj kammaren med kranvatten och torka med hushållspapper.
- Använd en ny peg-skål (eller ändra sipper röret pipen). Annars kan möss distraheras av lukten av andra möss som drack ur samma pinne-skål eller sipper röret. PEG-skålar och sipper rören bör märkas för att undvika förvirring.
8. Video Analysis
- Använd ett videoredigeringsprogram program som tillåter bildruta för bildruta analys av videofluoroscopy inspelningarna att kvantifiera svälja parametrar av intresse (tabell 2). Identifiera minst två utbildade granskare att analysera varje video i en blindad mode: En primär granskare och en eller två sekundära granskare.
- Primär granskare: Visa varje video för att identifiera och analysera 3-5 långa (ca 5 sek) dryckeslag. Kriteriet baseras på publicerade icke-radiografiska svälja studier med möss 13,14 och VFSS med råttor 12 visar att 3 - 5 åtgärder per swallow parameter är tillräckliga för statistiska analyser.
- Sekundära granskare: Självständigt analysera 3-5 åtgärderna per swallow parameter för varje mus som ursprungligen identifierades och analyserats av den primära granskare.
- Identifiera-omdömen Avvikelserna för varje mus. Åter analysera alla avvikelser som en granskare grupp för att nå 100% konsensus.
- Medelvärdet 3-5 konsensus (dvs, obestridda) värden för varje svälja parameter för att erhålla medelvärdet för varje mus för användning i statistiska analyser. När färre än 3 measures erhålls för en enda svala parameter för en given mus, anger ett saknat värde (dvs inte noll) i det statistiska databas för motsvarande svalan parameter.
| Swallow PARA | BESKRIVNING |
| Inter-Swallow Intervall (ISI) | Antalet videoramar mellan två på varandra, oavbruten svalor. Start ram för beräkning ISI är "resten ram" som omedelbart föregår synlig överföring av bolus från valleculae till matstrupen. Slutramen är "resten frame" i nästa svalan. Antalet bildrutor mellan de två på varandra svalor divideras sedan med 30 bilder per sekund (fps) för att konvertera till (sek). |
| Jaw Excursion Rate (Lick nivå motsvarande) | Tungan är inte klartsynliga under VFSS att medge kvantifiering av slicka hastighet; dock käken utflykt hastigheten lätt kvantifierbara. Under slicka, måste käken öppna för att tillåta tungan att skjuta ut från munnen. Därför medan drickande är antalet käken öppna / stänga (utflykt) cykler per sekund (30 bilder) motsvarar slicka takt. Varje käken utflykt cykel börjar med käken maximalt öppnade (som sammanfaller med tunga utstick) och slutar när käken återgår till maximalt öppet läge. Efterföljande cykler av käken stängning och återöppnande räknas som individuella käken utflykt episoder. |
| Jaw Excursion Avstånd | Avståndet käken öppnas under käken utflykt cykler, mäta i mm mellan maxillary och mandibular framtänder. |
| Lick-Swallow Ratio | Antalet käken utflykts cykler som inträffar under varje ISI (dvs mellan två på varandra följande, oavbrutna svalor). |
| Swallow Betyg | Antalet svalor som inträffar under varje 2 sek episod av oavbruten drickande vid pipen. |
| Svalg Transit Time (PTT) | Den tid det tar att placera bolus sväljas genom svalget. Startramen är identisk med ISI startramen (dvs "resten ram" som omedelbart föregår synlig överföring av bolus från valleculae). Den ändram är när svansen av bolus har helt passerat 2 nd halskotan (C2), vilket är den mest uppenbara anatomiska landmärke i halsryggen på musen. Antalet bildrutor mellan start- och slutramar divideras sedan med 30 fps och omvandlas till millisekunder (ms). |
| Bolus hastighet genom Pharynx | Faryngeal bolus hastigheten mäts i förhållande till PTT (beskrivet ovan). Använda ImageJ mjukvara, är avståndet (mm) från valleculae till C2 kotan mäts, skalas med hjälp av en kalibreringsmarkör. Denna distance (mm) delas sedan med PTT (ms) för att bestämma bolus hastighet (mm / ms). |
| Esophageal Transit Time (ETT) | ETT startramen är identisk med PTT slutramen (beskriven ovan). ETT-ändramen är när boluset har fullständigt gått in i magsäcken, vilken definieras som försvinnandet av bolusen från matstrupen. Antalet bildrutor mellan ETT start- och slutramar divideras sedan med 30 fps och omvandlas till msek. |
| Bolus hastighet genom Matstrupen | Esofagus bolus hastighet mäts relativt ETT (beskriven ovan). Använda ImageJ mjukvara, är avståndet (mm) mätt från C2 kotan till matstrupsövergången, skalas med kalibreringsmarkör. Detta avstånd (mm) divideras sedan med ETT (msek) för att bestämma bolus hastigheten (mm / ms). |
| Bolus Fart genom svalg och matstrupe | Denna parameter används när C2 är inte en väl synlig anatomisk landmärke; följaktligen,är det inte möjligt att skilja mellan svalg och esofagus stadier svälja. I sådana fall är bolus hastighet genom svalget och struphuvudet kombineras till en enda sväljparameter. Startramen är identisk med PTT startramen (dvs "resten ram" som omedelbart föregår synlig överföring av bolus från valleculae). Slutramen är identisk med ETT-ändramen (dvs när boluset har fullständigt gått in i magen). Antalet bildrutor mellan dessa två händelser divideras med 30 fps och omvandlas till msek. |
| Bolus Område | Använda ImageJ mjukvara, är bolus område mäts vid vallecular "resten frame" innan behandling med svalg svälja, skalas med hjälp av en kalibreringsmarkör. |
| Faryngeal Återstod Område | Faryngeal restområdet mäts med ImageJ programvara, skalas med hjälp av en kalibreringsmarkör. |
| Volym flytande konsuMed | Volymen av vätska som förbrukas från en sipper tube flaska är svår att uppskatta på grund av läckage från pipen. Emellertid kan den vätskevolym som förbrukas från en PEG-skål vara mer exakt beräknas enligt följande: 1) bestämma densiteten (dvs förhållandet av vikt till volym) av den kalibrerade vätskevolymen som administrerades i peg-skål, 2 ) fastställa vikten av den peg-skålen innehåller restvätskan, 3) anger dessa värden i en vikt till volym omvandlare (t.ex. http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php . |
Tabell 2: Svälj Parametrar Kvantifierbart Under Murina VFSS.
Representative Results
Vi har framgångsrikt utformat en ny och replikerbar murin specifik VFSS protokoll som innefattar testkamrar som tillåter självmatning, recept för aromatiska orala kontrastmedel, och en steg-för-steg-testprotokoll som medger kvantifiering av swallow fysiologi. Förmågan energinivån för genomlysnings systemet bestäms vilka svälja parametrar kunde undersökas i möss. Vi använde initialt höga energi fluoroscopes utformade för användning med människor och större djur (t.ex. GE Advantx, GE OEC 9600, och Omega Cardiac Cath CS-25, var och med 30 bilder per sekund). Men dessa system hade otillräckliga förstoringskapacitet för provning möss, vilket resulterade i att djuret fyllningen endast en liten del av synfältet (Figur 9). Som ett resultat, var bildkvaliteten ovanligt dålig, vilket gör det omöjligt att visualisera de flesta strukturer av sväljmekanismen. Trots denna begränsning, identifierade vi 7 mål VFSS svälja parametrar som var konsekvent kvantifierbar för möss vid användning av en konventionell (dvs, högenergi) fluoroskop i kombination med den nya murina VFSS protokollet (tabell 3). Dessutom identifierade vi vallecular rymden som den anatomiska brytpunkt för att svälja hos friska vuxna möss (3-17 månader), liksom möss med villkoren i hög ålder (> 18 månader) och slutstegs ALS.
Figur 9:. High Energy Fluoroskopi Systems Vänster: Representant bild av en mus som erhållits med hjälp av hög energi (dvs konventionella) genomlysningssystem. Observera att musen fyller endast en liten del av den fluoroskopi synfältet, vilket visar att det otillräckliga förstoringen förmågan hos konventionella fluoroscopes för avbildnings gnagare. Höger: Samma förstoras bilden efter capture att använda en video redigeringsprogrammet. Svart pil: svälja brytpunkt (valleculae). Vit pil:. Bolus i distala matstrupen, omedelbart före passerar genom GE korsningen (vit asterisk) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Swallow PARA | High Energy System | Låg energi System |
| Inter-Swallow Intervall (ISI) | X | X |
| Jaw Excursion Rate (Lick nivå motsvarande) | X | X |
| Jaw Excursion Avstånd | X | X |
| Lick-Swallow Ratio | X | X |
| Swallow Betyg | X | X |
| Pharyngeal Transit Time (PTT) | X | |
| Bolus hastighet genom Pharynx | X | |
| Esophageal Transit Time (ETT) | X | |
| Bolus hastighet genom Matstrupen | X | |
| Bolus Fart genom svalg och matstrupe | X | X |
| Bolus Område | X | |
| Faryngeal Återstod Område | X | |
| Volym vätska Consumed | X | X |
Tabell 3: Svälj Parametrar Kvantifierbart Använda Hög Versus Low Energy genomlysning Systems.
Vi fick nyligen en låg genomlysning systemet förstoring energi som kallas The LabScope (Glenbrook Technologies, Randolph, NJ) som har utvecklats speciellt för vårt laboratorium för användning medmöss och andra små gnagare (Figur 10). Dock gjorde de markant högre grader av förstoring av detta system det omöjligt att se hela sväljmekanismen för en mus i en enda synfält. Istället är två testpositioner krävs, såsom visas i fig 11. Position 1 medger visualisering av hela huvudet och proximala thoraxregionen. Denna position är nödvändig för att bedöma de muntliga och svalgstadier svälja. Position 2 tillåter visualisering från svalan brytpunkt (dvs. valleculae) till gastroesofageal (GE) korsning. Denna position är nödvändig för att bedöma esofagus skede av svälja. Förberedelser använder The LabScope i kombination med den nya murina VFSS protokollet har identifierat 13 objektiva svälja parametrar som är genomgående kvantifierbara hos möss, vilket är nästan dubbelt så många som erhållits med hjälp av hög energi (dvs. konventionella) fluoroscopes (Tabell 3). Denna o utcome skrivs de avancerade förstorings kapacitet The LabScope, vilket möjliggör visualisering av talrika anatomiska strukturer (Figur 12) som var i huvudsak osynlig när du använder konventionella system: t.ex. hyoidbenet, luftstrupe och halskotor. Som ett resultat, kunde vi också att analysera filmer för tecken på struphuvudet penetration och aspiration. Varken penetration eller aspiration observerades för någon mus i denna studie, oavsett hälsa eller sjukdomstillstånd.
Figur 10:. Den LabScope Vänster: The LabScope presterar som en stationär fluoroscope för smådjur. Höger: Närbild bild av The LabScope med märkta komponenter. Den lyftbord positionerar en observationskammare inom fluoroskop synfält. tp_upload / 52.319 / 52319fig10highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11:. Low Energy Fluoroskopi System Bilder av en mus som erhållits med hjälp av en låg energi genomlysning systemet. Notera att hög förstoring förmåga förhindrar visualisering av hela svälja mekanism inom fluoroskopi synfältet. Vänster: Position 1 - tillåter visualisering av hela huvudet och proximal bröstkorg region. Den svala utlösningspunkt (svart pil) är väsentligen centrerad i synfältet. Höger: Position 2 - tillåter visualisering från svalan brytpunkt (svart pil) till GE korsningen (vit asterisk). Notera bolusen som passerar genom den distala esofagus (vit pil). g11highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12:. Anatomiska strukturer Visible använda en Low Energy Fluoroskopi System Även vid den lägsta förstoringsinställning (till vänster), boney strukturer huvudet och halsen på en mus är väl synlig med hjälp av vår låga energi genomlysning systemet (dvs, den LabScope). Anatomiska strukturer inom svart fyrkant visas (och märks) vid högre förstoring till höger. Förbättrad visualisering av boney strukturer medger kvantifiering av flera ytterligare svälja parametrar som var omöjliga att analysera med hjälp höga energi fluoroscopes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 13:. Preliminära resultat Denna figur visar representativa preliminära resultaten för två svälja parametrar VFSS kvantifierade använda murina VFSS protokoll: svälja hastighet (vänster) och inter svälja intervall (höger). Svälj takten var betydligt långsammare för SOD1 möss jämfört med åldrade C57 möss och kontroller. Inga signifikanta skillnader grupp identifierades för inter swallow interval. Linjer i toppen av staplarna indikerar statistiskt signifikanta skillnader (p <0,05) mellan grupperna, identifieras med hjälp av Bonferroni parvisa jämförelser. Felstaplar representerar ± 1 SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Hundratals murina (mus och råtta) modellerna är kommersiellt tillgängliga för att studera mänskliga sjukdomar. Dock har endast tre modeller murina sjukdoms specifikt undersökts i förhållande till dysfagi: en musmodell av ALS 13,14 och råttmodeller av Parkinsons sjukdom 12,15-17 och stroke 18. Var och en av dessa förstudier utnyttjade olika metoder för att bedöma dysfagi, gör det omöjligt att härleda meningsfulla jämförelser mellan arter och sjukdomar. Denna stor begränsning kan övervinnas i framtida studier genom att utnyttja den nyutvecklade murina VFSS protokoll som möjliggör objektiv kvantifiering av många svälja parametrar i själv mata djuren.
Framgångsrika VFSS utfall är beroende av tre viktiga komponenter: 1) testkammare som tillåter självmatning medan stående ohämmad i ett trångt utrymme, 2) recept som maskerar obehaglig smak / lukt av kommersiellt tillgängliga orala kontrast agents, och 3) är ett steg-för-steg-testprotokoll som medger kvantifiering av swallow fysiologi. Den kombinerade effekten ger en bekväm, låg stress, själv utfodring undersökning miljö som väcker typiska utfodring och svälj beteenden. Eliminering av en eller flera av dessa komponenter kommer att ha en skadlig inverkan på studieresultaten. Exempel på negativa utfall inkluderar oförmåga att upprätthålla djur i genomlysning synfält, oönskade beteenden som distraherar från att dricka, motvilja mot den muntliga kontrastmedel, och oförmåga att kvantifiera svälja parametrar beroende på otillräckliga dricka episoder.
En stor utmaning att få optimala VFSS utfall var att utforma ett lämpligt testkammare. Talrika revideringar av vår prototyp kulminerade i en observationskammare som tillräckligt bibehåller möss i synfältet och förhindrar beteenden som distraherar från att dricka. Kamrarna gjordes med användning av fräsmaskiner att erhålla likformiga dimensioner the-rör och slut mössor, och därmed säkerställa utbytbarhet av komponenter för flera observationskammare med samma diameter. De inre dimensioner (diameter och längd) matchades för att vara något större än en vuxen mus kroppsstorlek, vilket resulterade i en smal testkammare som tillräckligt tillåter promenader i en rak linje och vända. Den smala designen, i kombination med strategisk positionering av pipen och peg-skål endast slutet, håller huvudet och kroppen av möss linje längs kammarens när man dricker. När bedriver dricka, möss förblir påfallande själv stabiliserats på pipen eller skål under flera sekunder i taget, vilket resulterar i minimal rörelse artefakt att störa testningen. Således är det möjligt att erhålla en icke snedvriden, närbild observation / videoinspelning och videofluoroscopic avbildning av möss när man dricker i sido och rygg-ventrala plan.
Möss (och andra smågnagare) är naturligtvis benägna att sek kvinnojour i små utrymmen. Som ett resultat, de fritt komma in i provkammaren (med en ände redan stängt av en slutlock) när den placeras i hemburen, varigenom man eliminerar spänning / ångest som orsakas av hantering (dvs manuellt plocka upp djuret att placera den i kammaren). När musen kommer in i kammaren, är den andra änden stängd genom att fästa en 2 nd ändtätningen. Denna konstruktion förhindrar flykt samtidigt skapa en låg ångest testkammare för möss att fritt utforska.
Den kvadratiska formen av kammaren ger inbyggd rörelse stabilitet som gör att den kan användas i en fristående mode, vilket eliminerar behovet av att testa i en standard gnagare bur. Hela apparaten är lätt, bärbar, stapelbar för lagringsändamål, robusta, lätta att rengöra och kan autoklaveras. Medan kamrarna ursprungligen utformats för användning med fluoroskopi, de också är kompatibla med spot-filmradiografi, neuroimaging (t.ex., MRI, PET, CT), och videoal observation / videoinspelning av olika beteenden.
En andra stor utmaning att övervinna var maskering obehaglig smak / lukt av orala kontrastmedel (dvs, bariumsulfat och johexol). Med tanke på att smakkänsligheten varierar mycket mellan musstammar 19-21 och kanske med åldern 22,23, var det nödvändigt att identifiera en enda testlösning som var tilltalande för alla möss, oavsett stam och ålder. Detta resultat är viktigt att möjliggöra direkta jämförelser av swallow funktion / dysfunktion över stammar och åldrar, samtidigt som man eliminerar confounding resultat på grund av skillnader i reologiskt (t.ex., viskositet, densitet, etc.) och kemiska egenskaper hos testlösningarna. För detta ändamål har vi utvecklat en enkel, snabb smaklighet screening metod för att identifiera den föredragna smakförhöjare att maskera obehaglig smak / lukt av orala kontrastmedel under murina VFSS. Metoder modellerades efter den korta exponeringstest, vilket kräver en slickameter (dvs, slicka sensor) för att spela in slicka priser under den första 2 min efter en period vattenreglering (dvs, undanhålla vatten över natten) för att framkalla törst 24,25. En lickometer var inte tillgänglig för denna studie; Därför blev preferens bedöms av beteendeobservationer, såväl som standard videoinspelning metoder för slicka takt som tidigare har validerats i vårt labb 13,14. Med hjälp av denna smaklighet screening, var choklad identifierats som den föredragna smakförstärkare från C57 och C57 / SJL stammar. Specifikt 100% av mössen i varje bur drack lätt chokladsmak lösningar inom 30 sekunder av exponering, med flera möss samtidigt dricka i pipen. Men tillägg av barium ledde endast korta dryckeslag med de flesta möss, oavsett barium eller choklad koncentration.
Ett alternativ till barium är johexol, en jod-baserade kontrastmedel som har först nyligen erkänts som ett suibords alternativ till bariumsulfat för mänsklig VFSS 10; alltså, det har ännu inte standardiserats för detta ändamål. Flera olika koncentrationer av chokladsmakande johexol erbjöds till möss. Recept som innehåller upp till en 50% lösning av lager johexol (350 mg jod per ml) lätt drack av de flesta möss efter en natts vattenreglering period. Högre koncentrationer gav undvikande beteenden. En 50% johexol (350 mg jod per ml) lösning framställd tillräckligt radiodensitet samtidigt som sväljs av möss, medan lägre koncentrationer var markant mindre synliga och hindrade kvantifiering av swallow fysiologi. Därför var den optimala testlösningen för VFSS med möss identifierades som en 50% iohexol lösning med chokladsmak tillsattes. Upprepa smaklighet testning resulterade inte i undvikande beteenden eller biverkningar.
En tredje utmaning att övervinna avhöll möss från svarvning / luta huvudet medan drickande, vilket skymmer visualiseringav sväljmekanismen under VFSS. Dricka från en PEG-skål placerad precis ovanför golvet vid en ände av kammaren löst detta problem. Det finns flera ytterligare fördelar med att använda en PEG-skål i stället för en sipper röret flaska. Till exempel kan en kalibrerad volym av vätska skall pipetteras i peg-skålen via en ventilationshålet i ändtätningen av tuben. Detta tillvägagångssätt möjliggör kvantifiering av minutvolym testlösning som förbrukas under den korta VFSS provtid. Dessutom, den ökade ytarean av provlösningen i PEG-skål, jämfört med en liten sugdel röröppning, kan ge ökad olfaktoriska stimulering för att ytterligare motivera drickande. Peg-skålar kan vara bättre lämpade för att studera unga eller mindre stam möss, eftersom skålen höjden är ett standardiserat avstånd från golvet. Däremot måste sipper rörlängder justeras för att rymma olika storlek möss, vilket tillför ytterligare potentiellt confounding variabel att överväga. Också, mode musls av neurologiska sjukdomar kan ha svårt att nå en sipper tube flaska pga motor nedskrivning av armar och ben, medan de lätt kan nå en pinne skål. Möss med tungan och / eller käken dysfunktion kanske inte kan tillräckligt tryck på bollen i pipen för att komma åt vätskan; användning av PEG-skålar kan eliminera denna FÖRVÄXLA. Av dessa skäl är användningen av PEG-skålar över sipper tube flaskor den föredragna metoden för murin VFSS testning. Emellertid var de observationskammare utformad för att rymma pipen dricka efter behov. Ett viktigt förbehåll att tänka på är att slicka priser är kända för att skilja mellan pipen och skål dricka 13,26. Därför måste valet av antingen pip eller peg-skål för VFSS vara konsekvent inom och mellan experiment.
En fjärde utmaning var att identifiera kvantifierbara svälja parametrar för möss som är jämförbara med de VFSS parametrar som vanligen används i mänskliga forskningsstudier och klinisk praxis. Våra preliminära resultat visadetyp av genomlysning systemet avgör vilka svälja parametrar kan undersökas i möss. De flesta forskningscentra och medicinska miljöer har hög energi (75-95 kV, 1-5 mA) fluoroscopes avsedd för användning med människor och större djur, som resulterar i exceptionellt dålig bildkvalitet vid provning möss och andra smådjur. Som ett exempel, var en ny studie med hjälp av en hög energi fluoroscope med råttor kunna identifiera endast 4 kvantifierbara svälja parametrarna 12, och vi kunde identifiera endast 7 svälja parametrar för möss i denna aktuella studien. För att övervinna detta stor begränsning, som nyligen erhöll vi en låg energi genomlysning system som kallas The LabScope (Glenbrook Technologies). Systemet är en miniatyr fluoroskop som genererar en kontinuerlig kon-stråle av röntgenstrålar med fotonenergier mellan 15 och 40 kV och en topp rörström av 0,2 mA (8 W maximal effekt). De lägre energinivåer hos detta system är bättre dämpas av den tunna ben och mjukvävnad hos möss och därmed ge higher kontrastupplösning än konventionella (dvs, hög energi) fluoroscopes. Röntgen stråle av The LabScope är inriktad på en 5 cm bild diameter förstärkare, vilket är betydligt mindre än den 15-57 cm bild diameter förstärkare konventionella fluoroscopes. Den minsta källa till Intensifier avstånd (SID) av The LabScope är ~ 6 cm (i motsats till ~ 30 cm för konventionella fluoroscopes), vilket ger ökad förstoringsfunktioner. Dessutom använder den LabScope patenterad teknologi som digitalt förstorar bilden upp till 40 gånger i realtid, utan att ändra SID. Resultatet är i huvudsak ett röntgenmikroskop som kan zooma in och ut i realtid för att visa små regioner av intresse, såsom sväljmekanismen för en mus.
En stor fördel med denna lågenergihus genomlysning systemet förbättras strålsäkerhet. Utöver djur som fick lägre stråldoser med The LabScope, forskare som använder systemet utsätts för betydligt less strålningsspridning. Den strålningsexponering direkt framför aggregatet på kontrollpanelen är 10,3 mR / h. På ett avstånd 1 m framför enheten, droppar exponering för 580 μR / timme. De flesta andra platser i rummet har mycket låg exponering under 10 μR / timme. Trots denna förbättring, har vi vidtagit extra åtgärder för att förbättra strålsäkerheten. Till exempel har blyad akryl avskärmning lagts runt The LabScope att blockera spridda röntgenfotoner, vilket möjliggör för forskare att bedriva murina VFSS testning utan att bära personlig avskärmning (t.ex. bly förkläden, sköldkörtel sköldar, och glas). Dessutom medger den klara akryl visualisering av musen på avstånd. Ytterligare säkerhets strålning ges av en motoriserad lyftbord, som styrs på distans av prövaren. På avstånd upp till 3 m från fluoroskop, kan forskarna använda fjärrstyrda enheten för att justera den vertikala och horisontella position observationskammaren inom röntgen beam. Som ett resultat, kan de anatomiska regioner av intresse hållas inom den genomlysning synfält medan musen rör sig fritt inom observationskammaren. Även om saxlift utformades för att användas med The LabScope, även är den kompatibel för användning med konventionella fluoroscopes att förbättra strålsäkerheten för forskare. Ett sista steg för att förbättra strålningssäkerheten under murin VFSS medför användning av en spruta leveranssystem för vätskor. Detta system innefattar en 3-4 fot (eller längre, om så krävs) längd PE slang, som tillåter snabb och effektiv leverans av vätskor i peg-skål på avstånd. Denna spruta leveranssystem för vätskor, i kombination med observationen kamrarna, även kan användas med konventionella fluoroscopes.
Förberedelser använder The LabScope, i kombination med den nya murina VFSS protokoll, visar en stor fördel med jämfört med konventionella system: antalet svälja parametrar som tillförlitligt kan kvantifieras is nästan fördubblats. Men mjukdelsstrukturer svälja mekanismen (t.ex. tunga, velum, bakre svalgväggen, och struplocket) hos möss inte är lätt synliga när man använder låga eller höga genomlysnings energisystem. Därför har vi fokuserat på att kvantifiera bolus flödesåtgärder snarare än biomekanik svälja. Vi var övervägande intresserade av parametrar som kan kvantifieras utifrån tidsenheter, område, avstånd, volym, etc, snarare än att använda Likert-typ skala åtgärder. Många bolus flödesparametrar som uppfyller det kravet har beskrivits i den mänskliga VFSS litteraturen, såsom oral transittid 27-29, svalgtransittiden 27-33, och matstrupen transittiden 34-36, för att nämna några. Bolus transport genom munhålan inte var väl synlig i möss, sannolikt på grund av den lilla bolus storlek under spontan drickande. Men kunde vi tillförlitligt kvantifiera svalg och matstrupen transittider, samtsom flera andra åtgärder som hänför sig till bolus flöde och avslut. Identifiering av ytterligare translationell svälja parametrar beräknas som vi optimerar kapaciteten hos The LabScope.
Resultaten av denna studie visade att möss ta flera rytmiska slickar per svala under spontan drickande, med varje liten vätske bolus sekventiellt fylla vallecular utrymme innan triggsvalg svala. Detta beteende, vilket är typiskt för däggdjur som använder slickar som det primära sättet att intag vätska 37-40, liknar den rytmiska suga svälja mönster av mänsklig spädbarn svälja och alla spädbarn däggdjur i allmänhet. Infant svälja fysiologi präglas av flera rytmisk suger följt av en reflexiv svalg svälja, brukar beskrivas som den suger svälja cykel 37,41-43. Sålunda kan de rytmiska tungan och käken rörelser involverade i ingestive slick beteenden av möss vara mer jämförbar med ingestive sugande beteenden av humen spädbarn stället cup drickande av barn och vuxna. Vi har därför kvantifiera slicka takt och slicka svälja förhållande på möss för framtida jämförelser med suga betygsätta och suga svälja förhållandet mellan mänskliga spädbarn. Kanske murina VFSS forskning kommer att ge insikt i utvecklingssväljstörningar.
Som med alla nya forskningsmetoden, har förbättringsområden identifierats. Till exempel var det murina VFSS protokoll som utvecklats med hjälp av enbart C57 och C57 / SJL musstammar; Det har ännu inte testats på råttor. De observationskammare kommer att behöva skalas upp i storlek (diameter och längd) för att rymma den större kroppsstorlek hos råttor. Det är också okänt om chokladsmaksatta johexol är lämplig som en universell murin VFSS testlösning. Därför är större skala testa med flera stammar av möss och råttor befogat för detta ändamål. Dessutom bör användningen av barium som kontrastmedel för mus VFSS inte uteslutas. Möss tydligt föredrog iohexol recept över barium; Men mer rigorösa och systematiska försök att maskera den aversiva smak / lukt av barium kan ge välsmakande alternativ till johexol. Framtida studier som jämför effekterna av johexol och bariumsulfat (liksom andra potentiella orala kontrastmedel) på smakpreferens och svälja fysiologi hos möss och råttor skulle utan tvekan ge viktig information som är direkt relevant och translationell människors VFSS.
VFSS med människor omfattar flera konsistenser av livsmedel och flytande, och dysfagi är som mest uppenbar när man sväljer tunna vätskor och torra, fasta livsmedel 44,45. Den murina VFSS protokollet är därför utökas till att omfatta ytterligare konsistenser som kan underlätta upptäckt och kvantifiering av dysfagi i sjukdomsmodeller. Det kommer också att bli nödvändigt att genomföra tester av de flytande recept för murina VFSS viskositet för att justera viskositet för att matcha de som används vid mänsklig VFSS. Adresse dessa gränsheten kommer att underlätta identifieringen av translation VFSS biomarkörer för dysfagi som direkt kan jämföras mellan möss, råttor och människor.
Användbarheten av murina VFSS kan förbättras avsevärt genom att implantera radiopaka markörer i mjuka vävnadsstrukturer av sväljmekanismen som annars inte är synlig, därigenom tillåt undersökningar av biomekanik svälja. Detta tillvägagångssätt har använts med framgång i många år för att studera biomekanik för att svälja i modersmjölks grisar, med hjälp av ett sortiment av metallklämmor och ledningar 37,42. Vi förväntar oss att använda liknande, men mindre, markörer i möss skulle tillåta kvantifiering av flera ytterligare svälja parametrar för jämförelse med större däggdjur, inklusive människor. Vi håller på att utveckla metodik för att implantera röntgentäta markörer i tungan, mjuka gommen, svalg, struphuvud, och proximal matstrupen av möss för att testa denna hypotes.
Videon recording bildfrekvens på The LabScope och konventionella fluoroscopes är begränsad till 30 bilder per sekund (fps). Dock visade våra preliminära resultat att hela svalg skede av svälj för friska möss förekommer hos färre än 66 ms (dvs 2 frames), vilket är ungefär 10 gånger snabbare än människor. Således uppstår svalg fasen av svälj i möss så snabbt att detaljerna inte är märkbar med en 30 fps kamera. En högre bildhastighet (troligen> 100 fps) kommer att vara nödvändigt för att tillräckligt visualisera och kvantifiera de extremt snabba och komplexa rörelser svalgstadium svälja i möss och andra gnagare. I samband med en högre bildhastighet, som innehåller biplanar teknik för 3D röntgenavbildning skulle säkert utöka verktyget murina VFSS. Därför bör framtida överväganden design inkluderar en högre bildhastighet kamera och biplanar bildhanteringsfunktioner.
Slutligen har låg dos strålning visats orsaka sterilitet ikvinnliga C57-möss, vilket resulterar i förändrade nivåer av äggstocksstimulerade hormoner som kan förbrylla livslängd studier 46. Utfall avseende specifikt till effekterna av upprepad låg dos strålning i samband med VFSS testning har ännu inte undersökts hos möss, andra djur eller människor. Emellertid har äggstocksdysfunktion (inte relaterade till strålningsexponering) i humana honor kopplats till gastrointestinala motilitetsrubbningar, och specifikt till dysfagi i vissa fall 47, vilket ger ännu en varning att överväga när kommande VFSS studier som inkluderar kvinnor (djur och människor ). Uteslutande av honor bör undvikas, eftersom signifikanta könsskillnader i svala funktionen har rapporterats för folk 48,49 och skulle vara viktigt att upptäcka och karakterisera i djurmodeller samt. Därför utfall från longitudinella VFSS studier på möss och råttor av båda könen har en enorm translationell framkallande för människor i förhållande till dysphagia, liksom riskerna för låga doser strålning i samband med upprepad VFSS testning.
Disclosures
Open Access för denna artikel är sponsrad av Glenbrook.
Acknowledgments
Vi tackar nådigt ytterligare medlemmar av Lever Lab som bidrog till datainsamling (Andries Ferreira, Danarae Aleman, Alexis Mok, Kaitlin Flynn, Elizabeth Bearce och Matan Kadosh) och manuskript översyn (Andries Ferreira, Rebecca Schneider, och Kate Robbins). Vi erkänner också Roderic Schlotzhauer och Edwin Honse från MU Physics Machine Shop för sin design input och tillverkning av gnagare observationsrören används i denna studie. Vi är särskilt uppskattar Malea Jan Kunkel (Radiology Handledare i veterinärmedicin och kirurgi Institutionen vid University of Missouri - College of Veterinary Medicine) och Jan Ivey (chef för Research Animal Cath Lab vid University of Missouri - School of Medicine) för demonstration konstant tålamod och motivation medan rörelse de höga energi fluoroscopes som vi utvecklat murina VFSS protokollet. Finansieringskällor för denna studie ingår NIH / NIDCD (TE Lever), NIH / NINDS (GK Pavlath), Otolaryngonik - Head and Neck Surgery startpeng (TE Lever), MU PRIME fonden (TE Lever), Mizzou Advantage (TE Lever), och MU Center on Aging (TE Lever).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycarbonate tubing for observation chambers | McMaster-Carr | 3161T41 | Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall |
| Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 9115K71 | End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4" |
| Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 8574K281 | Peg-bowls for observation tubes |
| Silicone O-rings for end-caps of observation chambers | McMaster-Carr | 9396K108 | S1138 AS568-029, pack of 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r |
| Silicone stoppers for observation chambers | McMaster-Carr | 2903K22 | Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at |
| Centrifuge tubes for sipper tube bottles | Evergreen Scientific | 222-3530-G80 | 30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/ |
| Silcone stoppers for sipper tube bottles | Saint-Gobain Performance Plastics | DX263031-10 | Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack; http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS |
| Stopper borers for sipper tube bottles | Thomas Scientific | 3276G40 | Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt |
| Drinking tubes for sipper tube bottles | Ancare | TD-100 | 2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point |
| Iohexol for making oral contrast agent solution | GE Healthcare | 350 mg iodine per ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque |
|
| Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent | Herseys | ||
| 10 ml syringe for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 309604 | Luer lock tip syringe without needle, 100 per box http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp |
| Catheter tubing for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427451 | Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp |
| Needle for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427560 | 15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp |
| Delrin acetal resin rod for syringe delivery system | McMaster-Carr | 8576K15 | 1/2 inch diameter, black http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf |
| Acrylic sheeting for scissor lift | Ponoko | Laser cut http://www.ponoko.com |
|
| 3D printed ABS frame | Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri | ||
| Brass rods for scissor lift | Amazon | TTRB-03-12-03 | made into axles http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M |
| Drawer slide for scissor lift | Richelieu | 10292G116 | Attaches to base of scissor lift http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754 |
| 28BYJ-48 stepper motor for scissor lift | 2 each | ||
| ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift | Toshiba | ULN2003APG | Used as stepper drivers (2 each) |
| ATTINY85 microcontroller for scissor lift | Atmel | ATTINY85-20PU | 2 each http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html |
| Nylon spur gear | McMaster-Carr | 57655K34 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz |
| Nylon spur gear rack | McMaster-Carr | 57655K62 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9 |
| 4-40 nylon machine screws | McMaster-Carr | 95133A315 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q |
| 4-40 nylon hex nuts | McMaster-Carr | 94812A200 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29 |
| Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104 | McMaster-Carr | 9452K318 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7 |
References
- Shigemitsu, H., Afshar, K. Aspiration pneumonias: under-diagnosed and under-treated. Curr Opin Pulm Med. 13 (2), 192-198 (2007).
- Gresham, S. L. Clinical assessment and management of swallowing difficulties after stroke. Med J Aust. 153 (7), 397-399 (1990).
- Marik, P. E., Kaplan, D. Aspiration pneumonia and dysphagia in the elderly. Chest. 124 (1), 328-336 (2003).
- Marik, P. E.
- Logemann, J. A., Larsen, K. Oropharyngeal dysphagia: pathophysiology and diagnosis for the anniversary issue of. Diseases of the Esophagus. Dis Esophagus. 25 (4), 299-304 (2012).
- Logemann, J. A.
- Martin-Harris, B., Jones, B. The Videofluorographic Swallowing Study. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 19 (4), 769-785 (2008).
- Dietsch, A. M., Solomon, N. P., Steele, C. M., Pelletier, C. A. The effect of barium on perceptions of taste intensity and palatability. Dysphagia. 29 (1), 96-108 (2014).
- Stokely, S. L., Molfenter, S. M., Steele, C. M. Effects of barium concentration on oropharyngeal swallow timing measures. Dysphagia. 29 (1), 78-82 (2014).
- Harris, J. A., et al. The Use of Low-Osmolar Water-Soluble Contrast in Videofluoroscopic Swallowing Exams. Dysphagia. , (2013).
- Hillel, A., Miller, R. Bulbar Amyotrophic Lateral Sclerosis: Patterns of Progression and Clinical Management. Head & Neck. 11, 51-59 (1989).
- Russell, J. A., Ciucci, M. R., Hammer, M. J., Connor, N. P. Videofluorographic assessment of deglutitive behaviors in a rat model of aging and Parkinson disease. Dysphagia. 28 (1), 95-104 (2013).
- Lever, T. E., et al. An animal model of oral dysphagia in amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 24 (2), 180-195 (2009).
- Lever, T. E., et al. A mouse model of pharyngeal dysphagia in amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 25 (2), 112-126 (2010).
- Ciucci, M. R., et al. Tongue force and timing deficits in a rat model of Parkinson disease. Behavioural Brain Research. 222 (2), 315-320 (2011).
- Ciucci, M. R., Schaser, A. J., Russell, J. A. Exercise-induced rescue of tongue function without striatal dopamine sparing in a rat neurotoxin model of Parkinson disease. Behavioural Brain Research. 252, 239-245 (2013).
- Plowman, E. K., Kleim, J. A. Behavioral and neurophysiological correlates of striatal dopamine depletion: A rodent model of Parkinson’s disease. Journal of Communication Disorders. 44 (5), 549-556 (2011).
- Sugiyama, N., et al. A novel animal model of dysphagia following stroke. Dysphagia. 29 (1), 61-67 (2014).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Li, X., Beauchamp, G. K.
- Ishiwatari, Y., Bachmanov, A. A. NaCl taste thresholds in 13 inbred mouse strains. Chem Senses. 37 (6), 497-508 (2012).
- Pinhas, A., et al. Strain differences in sucrose- and fructose-conditioned flavor preferences in mice. Physiol Behav. 105 (2), 451-459 (2012).
- Midkiff, E. E., Bernstein, I. L. The influence of age and experience on salt preference of the rat. Dev Psychobiol. 16 (5), 385-394 (1983).
- Niimi, K., Takahashi, E. Differences in saccharin preference and genetic alterations of the Tas1r3 gene among senescence-accelerated mouse strains and their parental AKR/J strain. Physiol Behav. , (2014).
- Weijnen, J. A. Licking behavior in the rat: measurement and situational control of licking frequency. Neurosci Biobehav Rev. 22 (6), 751-760 (1998).
- Weijnen, J. A. Lick sensors as tools in behavioral and neuroscience research. Physiol Behav. 46 (6), 923-928 (1989).
- Kobayashi, M., et al. Electrophysiological analysis of rhythmic jaw movements in the freely moving mouse. Physiol Behav. 75 (3), 377-385 (2002).
- Dantas, R., et al. Effect of swallowed bolus variables on oral and pharyngeal phases of swallowing. 258, G675-681 (1990).
- Johnsson, F., Shaw, D., Gabb, M., Dent, J., Cook, I. Influence of gravity and body position on normal oropharyngeal swallowing. American Journal of Physiology. 35 (5), G653-G658 (1995).
- Han, T. T., Paik, N. -J., Park, J. W. Quantifying swallowing function after stroke: A functional dysphagia scale based on videofluoroscopic studies. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 82 (5), 677-682 (2001).
- Molfenter, S. M., Steele, C. M. Kinematic and temporal factors associated with penetration-aspiration in swallowing liquids. Dysphagia. 29 (2), 269-276 (2014).
- Kendall, K. A., McKenzie, S., Leonard, R. J., Goncalves, M. I., Walker, A. Timing of events in normal swallowing: A videofluoroscopic study. Dysphagia. 15, 74-83 (2000).
- Choi, K. H., Ryu, J. S., Kim, M. Y., Kang, J. Y., Yoo, S. D. Kinematic analysis of dysphagia: Significant parameters of aspiration related to bolus viscosity. Dysphagia. 26, 392-398 (2011).
- Molfenter, S. M., Steele, C. M. Variation in temporal measures of swallowing: Sex and volume effects. Dysphagia. 28, 226-233 (2013).
- Alves, L. M. T., Secaf, M., Dantas, R. Effect of a bitter bolus on oral, pharyngeal, and esophageal transit of healthy subjects. Arquivos de gastroenterologia. 50 (1), 31-34 (2013).
- Dalmazo, J., Aprile, L. R. O., Dantas, R. O. Esophageal contractions, bolus transit and perception of transit after swallows of liquid and solid boluses in normal subjects. Arquivos de gastroenterologia. 49 (4), 250-254 (2012).
- Kahrilas, P. J., Dodds, W. J., Hogan, W. J. Effect of peristaltic dysfunction on esophageal volume clearance. Gastroenterology. 94 (1), 73-80 (1988).
- German, R. Z., Crompton, A. W., Levitch, L. C., Thexton, A. J. The mechanism of suckling in two species of infant mammal: Miniature pigs and long-tailed macaques. Journal of Experimental Zoology. 261 (3), 322-330 (1992).
- Herring, S. W., Scapino, R. P.
- Gordon, K. R., Herring, S. W. Activity patterns within the genioglossus during suckling in domestic dogs and pigs: Interspecific and intraspecific. Brain, Behavior, and Evolution. 30 (5-6), (1987).
- Hiiemae, K. M., Palmer, J. B. Food transport and bolus formation during complete feeding sequences on foods of different initial consistency. Dysphagia. 14 (1), 31-42 (1999).
- Thexton, A. J., Crompton, A. W., German, R. Z. EMG activity in the hyoid muscles during pig suckling. Journal of Applied Physiology. 112, 1512-1519 (2012).
- Thexton, A. J., Crompton, A. W., German, R. Z. Transition from suckling to drinking at weaning: A kinematic and electromyographic study in miniature pigs. Journal of Experimental Zoology. 280 (5), 327-343 (1998).
- Goldfield, E. C., Richardson, M. J., Lee, K. G., Margetts, S. Coordination of sucking, swallowing, and breathing and oxygen saturation during early infant breast-feeding and bottle-feeding. Pediatric Research. 60 (4), 450-455 (2006).
- Ottaviano, F. G., Linhares Filho, T. A., Andrade, H. M., Alves, P. C., Rocha, M. S. Fiberoptic endoscopy evaluation of swallowing in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Braz J Otorhinolaryngol. 79 (3), 349-353 (2013).
- Inamoto, Y., et al. The effect of bolus viscosity on laryngeal closure in swallowing: kinematic analysis using 320-row area detector CT. Dysphagia. 28 (1), 33-42 (2013).
- Spalding, J. F., Thomas, R. G., Tietjen, G. L. Los Alamos National Laboratory. Rein, S. erene , Los Alamos, N.M. (1982).
- Palomba, S., Di Cello, A., Riccio, E., Manguso, F., La Sala, G. B. Ovarian function and gastrointestinal motor activity. Minerva Endocrinol. 36 (4), 295-310 (2011).
- Alves, L. M., Cassiani Rde,, Santos, A., M, C., Dantas, R. O. Gender effect on the clinical measurement of swallowing. Arq Gastroenterol. 44 (3), 227-229 (2007).
- Logemann, J. A., Pauloski, B. R., Rademaker, A. W., Kahrilas, P. J. Oropharyngeal swallow in younger and older women: videofluoroscopic analysis. J Speech Lang Hear Res. 45 (3), 434-445 (2002).
