Beredning och karakterisering av SDF-1α-Chitosan-Dextransulfat Nanopartiklar

Summary

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Abstract

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Introduction

Dextransulfat (DS) och kitosan (CS) är polysackarider med flera substituerade negativt laddade sulfatgrupper (i DS) eller positivt laddade amingrupper (deacetyleras CS). När det blandas i en vattenlösning, de två polysackariderna bildar polyelektrolytkomplex genom elektrostatiska interaktioner. De resulte komplexen kan bilda stora aggregat som kommer att fasa separeras från vattenlösningen (fällningar), eller små partiklar som är vattenspridbara (kolloider). De särskilda villkor som bidrar till dessa resultat har studerats, och har sammanfattats och illustreras i detalj i en senaste omdömet ^1. Bland dessa villkor, är de motsatt laddade polymerer måste 1) har signifikant olika molmassa två grundläggande krav för att producera vatten dispergerbara partiklar; och 2) blandas i ett icke-stökiometriskt förhållande. Dessa villkor kommer att tillåta laddningsneutrala komplex polymera segment som genereras av laddningneutralisering att segregera och bilda kärnan av partikeln, och överskottet av polymeren för att bilda det yttre skalet ^1. De glycan partiklar som beskrivs i detta protokoll är avsedda för pulmonell leverans, och är utformade för att vara netto negativt laddat, och av nanometerdimensioner. Den negativa ytladdningen minskar sannolikheten för cellulärt upptag av partiklarna ^2,3. Partiklar av nanometer dimension underlättar passagen genom de distala luftvägarna. För att uppnå detta mål, är mängden DS används i denna beredning överstigande CS (viktförhållande 3: 1); och hög molekylvikt DS (viktmedelmolekylvikt 500.000) och låg molekylvikt CS (MW intervall 50-190 kDa, 75-85% deacetylerat) används.

SDF-1α är en stamcellsmålsökande faktor, som utövar den målsökande funktion genom sin kemotaktisk aktivitet. SDF-1α spelar en viktig roll i homing och underhåll av hematopoietiska stamceller i benmärgen, och i rekryteringen av progeNitor celler till den perifera vävnaden för skador reparation ^4,5. SDF-1α har en heparinbindande ställe i dess proteinsekvens, som gör det möjligt för proteinet att binda till heparin / heparansulfat, dimerer, skyddas från proteas (CD26 / DPPIV) inaktivering, och interagera med målceller via cellytreceptorer ^6-8. DS har liknande strukturella egenskaper som heparin / heparansulfat; sålunda, bindningen av SDF-1α DS skulle vara liknande den i dess naturliga polymera ligander.

I följande protokoll, beskriver vi framställningen av SDF-1α-DS-CS nanopartiklar. Rutinerna utgör en av de formuleringar som tidigare har studerat ^9. Protokollet är ursprungligen anpassad från en undersökning av VEGF-DS-CS nanopartiklar ^10. En liten skala framställning beskrivs, som lätt kan skalas upp med samma förrådslösningar och framställningsbetingelser. Efter beredning, är partiklarna karaktäriseras by undersöka deras storlek, zeta-potential, omfattningen av SDF-1α inkorporering, in vitro frigöra tid, och aktiviteten hos det inkorporerade SDF-1α.

Protocol

1. Beredning av SDF-1α Glycan Nanopartiklar På grund av syftet med in vivo-leverans, sterilisera alla behållare, pipetter och tips som används vid framställningen. Bered följande förrådslösningar i ultrarent vatten: 1% dextransulfat; 1 M NaOH (sterilfiltreras med PES-membran); 0,1% kitosan i 0,2% isättika (filtrering genom 0,8 och 0,22 ^ m filter efter varandra och justera pH till 5,5 med NaOH efteråt); 0,1 M ZnSO 4; 15% mannitol; och 0,92 mg / ml SD…

Representative Results

Storleken och zeta-potentialen för de framställda SDF-1α-DS-CS partiklarna bestäms med en partikelanalysator. Figur 1 visar en analys av mätningen av storleken. Från kumulanter resultaten erhållna från fyra upprepade mätningar, är den genomsnittliga hydrodynamiska diametern hos de SDF-1α-DS-CS-partiklar 661 ± 8,2 (nm) och polydispersiteten är 0,23 ± 0,02. Resultatet av zetapotentialmätning visas i figur 2. Av de fem upprepade mätningar, är zeta-potentialen för de SDF-1…

Discussion

Såsom nämnts ovan är de DS-CS nanopartiklar bildade genom laddningsneutralisering mellan polyanjon (DS) och polykatjonkomplex (CS) molekyler. Eftersom laddningsinteraktion sker lätt under den molekylära kollision, är koncentrationen av polymerlösningarna och omrörningshastigheten under blandning kritisk för storleken av de resulterande partiklarna. En generell trend är att fler utspädd DS och CS-lösningar ¹⁵ och högre omrörningshastighet resulterar i mindre partiklar.

<p class="jove_content"…

Materials

Name	Company	Catalog number
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 um.	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738