Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה

Published: February 3, 2015 doi: 10.3791/52335
Automatic Translation
*1, 1, *1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Introduction

בשלושים השנים האחרונות, טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) הפכה לכלי הכרחי קליני באבחון ובטיפול בסרטן. נוגדנים כבר מזמן נחשבים וקטורים מבטיחים עבור המשלוח של רדיואיזוטופים פולטות פוזיטרונים לגידולים בשל זיקתם המעודנת והספציפיות לסמנים לסרטן. 1,2 הפרמקוקינטיקה עם זאת, איטית יחסית in vivo של נוגדנים מחייבת שימוש ברדיואיזוטופים עם multi-יום מחצית חיים פיזיים. שילוב זה יכול להניב מינוני קרינה גבוהה לאיברים שאינם היעד של חולים, סיבוך חשוב שיש משמעות קלינית בפרט מאז radioimmunoconjugates מוזרק לוריד ולכן - בניגוד סריקות CT הגוף חלקיים - תוצאה במינונים שקועים בכל חלק של הגוף, ללא קשר לרקמות נחקרו.

כדי לעקוף בעיה זו, מאמץ משמעותי הוקדשה לdevelopment של אסטרטגיות ההדמיה PET שלנתק את הרדיו-איזוטופי ומחצית המיקוד, וכך למנף את מאפייני יתרון של נוגדנים תוך עוקפים בו-זמנית מגבלות pharmacokinetic הפנימיות שלהם. אסטרטגיות אלה - לרוב מכונות pretargeting או מיקוד רב שלבי - בדרך כלל להעסיק ארבעה שלבים: (1) מתן נוגדן מסוגל להיקשר גם אנטיגן וradioligand; ההצטברות של הנוגדן ברקמת המטרה והפינוי שלה מהדם (2); (3) הניהול של radioligand מולקולה קטנה; ו- (4) קשירת in vivo של radioligand לנוגדן ואחרי הפינוי המהיר של radioligand העודף. 3-8 בחלק מהמקרים, סולק נוסף מוזרקת בין השלבים 2 ו -3 כדי להאיץ את ההפרשה של כל נוגדן שעדיין לא מחייבים את הגידול ונשאר בדם. 5

באופן כללי, twסוגי o אסטרטגיות pretargeting הם נפוצים ביותר בספרות. בעוד שני הוכיחו מוצלחים במודלים פרה, הם גם בעלי מגבלות עיקריות שמנעו היישום הקליני שלהם. האסטרטגיה הראשונה מסתמכת על הזיקה הגבוהה בין נוגדני streptavidin מצומדות- וradiolabels-שונה ביוטין; עם זאת, immunogenicity של הנוגדנים-שונה streptavidin הוכיח להיות בעיה מדאיגה בכל קשור לתרגום. 5,6,9,10 האסטרטגיה השנייה, לעומת זאת, מעסיקה נוגדני bispecific כי כבר-מהונדס גנטי כדי לאגד את שני סרטן אנטיגן הסמן הביולוגי וhapten radiolabeled מולקולה קטנה. 3,11-14 בעוד המסלול אחרון זה בהחלט יצירתי, תחולתו הרחבה הוא מוגבלים על ידי מורכבות, חשבון, וחוסר המודולריות של המערכת.

לאחרונה, פיתחנו ופרסמנו מתודולוגיה ההדמיה PET pretargeted מבוססים על ביקוש האלקטרון ההפוך דילס-Alder (אניאדה) תגובת cycloaddition בין -cyclooctene טרנס (TCO) וtetrazine (טז;. איור 1) 11 בעוד התגובה עצמו כבר ידוע במשך עשרות שנים, הכימיה IEDDA חוותה רנסנס בשנים האחרונות כטכניקת bioconjugation כימיה לחץ, כפי שמודגם על ידי העבודה המרתקת של הקבוצות של ראלף Weissleder, יוסף פוקס, ופיטר Conti בין יתר. 12-15 cycloaddition IEDDA יושם במגוון רחב של הגדרות, כולל הדמיה הקרינה עם פפטידים, נוגדנים, וחלקיקים, כמו גם הדמיה גרעינית . עם שני radiohalogens וradiometals 16-26 קשירה היא גבוהה מניב, נקייה, מהירה (k 1> 30,000 M -1 שניות -1), סלקטיבי, ו-- ביקורתי -. Bioorthogonal 27 ובעוד מספר סוגים של כימיה לחץ - כולל cycloadditions-זרז Cu-אזיד alkyne, cycloadditions אזיד-alkyne-קידם מתח, וStaudinger ligations -. גם הוא bioorthogonal, זה שילוב הייחודי של קינטיקה מהירה תגובה וbioorthogonality שעושה כימיה IEDDA גם כך מתאים לpretargeting יישומים בכל האורגניזמים 28,29 לאורך שורות אלה, חשוב לשים לב כי לאחרונה דווח משלנו מעבדות לא היו הראשונה ליישם כימיה IEDDA לpretargeting: הדו"ח הראשון של הדמיה pretargeted עם IEDDA נבעו מהעבודה של Rossin, et al והשתתפות מתודולוגיה SPECT העסקת 111 tetrazine שכותרתו ב- 30..

כפי שהזכרנו לעיל, יש מתודולוגיה pretargeting ארבעה צעדים פשוטים למדי (איור 2). בפרוטוקול ביד, אסטרטגית pretargeted להדמית PET של סרטן מעי גס שמעסיקה radioligand 64 שכותרתו Cu-NOTA tetrazine והמצומד שונה-TCO של נוגדן huA33 תתואר. עם זאת, בסופו של המודולריות של מתודולוגיה זו היא אחת מגרנכסי eatest, כמחצית -cyclooctene טרנס יכולים להיות מצורפים לכל נוגדן שאינה הפנמה, וtetrazine יכול להיות מחובר למגוון רחב של כתבים רדיואקטיביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מסר של אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים in vivo תיארו בוצעו על פי פרוטוקול שאושר ולפי ההנחיות האתיות של Memorial Sloan Kettering Cancer Center המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC).

1. סינתזה של TZ-BN-NOTA

  1. בכלי תגובה קטנים, לפזר 7 מ"ג NH 2 -Bn-NOTA (1.25 x 10 -2 mmol) ב600 NaHCO 3 חיץ μl (0.1 מ ', pH 8.1). בדוק את ה- pH של התמיסה. במידת צורך, להתאים את ה- pH של התמיסה ל -8.1 באמצעות aliquots הקטן של 0.1 M Na 2 CO 3.
  2. מוסיף את פתרון -Bn-NOTA NH 2 ל -0.5 מ"ג TZ-NHS (1.25 x 10 -3 mmol) בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge.
    הערה: אם אפשר לשקול TZ-NHS החוצה יבש או הגיע מפתרון מניות של DMF היבש או DMSO (<50 μl).
  3. אפשר פתרון התגובה וכתוצאה מכך להגיב למשך 30 דקות ב RTעם תסיסה עדינה.
  4. לאחר 30 דקות, לטהר את המוצר באמצעות הפוך-שלב כרומטוגרפיה 18 HPLC C כדי להסיר NH unreacted 2 -Bn-נוטה. ניתן לנטר NH 2 -Bn-NOTA באורך גל של 254 ננומטר, ואילו TZ-NHS וTZ-BN-NOTA נמצאים תחת פיקוח הטוב ביותר באורך גל של 525 ננומטר.
    הערה: זמני שייר הם כמובן תלויות מאוד בהגדרת ציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, צינורות, וכו '). עם זאת, להציג דוגמא, אם שיפוע של 0: 100 MeCN / H 2 O (שניהם עם 0.1% TFA) 100: 0 MeCN / H 2 O מעל 25 דקות ועמודת 4.6 x 250 מ"מ C 18 אנליטיות משמש , הפעמים השמירה של TZ-BN-נוטה, TZ-NHS, וNH 2 -Bn-NOTA יהיו סביב 15 דקות, 16.5 דקות, 10 דקות ו, בהתאמה. המוצר יכול להיות מטוהר ממרכיבי תגובה האחרים באו ריצה אחת או ריצות מרובות באמצעות טור HPLC למחצה preparative או preparative C 18. 1 H-NMR, אנאליytical HPLC, וESI-MS כל השיטות שניתן להשתמש בהם כדי לאמת את טוהר של מבשר TZ-BN-NOTA הושלם. 11
  5. להקפיא את eluent HPLC נאסף באמצעות חנקן נוזלי.
  6. לעטוף את צינור האיסוף הקפוא ברדיד אלומיניום אטום.
  7. מניחים את צינור איסוף הקפוא בO כלי lyophilizing / N כדי להסיר את השלב הנייד HPLC.
  8. אחסן את המוצר המטוהר (ורוד בהיר מוצקה) בחושך ב -80 ° C.
    הערה: זו נקודת עצירה מקובלת בהליך. מבשר TZ-BN-NOTA הושלם הוא יציב במשך לפחות 1 שנה בתנאים אלה.

2. הכנת huA33-TCO Immunoconjugate

  1. בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין 1 מ"ג / מיליליטר (2.7 מ"מ) פתרון של TCO-NHS בDMF היבש.
  2. בתוך צינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge, להכין 2 מ"ג / מיליליטר פתרון (13.3 מיקרומטר) של huA33 ב 1 מיליליטר של בופר פוספט, pH 7.4 (0.01 M 4 PO 3,
  3. באמצעות aliquots הקטן (<μl 5) של 0.1 M Na 2 CO 3, להתאים את ה- pH של תמיסת הנוגדן ל8.8-9.0. השתמש באחת נייר pH או מטר pH עם microelectrode לפקח pH, ולהיזהר שלא לאפשר את ה- pH להתעלות מעל pH 9.0.
  4. לאחר פתרון הנוגדן הוא בpH הנכון, להוסיף נפח של פתרון TCO-NHS המקביל ל 8 שווה טוחנת של אסתר הופעלה. לדוגמא, להוסיף 7.9 μl של 1 מ"ג הפתרון / מיליליטר TCO-NHS (1.07 x 10 -7 mol TCO-NHS) למ"ל 1 של פתרון 2 מ"ג / מיליליטר נוגדן huA33 (1.33 x 10 -8 mol huA33). לא יעלה על 5% DMF לפי נפח בפתרון.
  5. לערבב בעדינות את הפתרון על ידי צינור היפוך microcentrifuge מספר פעמים.
  6. לעטוף את צינור microcentrifuge ברדיד אלומיניום אטום.
  7. אפשר הפתרון לדגירה עבור שעה 1 ב RT עם תסיסה עדינה.
  8. אחרי השעה 1 בRT, לטהר את immunoconjugate וכתוצאה מכך באמצעות siz חד פעמי מראש ארזהדרת דואר טור desalting. ראשית, יש לשטוף את עמודת הדרת גודל כפי שתואר על ידי הספק כדי להסיר כל חומרים משמרים נוכחי בעמודה במהלך האחסון. לאחר מכן, מוסיף את תערובת התגובה לטור הדרת גודל, לשטוף את הטור עם 1.5 מיליליטר 0.9% תמיסת מלח סטרילית, ולאחר מכן לאסוף את המוצר באמצעות 2 מיליליטר של 0.9% תמיסת מלח סטרילית כeluent.
    הערה: שלב זה יניב huA33-TCO הושלם כפתרון 2 מיליליטר.
  9. למדוד את הריכוז של התוצאה huA33-TCO על UV-Vis ספקטרופוטומטר.
  10. אם ריכוז גבוה יותר הוא רצוי, לרכז את פתרון huA33-TCO באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי.
    הערה: חשוב לציין כי בעוד huA33 ומגוון של נוגדנים אחרים ידועים (למשל, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, וJ591) הם סובלניים מאוד להיות מרוכז, וצבירת משקעים יכולים להתרחש על ריכוז במקרים אחרים. חוקרים מנסים זה procedיור עם נוגדן חדש צריך לסמוך על הספרות או הידע שלהם של הנוגדנים בשאלה בנוגע לשאלה האם לא להתרכז הנוגדן.
  11. אחסן את immunoconjugate huA33-TCO הושלם על 4 מעלות צלזיוס בחושך.
    הערה: זו נקודת עצירה מקובלת בהליך. המצומד מב-TCO השלים צריכה להיות יציב במשך לפחות 3 חודשים בתנאי האחסון הללו.

3. 64 Cu Radiolabeling של TZ-BN-NOTA

הערה: שלב זה של הפרוטוקול כרוך הטיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים - או ביצוע כל עבודה אחרת עם רדיואקטיביות - חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. קח את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת.

  1. בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין 0.5 מ"ג / מיליליטר (723 מיקרומטר) פתרון של TZ-BN-נוטה.
  2. בmicroc 1.7 מיליליטרצינור entrifuge, להוסיף 10 μl של פתרון TZ-BN-NOTA (5 מיקרוגרם) 400 μl של 0.2 M NH 4 OAC pH 5.5 חיץ.
  3. בעניין של פתק שמירת radiochemical הנכונה, למדוד ולתעד את כמות הרדיואקטיביות במדגם באמצעות כיל מנה לפני ואחרי הצעדים שהתפתחו בפרוטוקול בהמשך (3.4-3.8). זה יעזור לך עם הקביעה מדויקת של תשואות radiochemical.
  4. להוסיף 2,000 μCi (74 MBq) של 64 Cu לפתרון TZ-BN-נוטה.
    הערה: בדרך כלל, [64 Cu] CuCl 2 מסופקת בנפח קטן (<30 μl) של 0.1 N HCl, ובכך רק בנפחים קטנים (<10 μl) של פתרון מניות זו נדרשות לתגובת radiolabeling. אם בכמויות גדולות של המניות [64 Cu] CuCl 2 יש צורך, תגובת radiolabeling היא סובלנית של הגדלת נפח התגובה הכוללת. עם זאת, ה- pH של תמיסת תגובת radiolabeling צריך להיות במעקב צמוד כדי להבטיחשזה לא יפחת מ pH 4.0.
  5. אפשר הפתרון לדגירה של 10 דקות ב RT עם תסיסה עדינה.
  6. לאחר 10 דקות של דגירה, לטהר את המוצר באמצעות C 18 כרומטוגרפיה HPLC ההפוך-שלב. פעמים שמירה הן כמובן תלויות מאוד בהגדרת ציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, צינורות, וכו '). עם זאת, להציג דוגמא, אם שיפוע של 5:95 MeCN / H 2 O (שניהם עם 0.1% TFA) 95: 5 MeCN / H 2 O מעל 15 דקות משמש, זמן השמירה של 64 Cu-Tz- BN-NOTA צריך להיות סביב 9.8 דקות בזמן חופשי, 64 Cu uncomplexed יהיה elute עם חזית הממס בסביבות 2-4 דקות.
  7. באמצעות מאייד סיבובי, להסיר את eluent HPLC.
  8. Redissolve מוצר 64 Cu-טז-BN-NOTA בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית.
    הערה: בהתחשב 12.7 שעות זמן מחצית החיים הפיזיים של 64 Cu, זה לא נקודת עצירה מקובלת בהליך. לבצע הסינתזה של 64 Cu-טז-BN-לאמייד לפני ההזרקה של radioligand, ובצעו את שלב 3.7 מייד אחר צעד 4.5.

4. בVivo Pretargeted PET הדמיה

הערה: כמו בסעיף 3 לפרוטוקול, צעד זה של הפרוטוקול כרוך טיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. קח את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת.

  1. בעכבר נקבת athymic בעירום, שתל תת עורי 1 x 10 תאי סרטן מעי גס 6 SW1222 ולאפשר לגדול אלה לתוך xenograft 100-150 מ"מ 3 (9-12 ימים לאחר חיסון). 11
  2. לדלל aliquot של פתרון huA33-TCO מפרוטוקול סעיף 2 לריכוז של 0.5 מ"ג / מיליליטר בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית.
  3. להזריק 200 μl של פתרון huA33-TCO (100 מיקרוגרם) לוריד הזנב של עכבר xenograft נושאות.
  4. לאפשר 24 שעות לצבירת huA33-TCO בגידול של העכבר.
  5. לדלל את radioligand Cu-טז-BN-NOTA 64 לריכוז של 1.5 מיליליטר / MCI בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית.
  6. להזריק 200 μl של פתרון 64 Cu-טז-BN-NOTA radioligand (300 μCi; 11.1 MBq; 1.6 nmol של 64 Cu-טז-BN-נוטה, בהנחת פעילות ספציפית של 6.7 MBq / nmol) לוריד הזנב של עכברי נושאי xenograft.
  7. בנקודת זמן ההדמיה הרצויה (למשל, 2, 6, 12, או 24 שעות לאחר הזרקה), להרדים את העכבר עם 2% isoflurane: תערובת גז חמצן.
  8. מניחים את העכבר על המיטה של ​​סורק PET בעלי החיים הקטן. לשמור על הרדמה במהלך הסריקה באמצעות isoflurane 1%: תערובת גז חמצן. לפני הצבת בעלי החיים על מיטת הסורק, ודא הרדמה בשיטת הבוהן הקמצוץ ולהחיל משחה וטרינרים לעיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך הרדמה.
  9. לרכוש נתונים PET לעכבר באמצעות סטטילסרוק עם מינימום של 20 מיליון אירועים חופפים באמצעות חלון אנרגיה של 350-700 קאב וחלון תזמון מקרי של 6 NSEC. לאחר השלים הרכישה של התמונה, לא עוזב את העכבר ללא השגחה ולא למקם אותו בכלוב עם עכברים אחרים עד שהוא חזר להכרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שלושה שלבים הראשוניים של הניסוי - הסינתזה של TZ-BN-נוטה, נטיה של TCO לhuA33, וradiolabeling של TZ-BN-NOTA לבנות (איורים 3 ו -4) - הם אמין ביותר. במקרה של ההליך הנ"ל, מבנה TZ-BN-NOTA היה מסונתז בתשואה גבוהה וטוהר. נוגדן huA33 היה שונה עם 4.2 ± 0.6 TCO / מב, וTZ-BN-NOTA היה radiolabeled עם 64 Cu להניב radioligand המטוהר ב> 99% טוהר radiochemical, 85% תשואה> מתוקן ריקבון, ופעילות ספציפית של ~ 6.7 MBq / nmol (איור 5). תגובתיות של המצומד huA33-TCO וradioligand tetrazine ניתן לבדוק באמצעות כרומטוגרפיה רדיואקטיביים מיידית שכבה דקה (iTLC). הדבר נעשה על ידי ערבוב tetrazine radiolabeled (100 μCi; 0.55 nmol, בהנחת פעילות ספציפית של 6.7 MBq / nmol) עם עודף קל של huA33-TCO (50 מיקרוגרם; 0.66 nmol) בphנאגר osphate מלוח (pH 7.4) בשעה RT במשך 5 דקות. לאחר מכן, כ 1 μCi של הפתרון הוא הבחין על 18 צלחת TLC הפוך-שלב C ולהתייבש. TLC מנוהל ב9: 1 MeCN: H 2 O, והצלחת נותחה באמצעות קורא צלחת TLC רדיואקטיביים. אם התגובה לחץ עובדת כמתוכנן, 64 Cu-NOTA-A33 ligated צריך להישאר בבסיס; אם, לעומת זאת, התגובה נכשלה, 64 Cu-טז-BN-NOTA החופשי יופיע ליד או מול הממס.

על מנת להזיז in vivo ניסויי ההדמיה, בפרוטוקול שתואר לעיל, עכברים בעירום athymic נושאות A33, xenografts סרטן מעי גס המבטא אנטיגן SW1222 הועסקו. שני biodistribution החריף (n = 5 לכל נקודת זמן) וההדמיה PET (n = 12) ניסויים עולים כי אסטרטגית pretargeting מסוגלת התוויית צמיחת גידול המעי הגס עם ניגודיות מצוינת תמונה ויחסי פעילות גידול לרקע גבוהים (איור 6). ספיגה של 64 Cu-טז-BN-NOTA בגידול ניכר בנקודות זמן מוקדמות: 3.5% ± 0.6% ID / g ו -4.1% ± 0.6% ID / g בשעה 1 ו- 4 שעות לאחר הזרקה, בהתאמה. עם זאת, בנקודות מוקדמות, הוא מוסתר בקלות על ידי כמות רדיואקטיביות הסליקה דרך המעי של העכבר (11.9% ± 4.4% ID / g ו -8.8% ± 3.4% ID / g בצואה בשעה 1 ו- 4 pi שעות, בהתאמה). במהלך כמה שעות, radioligand העודף מנקה דרך הצואה (1.4% ± 0.5% ID / g ב 24 pi hr), והגידול הופך להיות התכונה הבולטת ביותר בזהות / g תמונה (4.0% ± 0.9% ב 24 pi hr). בנקודות הזמן מאוחר יותר אלה, הגידול מותווה גם בתמונה, ויחסי פעילות גידול לרקע הם גבוהים למדי; לדוגמא, האסטרטגיה מניבה גידול: יחסי שרירים של 26.6 ± 6.6 בpi 12 שעות ו27.0 ± 7.4 בשעה 24 pi שעות שלא במפתיע, ניסויי שליטה באמצעות רק 64 Cu-טז-BN-נוטה, נוגדנים שאינם ספציפיים, or huA33 ללא moieties TCO מצומדות כל הביא ספיגה מינימאלית בגידול.

כפי שיפורט בהרחבה בהמשך, אסטרטגיה זו pretargeting - כמו כל אסטרטגיות pretargeting - יש מספר משתנה שידרוש אופטימיזציה כאשר חלים על מערכות הנוגדן / אנטיגן חדשים. שניים מהחשובים ביותר הם המסה של מבנה מב-TCO המוזרק ואורכו של הזמן בין ההזרקה של מבנה מב-TCO וההזרקה של radioligand. אם כמות המצומד מב-TCO גבוהה מדי או מרווח הזמן בין זריקות קצרה מדי, הסך של מב-TCO החופשי בדם עולה והסבירות לתגובות לחצו מתרחשת בדם ולא בעליות הגידול. לדוגמא, במערכת 64 Cu / huA33 שנדון כאן, הן הממשל של 300 מיקרוגרם של huA33 (ולא 100 מיקרוגרם) או השימוש בזמן 12 שעות מרווח (ולא 24 שעות) הביא לעליות בולטות בtהוא הסכום של רדיואקטיביות גלויה בלב של העכבר (איור 7 א ואיור 7, בהתאמה). בשני המקרים הללו, התגובה לחץ עדיין בבירור מתרחשת בגידול, כפי שמודגם על ידי כמות ספיגת tumoral בנקודות זמן מוקדמת; עם זאת, ההיווצרות של נוגדנים בדם radiolabeled בא לידי הביטוי גם. אמנם זה מפתה לפטר בגלל נוגדני radiolabeled נוצרו בדם עדיין סופו של דבר ימצאו את דרכה לגידול, זה קצת מפספס את המטרה של שימוש במתודולוגיה pretargeting, כנוגדן radiolabeled יהיה להפיץ לאט לפני שהוא מגיע לגידול ובכך להעלות את מינון שיעורים לאיברים שאינם יעד. לעומת זאת, אם נעשה שימוש בנוגדנים מעט מדי, כמות הספיגה בגידול תסבול באופן טבעי. מדי פעמים מרווח ארוך עשויות גם להפחית את הרמות של ספיגת גידול כתוצאה מהפנמה איטית נוגדן, isomerization transcyclooctene, או נוגדן / אנטיגן שפיכת. האבחנה של הבעיות ese היא מאתגרות יותר ולא יכולות להיות מושלמת פשוט באמצעות בדיקת נתוני PET. ברור, יש לשמור על איזון עדין. לכן, מומלץ כי כל חוקרים מנסים ליישם אסטרטגיה זו לנוגדן / אנטיגן מערכת חדשה משתמשים בכמויות גדולות של מבנה מב-TCO (≥ 200 מיקרוגרם) ופעמים מרווח קצר (≤ 24 שעות) כנקודות התחלה ולייעל משם.

איור 1
איור 1. האלקטרונים דרישה ההפוכה דילס-Alder קשירת לחץ cycloaddition [4 + 2] בין tetrazine וtranscyclooctene.

איור 2
איור 2. איור של ארבעה השלבים של המתודולוגיה pretargeting. נתון זה מבוסס על מחקר שפורסם במקור בתל"י תשנו. Zeglis, BM et al. Bas אסטרטגית ההדמיה PET pretargeteded על כימיה לחץ דילס-Alder bioorthgonal. Journal of הרפואה הגרעינית. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 על ידי האגודה לרפואה גרעינית והדמיה מולקולרית, Inc אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תכנית לשינוי של huA33 עם TCO-NHS.

איור 4
איור 4. תכנית לסינתזה ו -64 radiolabeling Cu של TZ-BN-נוטה. נתון זה מבוסס על מחקר שפורסם במקור בתל"י תשנו. Zeglis, BM et al. אסטרטגית ההדמיה pretargeted PET מבוססת על דילס-Alder bioorthgonal לחץ כימיה. Journal of רפואה גרעיני. 54, 1389-1396 (2013). ו# 169; 2,013 ידי האגודה לרפואה גרעינית והדמיה מולקולרית, Inc אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. עקבות רדיו-HPLC של 64 Cu-טז-BN-NOTA המטוהר.

איור 6
איור 6. תמונות PET של 64 Cu-טז-BN-NOTA / A33-TCO pretargeting אסטרטגיה. עכברים שנשאו xenografts SW1222 תת-עורי (100-150 מ"מ 3) ניתנו huA33-TCO (100 מיקרוגרם) באמצעות הזרקה לוריד זנב. לאחר 24 שעות, באותו העכברים מנוהלים 64 Cu-טז-BN-NOTA (10.2-12.0 MBq [275-325 μCi]) באמצעות הזרקה לוריד זנב ולאחר מכן צילמו 2, 6, 12, ו -18 שעות לאחר שהממשל של radiopharmaceutical. Transverse (למעלה) ותמונות מישוריים (למטה) העטרה מצטלבות במרכז הגידולים. רמות גבוהות של ספיגה במעי בנקודות מוקדמות זמן (כלומר, 2 ו -6 שעות) במידה רבה על ידי ברורות hr 12, עוזבים את הגידול (חץ לבן) שמסומן באופן ברור מכל הרקמה שאינו היעד על ידי לאחר הזרקת 12 ו -18 שעות. נתון זה מבוסס על מחקר שפורסם במקור בתל"י תשנו. Zeglis, BM et al. אסטרטגית ההדמיה pretargeted PET מבוססת על דילס-Alder bioorthgonal לחץ כימיה. Journal of רפואה גרעיני. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 על ידי האגודה לרפואה גרעינית והדמיה מולקולרית, Inc אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. תמונות PET של ניסויי pretargeting הכי מוצלחים. (א) ביה עכבריםxenografts טבעת תת-עורי SW1222 (100-150 מ"מ 3, חץ) נוהלו huA33-TCO (100 מיקרוגרם) באמצעות הזרקה לוריד זנב. לאחר 12 שעות, באותו העכברים מנוהלים 64 Cu-טז-BN-NOTA (10.2-12.0 MBq [275-325 μCi]) הזרקה לוריד זנב. (ב) עכברים נושאי xenografts תת עורית SW1222 (100-150 מ"מ 3, חץ) נוהלו A33-TCO (300 מיקרוגרם) באמצעות הזרקה לוריד זנב. לאחר 24 שעות, באותו העכברים מנוהלים 64 Cu-טז-BN-NOTA (10.2-12.0 MBq [275-325 μCi]) הזרקה לוריד זנב. בשני המקרים, העכברים הם צילמו 12 שעות לאחר ההזרקה של 64 Cu-טז-BN-נוטה. בשני הלוחות, רוחבי (למעלה) ועטרה (תחתונה) תמונות מישוריים מצטלבות במרכז הגידולים. בעוד אסטרטגית pretargeting בבירור מתארת ​​את הגידול בשני המקרים, התוצאות בשתי תמונות אלה הן תת-סטנדרטיים בהשוואה לאלה המוצגים באיור 6. בשני 7 א וב 7, ישכמות משמעותית של ספיגת פעילות רקע בלב. בתנאים של איור 7 א, זה ככל הנראה הוא התוצאה של מספיק הזמן לבנות לא נותן huA33-TCO למקם בגידול. בתנאים של איור 7 ב, זה עשוי תוצאה מהזרקה יותר מדי huA33-TCO ויש immunoconjugate העודף עדיין במחזור הדם אפילו 24 שעות לאחר הזרקה. נתון זה מבוסס על מחקר שפורסם במקור בתל"י תשנו. Zeglis, BM et al. אסטרטגית ההדמיה pretargeted PET מבוססת על דילס-Alder bioorthgonal לחץ כימיה. Journal of רפואה גרעיני. 54, 1389-1396 (2013). 2,013 ידי האגודה לרפואה גרעינית והדמיה מולקולרית, Inc אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היתרון העיקרי של אסטרטגית ההדמיה PET pretargeted הזה הוא שהוא מסוגל התוויית גידולים עם ניגודיות תמונת יעד לרקע בחלק קטן בלבד של מינון קרינת רקע המיוצר על ידי נוגדנים שכותרתו ישירות. לדוגמא, במערכת ההדמיה סרטן המעי הגס שתוארה כאן, נתונים מניסויי biodistribution חריפים הועסקו כדי לבצע חישובי dosimetry לאסטרטגית pretargeting מבוסס Cu 64 יחד עם ישירות שכותרתו 64 Cu-NOTA-huA33 ו -89 ZR-DFO-huA33. החישובים האלה מראים בבירור את היתרונות מדי מינון של מערכת pretargeting, במיוחד בהשוואה לנוגדן 89 Zr שכותרתו יותר מבחינה קלינית הרלוונטי. המינון האפקטיבי של אסטרטגית pretargeting הוא .0124 mSv / MBq, ואילו זה של 89 ZR-DFO-huA33 הוא מעל 30 פעמים גבוהות יותר: .4162 mSv / MBq. התועלת מדי המינון של pretargeting היא פחות בולטת כאשר משווים ל -64 Cu שכותרתוntibody (.0359 mSv / MBq), אם כי ההשפעה המועילה עדיין קיימת.

אחד היתרונות המשמעותיים ביותר של IEDDA זה pretargeting המתודולוגיה היא המודולריות שלה: -cyclooctene טרנס יכול להיות מצורף לכל נוגדן שאינו הפנמה, ועוד מגוון רחב של מטענים יכול להיות מחובר לtetrazine. ואכן, המוטיבציה העיקרית שלנו לכתיבת פרוטוקול זה היא לאפשר לקבוצות מחקר אחרות להעסיק בשיטה זו עם מערכות נוגדן / אנטיגן / רדיו-איזוטופי שונים. לאורך שורות אלה, אנו מאמינים שזה הוא קריטי לטיפול במספר הנושאים שחוקרים צריכים לשקול בעת התאמת מתודולוגיה זו למערכות אחרות.

ראשית, הבחירה של הנוגדן היא חשובה מאוד. במילים פשוטות, הנוגדן חייב להיות הפנמה שאינו או הפנימו בקצב איטי מאוד. בעוד הפרמטרים הקינטית אידיאליים שעדיין לא נקבעו, והנוגדן -cyclooctene טרנס התגובה שהוא מנהל חייבים להישאר במחוץ לתא, להפנמה והקיבוע של הנוגדן לפני ההזרקה של radioligand היה להפחית באופן דרמטי את המספר של תגובות לחצו in vivo. במערכת המתוארת כאן, מטרות נוגדן huA33 ונקשר לאנטיגן A33, גליקופרוטאין הטרנסממברני בא לידי ביטוי ב> 95% מכל מקרי סרטן המעי הגס. חשוב לציין, שכבר הוכח כי גם לאחר מחייב היעד שלה, מורכב אנטיגן נוגדן huA33 / נשאר על פני השטח של התא לימים. 31-33 בזמן שיש הצורך בנוגדנים שאינן הפנמה היא אמנם הגבלה לאסטרטגיה, מגוון רחב של נוגדנים-הפנמה שאינן ידוע, אולי בעיקר נוגדן CC49 מיקוד TAG72 שRossin, et al. בחנו בעבודת pretargeting המעולה שלהם. 30,34,35

שנית, אסטרטגית pretargeting זה - כמו כל האחרים - דורשת אופטימיזציה משמעותית. בנוסף לזהותו שלntibody וradioligand tetrazine, שני משתנים קריטיים יש לקחת בחשבון: כמות הנוגדנים מוזרקות ומרווח הזמן בין הזריקות של הנוגדן וradioligand. יש לנו לטפל שני משתנים אלו בסעיף נציג תוצאות לעיל, אך לחזור בקצרה, אם אחד הנוגדן יותר מדי או מרווח זמן קצר מדי מועסק, כמויות משמעותיות של המצומד מב-TCO יישאר בדם בזמן ההזרקה של radioligand. זה, בתורו, יביא לקשירה לחץ in vivo המתרחשת בדם ולא בגידול, ויצרה במחזור, נוגדן radiolabeled שיצטבר רק לאט בגידול לאורך זמן. לעומת זאת, אם גם נוגדן קטן מדי או מרווח זמן ארוך מדי מועסק, הסכום הסופי של רדיואקטיביות בגידול יהיה הכי מוצלח. לדעתנו, ביצוע הדמיה קפדנית, או רצוי, ניסויי biodistribution חריפים עם itse הנוגדן שכותרתו ישירותLF לפני כל ניסויי pretargeting הוא הדרך אמינה ביותר ללמוד על כמות הנוגדנים הנחוצים ומרווח הזמן האידיאלי לאחר ההזרקה הראשונית של מבנה נוגדן. להמונים מוזרקים שונים של radiolabeled מב, ניסויים אלה יספק נתונים קונקרטיים על שני סליקת radioimmunoconjugate מהדם וההצטברות שלה בגידול, ומאפשרים לבחירת התנאים המבטיחים ביותר לניסויי pretargeting.

לבסוף, הפרמקוקינטיקה של radioligand מבוסס tetrazine יש לקחת בחשבון בעת ​​בחירת רדיו-איזוטופי מתאים. במערכת המתוארת כאן, מחצית TZ-BN-NOTA radiolabeled מופרשת מהגוף דרך המעיים עם זמן מחצית חיים ביולוגיים של כ 3-4 שעות, מה שהופך את 64 Cu הרדיו-איזוטופי פולטות פוזיטרונים עם חצי פיזיים משלים ביותר חיים. למרבה הצער, זמן מחצית החיים הביולוגיים של מחצית tetrazine ארוכים מדי כדי שזה יהיה תואם עם הדואר במהירות רב יותר מתפורר radiometal 68 Ga (t 1/2 = 68 דקות). במקרה זה, רדיואקטיביות כל בגידול תירקב בכמה זמן מחצית חיים לפני radioligand העודף סיימה לנקות מהגוף. כתוצאה מכך, תמונות היו צריכה להיות שנרכשו בנקודות זמן מוקדמות, כאשר יחסי פעילות גידול לרקע יישארו נמוכים באופן אידיאלי 36, הדורות הבאים של radioligands tetrazine יהיו מהונדסים -. אולי באמצעות PEGylation, glycation, או באמצעים אחרים - להפריש מהגוף במהירות רב יותר. זה היה מאפשר לradiolabeling עם רדיואיזוטופים במהירות רבה יותר מתפוררים כמו 68 Ga ו- 18 F, אשר בתורו לשפר עוד יותר את היתרונות מדי מינון של אסטרטגית ההדמיה pretargeted. סופו של דבר, כפי שהחוקרים להתאים את הטכנולוגיה לשימוש עם רדיואיזוטופים אחרים להדמיה (למשל, 124 ש, 111 ב, 18 F, 89 Zr, 68 Ga, וכו ') או טיפול (למשל, 177 Lu, 225 Ac, אני 125, וכו '), ligands מבוסס tetrazine החדש צריך להיות מפותח לשלב chelators שונה או קבוצות תותבות radiolabeling. החקירה היסודית של הפרמקוקינטיקה של מבני רומן אלה תהיה חיונית כדי להבטיח התאמות יתרון בין תכונות האישור של הליגנדים ומחצית החיים הפיזיים של radionuclides.

בסופו של הדבר מאוד מקווים שחוקרים אחרים רואים את ההבטחה של טכנולוגית pretargeting זה ולהעסיק אותו עם מערכות הנוגדן / אנטיגן חדשים. בעוד בסעיפים קטנים הקודמים להמחיש שתהליך הסתגלות זה לא תמיד פשוט, זה האמונה שלנו כי יש לי מתודולוגיה זו יכולה להיות השפעה משמעותית על הדמיה גרעינית, טיפול רדיונוקלידים ממוקד, ומעבר לו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).
  3. Hollander, N. Bispecific antibodies for cancer therapy. Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).
  4. Liu, G., et al. Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog. Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).
  5. Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step. Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).
  6. Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy. Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).
  7. Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides. Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).
  8. Sharkey, R. M., et al. Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods. Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).
  9. Schultz, J., et al. A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy. Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).
  10. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).
  11. Zeglis, B. M., et al. A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).
  12. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).
  13. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).
  14. Devaraj, N. K., Weissleder, R. Biomedical applications of tetrazine cycloadditions. Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).
  15. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging. Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).
  16. Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors. ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).
  17. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).
  18. Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method. Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).
  19. Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).
  20. Selvaraj, R., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).
  21. Liu, S., et al. Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).
  22. Han, H. S., et al. Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).
  23. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).
  24. Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals. Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).
  25. Reiner, T., Zeglis, B. M. The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry. Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).
  26. Li, Z., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes. Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).
  27. Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation. Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).
  28. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).
  29. Bosch, S. M., et al. Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice. Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).
  30. Rossin, R., et al. In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice. Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).
  31. Ackerman, M. E., et al. A33 antigen displays persistent surface expression. Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).
  32. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).
  33. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).
  34. Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).
  35. Rossin, R., et al. Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems. Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).
  36. Emmetiere, F., et al. 18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting. Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 96 Positron פליטת טומוגרפיה לחץ כימיה Pretargeting Tetrazine, ביקוש הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition
רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. … More

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter