Introduction
Dextransulfat (DS) och kitosan (CS) är polysackarider med flera substituerade negativt laddade sulfatgrupper (i DS) eller positivt laddade amingrupper (deacetyleras CS). När det blandas i en vattenlösning, de två polysackariderna bildar polyelektrolytkomplex genom elektrostatiska interaktioner. De resulte komplexen kan bilda stora aggregat som kommer att fasa separeras från vattenlösningen (fällningar), eller små partiklar som är vattenspridbara (kolloider). De särskilda villkor som bidrar till dessa resultat har studerats, och har sammanfattats och illustreras i detalj i en senaste omdömet 1. Bland dessa villkor, är de motsatt laddade polymerer måste 1) har signifikant olika molmassa två grundläggande krav för att producera vatten dispergerbara partiklar; och 2) blandas i ett icke-stökiometriskt förhållande. Dessa villkor kommer att tillåta laddningsneutrala komplex polymera segment som genereras av laddningneutralisering att segregera och bilda kärnan av partikeln, och överskottet av polymeren för att bilda det yttre skalet 1. De glycan partiklar som beskrivs i detta protokoll är avsedda för pulmonell leverans, och är utformade för att vara netto negativt laddat, och av nanometerdimensioner. Den negativa ytladdningen minskar sannolikheten för cellulärt upptag av partiklarna 2,3. Partiklar av nanometer dimension underlättar passagen genom de distala luftvägarna. För att uppnå detta mål, är mängden DS används i denna beredning överstigande CS (viktförhållande 3: 1); och hög molekylvikt DS (viktmedelmolekylvikt 500.000) och låg molekylvikt CS (MW intervall 50-190 kDa, 75-85% deacetylerat) används.
SDF-1α är en stamcellsmålsökande faktor, som utövar den målsökande funktion genom sin kemotaktisk aktivitet. SDF-1α spelar en viktig roll i homing och underhåll av hematopoietiska stamceller i benmärgen, och i rekryteringen av progeNitor celler till den perifera vävnaden för skador reparation 4,5. SDF-1α har en heparinbindande ställe i dess proteinsekvens, som gör det möjligt för proteinet att binda till heparin / heparansulfat, dimerer, skyddas från proteas (CD26 / DPPIV) inaktivering, och interagera med målceller via cellytreceptorer 6-8. DS har liknande strukturella egenskaper som heparin / heparansulfat; sålunda, bindningen av SDF-1α DS skulle vara liknande den i dess naturliga polymera ligander.
I följande protokoll, beskriver vi framställningen av SDF-1α-DS-CS nanopartiklar. Rutinerna utgör en av de formuleringar som tidigare har studerat 9. Protokollet är ursprungligen anpassad från en undersökning av VEGF-DS-CS nanopartiklar 10. En liten skala framställning beskrivs, som lätt kan skalas upp med samma förrådslösningar och framställningsbetingelser. Efter beredning, är partiklarna karaktäriseras by undersöka deras storlek, zeta-potential, omfattningen av SDF-1α inkorporering, in vitro frigöra tid, och aktiviteten hos det inkorporerade SDF-1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av SDF-1α Glycan Nanopartiklar
På grund av syftet med in vivo-leverans, sterilisera alla behållare, pipetter och tips som används vid framställningen.
- Bered följande förrådslösningar i ultrarent vatten: 1% dextransulfat; 1 M NaOH (sterilfiltreras med PES-membran); 0,1% kitosan i 0,2% isättika (filtrering genom 0,8 och 0,22 ^ m filter efter varandra och justera pH till 5,5 med NaOH efteråt); 0,1 M ZnSO 4; 15% mannitol; och 0,92 mg / ml SDF-1α (förvaras i portioner vid 80 ° C, och hölls vid 4 ° C en gång tinats).
- Sterilisera stamlösningar via 0.22 um filtermembran. Bedöm endotoxinnivåer i den beredda lösningen med limulus amebocytlysat (LAL) gel trombanalys. Se till att nivåerna är <0,06 EU / ml.
- Lägg 0,18 ml ultrarent vatten till en 1,5 ml glasampull, som innehöll en magnetisk omrörarstav. Ställ in omrörningshastigheten vid 800 rpm. Lägg 0,1 ml 1%dextransulfat och rör om under 2 min. Lägg 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml av 0,92 mg / ml SDF-1α lösning) och rör om under 20 minuter.
- Lägg 0,33 ml 0,1% kitosan droppvis och rör om under 5 min. Byt rör hastighet till max och tillsätt 0,1 ml 0,1 M ZnSO 4 långsamt med en 0,1 ml spruta (över 1 min).
- Återgå omrörningshastigheten till 800 varv per minut och rör om under 30 minuter. Lägg 0,4 ml 15% mannitol och rör om under 5 min. Överför reaktionsblandningen till en 1,5 ml mikrofugrör. Centrifugera vid 16000 xg vid 4 ° C under 10 min.
Anm: Närvaron av mannitol underlättar resuspension av partiklarna efter centrifugering. Beroende på kompakthet pelleten, kan mannitol koncentrationen varieras från 0% till 5%. Komplett resuspension av partiklarna efter varje centrifuge är avgörande för att undvika aggregat i slut fjädring. - Sug ut supernatant och använd en pipett för att ta bort den sista droppe vätska långsamt. Lägg 0,2 ml 5% mannitol. Häng pelleten med en 0,5 ml, 29 G needle spruta. Tillsätt 1 ml 5% mannitol. Centrifugera vid 16000 xg under 15 min.
- Upprepa steg 1.6.
- Aspirera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 0,2 ml 5% mannitol. Förvara partikelsuspensionen vid 4 ° C.
Obs: Den partikelsuspension kan också lagras frysta vid -80 ° C eller lyofiliseras. Inklusive 5% mannitol i suspensionen är viktigt att förhindra aggregering av partiklarna efter frysning och upptining eller efter frystorkning och rehydrering. Mannitol kan avlägsnas genom centrifugering av suspensionen efter lagring.
2. Mätning av partikelstorlek och zeta-potential
Partikelstorlek och zeta potential analyseras genom dynamisk ljusspridning och elektroljusspridning, respektive med en partikel analysator som anges i materiallistan.
- Ställ in följande parametrar för partikelstorleksmätning: Ackumulering tider: 70; Upprepa tider: 4; Temperatur: 25 ° C;Spädmedel: vatten; Intensitet justering: auto.
- Späd SDF-1α-DS-CS provet med vatten (10-faldig utspädning). Load 100 pl av provet på en engångs UV kyvett såsom en Eppendorf kyvett. Sätt i kyvetten i kyvetthuset. Vänta justeringen intensiteten för att nå "Optimal" (~ 10.000 cps). Starta datainsamling.
- När mätningen är klar, registrera kumulanter resultaten av diameter (nm) och polydispersitetsindex. Medelvärdet för resultaten som erhållits från var och en av de fyra upprepade avläsningar och beräkna standardavvikelsen.
- Belastning 500 pl av 10-faldigt utspätt prov partikel till en flödescell för zetapotentialmätning. Ställ in följande parametrar för mätning: Ackumulering tider: 10; Upprepa tider: 5; Temperatur: 25 ° C; Spädmedel: vatten; Intensitet justering: auto. Registrera resultaten av zeta-potentialen (mV). Genomsnitt resultatet av varje av de fem upprepade avläsningar, och beräkna standard deviation.
3. Kvantifiering av SDF-1α i partiklarna
- Späd fri form SDF-1α till koncentrationer av 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, och 0,05 mg / ml i 1,3x Laemmli provbuffert. Späd 6 il SDF-1α-DS-CS prover med 40 | il 1,3x Laemmli provbuffert. (Förbered 4x Laemmli lager buffert innehållande 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glycerol, 0,05 mg / ml bromfenolblått, och 8% 2-merkaptoetanol. Dividera förrådslösningen i små alikvoter och hålla vid -20 ° C för engångsbruk.)
- Värm proverna vid 100 ° C under 10 min. Vortex proverna två gånger (var 10 sekunder vid maximal hastighet) under uppvärmningstiden 10 minuter för att dissociera partiklarna helt. Svalka proverna till RT i 2 min. Centrifugera vid 10000 xg under 0,5-1 minuter för att få ner vattenkondensatet. Vortex igen för att blanda väl.
Notera: Vid denna punkt, bör provlösningen vara klar utan synlig fällning närvarande. - Load 10 &# 181; l prov / brunn till en 4-20% SDS-gel. Kör elektrofores vid 200 V i 20 min. Fläck gelén med Coomassie blue-protein-färgning.
- Undersök proteinbandet tätheten av SDF-1α använder en molekylär kameran och densitometri analysprogram. Beräkna kvantiteten av SDF-1α i partiklarna mot en standardkurva konstruerad med fria SDF-1α standarder.
4. In vitro-frisättningsanalys
- Blanda SDF-1α glycan partiklar med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning utan kalcium och magnesium (D-PBS) vid en 1: 1-förhållande (vol / vol).
- Dividera partikelsuspensionen in i 0,05 ml alikvoter i 1,5 ml rör. Ladda proverna till botten av rören. Undvik att införa luftbubblor eller störa vätskeytan. Täta toppen av rören med Parafilm.
OBS: I samband med detta, kommer vätskan att förbli på botten under den efterföljande topp-till-botten rotation på rörets biandaren. - Rotera rören vid 37 &# 176; C på en roterande Micro-Tube Mixer. Avlägsna alikvoter från rören på de anvisade tider och centrifugera omedelbart proverna vid 16.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Separera supernatanterna och pellets, och rekonstruera pelleten med 0,05 ml D-PBS. Förvara proverna vid -20 ° C. När alla prover samlas, undersöka supernatanterna och pelletar på en SDS-gel såsom beskrivits ovan.
5. Migration Assay
Denna analys mäter kemotaktiska aktiviteten av SDF-1α. Interaktion av SDF-1α med dess receptor (CXCR4) på cellytan förorsakar migrering av cellen mot SDF-1α-gradient. I denna analys är cellerna laddas in i en övre brunnen (separerade med ett semipermeabelt membran från en lägre brunn) och SDF-1α lösningen i en undre brunnen.
- Späd SDF-1α (fri eller partikelbunden form) med migrationsbuffert (RPMI-1640-medium innehållande 0,5% bovint serumalbumin) i en 3-fold seriespäd till slutkoncentrationer av 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 och 0,05 ng / ml.
- Lägg 0,6 ml av den utspädda SDF-1α lösning eller migrationsbuffert enbart (negativ kontroll) till en brunn i den 24-brunnar. Lägg 0.57 ml migrationsbuffert till en brunn (ingångscellkontroll). Inkubera vid 37 ° C under 30 minuter. Placera en genomsläpplig cellodlingsinsats som Transwell (porstorlek 5 pm, diameter 6,5 mm) ovanpå den nedre väl. Belastning 0,1 ml Jurkat-celler (5 x 10 5) in i Transwell insert. Ladda 0.03 ml celler direkt till ingångscellen kontrollbrunnen. Inkubera plattan vid 37 ° C under 2 h i en 5% CO2 inkubator.
- Ta bort Transwell skär. Överför de celler som har migrerat till de undre brunnarna till en 4 ml polystyrenrör. Räkna de migrerade cellerna med en flödescytometer.
- Beräkna migration i procent av den ingående cellnummer (cell nummer i inmatningscellen kontrollbrunnen x 100/30) efter subtraktion av numren i negatIve kontroller (celler migrerade till brunnarna innehåller endast migrationsbuffert).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Storleken och zeta-potentialen för de framställda SDF-1α-DS-CS partiklarna bestäms med en partikelanalysator. Figur 1 visar en analys av mätningen av storleken. Från kumulanter resultaten erhållna från fyra upprepade mätningar, är den genomsnittliga hydrodynamiska diametern hos de SDF-1α-DS-CS-partiklar 661 ± 8,2 (nm) och polydispersiteten är 0,23 ± 0,02. Resultatet av zetapotentialmätning visas i figur 2. Av de fem upprepade mätningar, är zeta-potentialen för de SDF-1α-DS-CS-partiklar -24,8 ± 0,5 mV. Såsom nämnts ovan, är närvaron av 5% mannitol i SDF-1α-DS-CS partikelsuspension väsentlig för förhindrande av partikelaggregation under ett frysning och tining processen. Figur 3 visar storleken mätning av partiklar som är suspenderade i vatten och frystes vid -80 ° C. En distinkt aggregering topp är synlig efter upptining.
Den amount av SDF-1α i SDF-1α-DS-CS-partiklar uppskattas genom SDS-gelelektrofores. Figur 4A visar en Coomassie blue-färgad SDS-gel med SDF-1α standarder, DS-CS nanopartikel (kontrollpartiklar utan SDF-1α inkorporering Ctrl NP) och SDF-1α-DS-CS nanopartikel (SDF-1α NP) prover laddade. En standardkurva konstrueras från analysen av SDF-1α standardband (fig 4B) densitet. Beräkning från standardkurvan indikerar att SDF-1α koncentrationen i SDF-1α NP provet är 0.03 mg / ml (genomsnitt av duplikat). Eftersom utspädning av provet med provbufferten är (6 + 40) / 6, är den ursprungliga provkoncentration 0,23 mg / ml. Eftersom den slutliga volymen av beredningen partikeln är 0,2 ml, är total SDF-1α i den slutliga suspensionen 0,046 mg. Med tanke på ingångs massan av SDF-1α i reaktionsblandningen är 0,08 mg, den inneslutningseffektiviteten av SDF-1α i DS-CS-partiklar är 57%. ChitOsan har tidigare rapporterats att färga med Coomassie-blått. Färgningen är emellertid inte signifikant i gelén visas i figur 4A. Det är, kanske, relaterad till mängden av kitosan (partikelmatrisen) laddades på gelén. I varje fall är det nödvändigt med en fullständig dissociation och separation av SDF-1α från partikelmatrisen för att noggrant bedöma mängden av det införlivade proteinet. Denna gel visar också att SDF-1α inte detekterbart nedbrytes genom upphettning vid 100 ° C under 10 min eller genom virvelprocessen, eftersom inga band finns mellan SDF-1α proteinband och färgämnesfronten.
Den in vitro-frisättningshastighet av SDF-1α från nanopartiklarna bestäms genom inkubering av partiklarna i 50% D-PBS vid 37 ° C under 7 dagar. Vid 0 tim, 3 tim, 8 timmar, 24 timmar, 48 timmar, och 7 dagar, är delmängder av proverna avlägsnas och omedelbart centrifug. Det frisatta SDF-1α (i supernatanten) separeras från den partikelbundna SDF-1α (pellet). Proverna körs på en SDS-gel, och mängden av SDF-1α i supernatanterna och pelletarna bestämdes genom Coomassie-färgning och densitometri analys. En typisk SDS-gel av analysen visas i Figur 5. Som visats, är partikeln bunden SDF-1α minimalt frisatt efter en 7-dagars inkubation.
Aktiviteten av partikelbundna SDF-1α mäts av en analys migrering (kemotaktisk analys), och jämfördes med den för fri SDF-1α. I denna analys är SDF-1α i DS-CS nanopartiklar serieutspäddes med en migrationsbuffert, och inkuberades med Jurkat-celler under 2 h. De migrerade cellerna räknades med en flödescytometer. Data (med SDF-1α koncentrationer av 0,05-11 ng / ml) är plottade med icke-linjär regressionspassning, och EG-50 beräknas. Såsom visas i fig 6, den partikelbundna SDF-1α inducerade samma grad av migrering som den hos fri SDF-1 ^5; vid alla koncentrationer mättes. De EG 50 värdena för de fria och partikelbundna formerna av SDF-1α är 0.55 och 0.45 ng / ml.
Figur 1. Analys skärmbild visar dynamisk ljusspridning mätning av partikelstorlek. De översta två panelerna visar tomter av autokorrelationsfunktionen, G2 (τ), och logaritmen av [G2 (τ) -1] över tiden. Instrumentets digital signalprocessor (korrelator) uttrycker den detekterade ljusintensiteten som funktion av fördröjningstiden (τ). Handlingen visar att SDF-1α-DS-CS-partiklar orsakade en exponentiellt avtagande av intensiteten mellan 0,2-2 ms. För att få den genomsnittliga sönderfallskonstant <Γ>
Figur 2. Analys skärmbild visar elektroljusspridningmätning av partikel zeta-potential. visar Den övre panelen en G2 (τ) över tid tomt. Den gradvis avklingande oscillerande Funktionen används typiskt observeras i laddade partiklar som utsätts för elektrofores och ljusspridning. Funktionen speglar frekvensskiftet (dopplerförskjutning) som orsakas av de rörliga partiklarna i det elektriska fältet. En Fourier-transformation av G2 (τ) ger effektspektrumet (intensitet-mot-frekvenskurva) visas i den mellersta panelen. I mitten av frekvensskifttoppen definierar mobilitet av partiklarna, som zeta-potentialen beräknas. Den beräknade zeta-potential visas längst ner på skärmen.
Figur 3. Partikelstorlek mätning av SDF-1 α-DS-CS-partiklar efter frysning och upptining i vatten. I avsaknad av mannitol, partiklarna bildar aggregates efter nedfrysning och upptining. Notera bildningen av en extra intensitet / storlek topp och ökningen av kumulanter diameter och polydispersitet jämfört med den i fig 1.
Figur 4. Kvantifiering av SDF-1 α inkorporering i DS-CS nanopartiklar. (A) Fotografi av Coomassie-färgade SDS-gel laddad med gratis SDF-1α standarder, DS-CS nanopartikel (Ctrl NP), och SDF-1α-DS- CS nanopartikel (SDF-1α NP) prover som anges. SDF-1α proteinband och gelen kör färgfronten är markerade. De Ctrl NP proven inte färgas med Coomassieblått och kitosan banden (bred) är vagt synliga. (B) Banden analyseras med en densitometer, från vilken standardkurva konstrueras med de fria SDF-1α standarder (genomsnitt av tillåten kopieringte). Mängden SDF-1α i nanopartiklarna är beräknad mot standardkurvan, vilket ger ett medelvärde av 0,3 ng / brunn (10 | il).
Figur 5. SDS-gel som visar SDF-1 α frisättning in vitro tidsförloppet. Coomassie-färgad SDS-gel visar mängden frisatt SDF-1α (i supernatanter) och bunden SDF-1α (i pelletar) efter inkubation av SDF-1α-DS -CS nanopartiklar vid 37 ° C för olika tidsperioder. Åter tryckt med tillstånd från 9.
Figur 6. Dos-responskurvor för SDF-1 α (cirklar) och SDF-1α nanopartikel (NP) (kvadrater) i en Jurkat cellmigrationsassay. SDF-1α i både fri och nanopartiklar bundna förms uppvisade samma aktivitet med EG 50 värden av 0,55 och 0,45 ng / ml. Åter tryckt med tillstånd från 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Såsom nämnts ovan är de DS-CS nanopartiklar bildade genom laddningsneutralisering mellan polyanjon (DS) och polykatjonkomplex (CS) molekyler. Eftersom laddningsinteraktion sker lätt under den molekylära kollision, är koncentrationen av polymerlösningarna och omrörningshastigheten under blandning kritisk för storleken av de resulterande partiklarna. En generell trend är att fler utspädd DS och CS-lösningar 15 och högre omrörningshastighet resulterar i mindre partiklar.
Formuleringen av SDF-1α glycan nanopartiklar kan varieras. Till exempel, belopp och förhållandena av SDF-1α / DS / CS används i detta protokoll är 0,08 / 0,33 / 1 (mg / mg / mg), respektive. Beroende på den avsedda användningen av SDF-1α nanopartiklar, kan dessa förhållanden förändras. Om mängden av SDF-1α till blandningen är 0,04 mg (0,04 / 0,33 / 1, mg / mg / mg) i stället för 0,08 mg, kommer partiklarna att vara mindre, ~ 650 nm, och SDF-1α inneslutningseffektiviteten något greater, 70-80% 9. Emellertid, när de levereras in vivo, kommer en större mängd av glykan matrisen vara närvarande per SDF-1α. Om en mindre partikelstorlek önskas kan formuleringen av SDF-1α glycan nanopartiklar ytterligare modifieras. Ett alternativ är att använda en mindre molekylvikt kitosan, såsom visats i Ref 15. Det bör dock noteras, har att chitosan en hög affinitet för endotoxin (negativt laddade lipopolysackarider); alltså, är nödvändig för användning av kitosan produkter innan in vivo-leverans ett test av endotoxin nivå eller potentiellt en rening. Det andra alternativet är att ladda SDF-1α på förformad små DS-CS nanopartiklar. Eftersom den senare kan manipuleras lättare i partikelstorlek och SDF-1α har en hög affinitet för DS, att ladda en liten mängd av SDF-1α till det yttre skalet av DS-CS-partiklar kan resultera i mindre partiklar.
Jämfört med andra typer avnanopartiklar (t.ex. PLGA 11, polyanhydrid 12 eller gelatin 13 nanopartiklar), DS-CS nanopartiklar har speciella fördelar och begränsningar. De stora fördelarna med DS-CS nanopartiklar är: 1) preparatet partikeln inte involverar organiska lösningsmedel eller kraftig ultraljudsbehandling. Det är därför lämpligt för proteinfaktor inkorporering, så skonsam preparatet minskar sannolikheten för proteininaktive; 2) matrisen av partiklarna har en liknande strukturell egenskap som extracellulär matris, vilket gör partiklarna kompatibla med vävnadsmiljön och är mindre toxisk och inflammatorisk; och 3) glykan partikelbundna SDF-1α efterliknar en naturlig bindningsförhållande mellan proteinet och den extracellulära matrisen, vilket förklarar den fulla kemotaktiska aktiviteten av SDF-1α efter att införlivas i de glycan partiklarna. Den fullt aktiva SDF-1α i partikelbunden form gör att den kan fungera som en stationär målsökande faktor i vävnads eILJÖ. Begränsningarna hos DS-CS nanopartiklar är: 1) diametrarna hos partiklarna är i allmänhet större än de ovan nämnda partiklar; och 2) lätt kollapsa i saltlösningar, vilket kanske inte är lämpliga för direkt injektion i blodcirkulationen.
Den partikelbunden SDF-1α befinns vara minimalt frigöras från nanopartiklarna efter en sju dagars inkubation. Detta fenomen är relaterat till den höga affiniteten av SDF-1α för heparin, vilket också bidrar till dess funktion in vivo. Eftersom proteiner med heparinbindande domäner i allmänhet har olika affinitet för heparin, kommer deras release hastigheter sannolikt skiljer. Till exempel i en VEGF 165 -DS-CS nanopartikel framställd på ett liknande formulering, var 44% av det inkorporerade VEGF 165 släpps i den första timmen och 29% släpptes i nästa 47 timmar under inkubation vid 37 ° C 14. Därför frisläppandet mönstret för en specifik prot in vitroein måste testas individuellt.
Syftet med förberedelserna av SDF-1α-DS-CS nanopartiklar är att leverera SDF-1α till lungan och etablera en stamcellsmålsökande signal i vävnaden. Partiklarna kan också levereras till andra vävnader för samma ändamål, även om de speciella nanopartikelformat inte krävs för fast vävnads injektion. Det faktum att SDF-1α stabiliseras av DS i nanopartikelmatrisen och är minimalt frigörs från partiklarna stöder stem principer cellrekrytering och partikeln förväntas vara fördelaktigt för vävnadsregenerering.
Eftersom protein-glykan nanopartiklar har en liknande matris med den hos glykosaminoglykaner cellytan och extracellulär matris, är det möjligt att partikel-inkorporerade proteiner kan bytas in i dessa matriser (De negativt laddade extracellulära matrismolekyler kan konkurrera med bindningen av den positivt laddat protein) in vivo in vitro karaktärisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag: HL671795, HL048743 och HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 | |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | ||
| Syringe filter, PES membrane 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | ||
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 | |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
