Introduction
שינויים דינמיים במספר ובמבנה של סינפסות הם מסימני היכר של פיתוח, הזדקנות, והפרעות ניווניות רבות 1-3. היכולת של נוירונים לקבל ולשלב מידע הסינפטי תלויה מורפולוגיה הדנדריטים ושינויים דינמיים בקשרים סינפטיים. ואכן, נמצא מתאם חיובי בין עמוד השדרה הדנדריטים ומספר סינפסה, ששניהם משפיעים על תפקוד הקוגניטיבי 4. לפיכך, אין זה מפתיע שdecrements במספר עמוד השדרה דנדריטים נקשר עם תפקוד קוגניטיבי לקוי במספר הפרעות נוירולוגיות 5-7, מה שגרם עניין רב בכימות עמוד השדרה הדנדריטים. אף על פי כן, כימות של צפיפות עמוד השדרה נשארה זמן רב ומשימה מייגעת שלא מצליח לייצר מידע שימושי בנוגע לטופוגרפיה וההפצה של סינפסות על פני העץ הדנדריטי. למרבה המזל, בשיטות צביעה (למשל, Golgi-קוקס וdoublecortin (DCX)) בשיתוףבעזרת שיטות הדמיה מתוחכמות יכול להיות מנוצל כדי להתגבר על מחסומים הנוכחיים ולהפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של arborization הדנדריטים באופן אמין ומהיר. בעוד ששיטת צביעת Golgi-קוקס ניתן לפרוס על מנת להעריך את המצב של arborization הדנדריטים בכל הנוירונים 8, ניתן לפרוס DCX לתייג נוירונים שזה עתה נולד במיוחד ברכס המשונן ואזור subventricular 9, שיקול חשוב בהתחשב בכך שneurogenesis מתרחשת בשני אזורים אלה בתוחלת החיים 10,11.
בעקבות צביעה, שתי שיטות הדמיה נפרסו להעריך מאפיינים דנדריטים: i) הדמיה בזמן אמת (RTI) ו- II) עומק מורחב של הדמיה שדה (EDFI). טכניקת RTI מספקת בממוצע לאתר ולכמת את האורך וסדר arborization לאורך המקטעים דנדריטים הפרט וסניפים. כך שהוא מאפשר לאמוד את השטח ונפח שנכבש על ידי כל עץ הדנדריטי הכולל. עוד specifically, בשיטת RTI המשתמש ברציפות מזהה את הקטעים והפניה מחודש איטרטיבי כנוירון התחקות תוכנה אוסף את x, y, z וקואורדינטות של המבנה הדנדריטי ומשחזר את מסלולו של המבנה הדנדריטי ב3D. יחסית, שיטת EDFI מספקת אמצעי פשוט למדי ומזורז להערכת צפיפות דנדריטים בדגימות רקמה עבות למדי על ידי יצירת תמונה מורכבת, מתן מידע על Z- הציר כולו. לשם כך, המשתמש רשומות קבצי וידאו בחדות גבוה בכל העובי של הסעיף ולאחר מכן משתמש בתוכנה כדי לחפש מסגרות וידאו לזהות נקודות בי פיקסל הוא לגמרי בפוקוס. בהמשך לכך, פיקסלים ממוקדים מתמזגים ומשתלבים ברזולוציה גבוהה, תמונת 2D מורכבת. תמונה מורכבת זה מכילה את כל הפיקסלים שהיו בפוקוס, ללא קשר למיקום שלהם בציר z. ניתוח איכותי וכמותי של תמונות 2D אלה יכול לשמש לאחר מכן כדי לקבוע את הצפיפותשל הדנדריטים הסתעפות בכל תחום.
לבסוף, אנו מציגים שיטת פנורמי ליצירת מאוד תמונות ברזולוציה גבוהה לניתוח וההערכה של דנדריטים באזור כולו של עניין. טכניקה זו ניתן לפרוס כדי להתגבר על חוסר הנגישות לרזולוציה גבוהה מאוד ומצלמות דיגיטליות יקרות. באמצעות שיטה זו, אחד לוכד תמונות סידורי במקומות שונים לאורך הקואורדינטות x ו- y צירים ולאחר מכן באופן אוטומטי תפרים אותם יחד באמצעות תוכנה חופשית (למשל, תמונה מורכבת עורך). יש לציין, שיטה זו יכולה לשמש להערכה איכותית וכמותית של arborization הדנדריטים באזור רחב למדי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ניסויים נערכו בהתאם לסטנדרטים האתיים אושרו על ידי הוועדה למחקר בבעלי חיים במערכת הבריאות לענייני יוצאי צבא פאלו אלטו.
1. Golgi-קוקס מכתים
- חילוץ מוח וצביעה
- ביום 1 ב, עמוק להרדים עכברים עם 100 מ"ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ"ג / קילוגרם xylazine לפני הרדמת החסד באמצעות exsanguination.
- מוציא בזהירות את calvarium ולנתח את המוח.
- ראשית להסיר את העור בחלק העליון של הגולגולת, הצבת מספריים מעוגלים בחלקו העליון של המוח הקטן ובעדינות לחתוך המקביל calvarium למענית המרכזית עם הקצה של המספריים הצביע החוצה, נע בכיוון לכיוון הנורה חוש הריח. חזור על תהליך זה בשני הצדדים.
- השתמש pincet כירורגית להרים calvarium תוך הפיכתו לכיוון נורות חוש הריח ולשבור אותו. ואז, להפוך את הגולגולת הפוכה ולהשתמש איסוף לחתוך האופטיעצבים ולשחרר את המוח. לבסוף, השתמש בבחירה להפריד את המוח מחוט השדרה ברמה של מגנום foramen.
- מייד לטבול את המוח ב- 15 מיליליטר של תמיסה מסחרית-זמינה, חי Golgi-קוקס. אחסן את המוח בפתרון Golgi ב, בקבוק זכוכית 20 מיליליטר כתרים בטמפרטורת חדר בחושך.
- , ביום 2 לשפוך לאט את הפתרון ולהחליף אותו עם 15 מיליליטר פתרון Golgi-קוקס טרי. לסכם את הבקבוק המכיל את המוח ולהשאיר ללא הפרעה לעוד 9 ימים בחושך.
- חתך וembedment
- ביום ה -11, מקום המוח בתמיסת סוכרוז 30%, שהוכן DDH 2 O להתייבשות. לשנות את הפתרון עם סוכרוז 30% מוכנים טרי לאחר 12 שעות. דגירה המוח בתמיסת סוכרוז 30% במשך 3 ימים על 4 מעלות צלזיוס.
- ביום ה -14, למלא את המאגר של vibratome עם תמיסת סוכרוז 30% עד שהלהב מכוסה. קבע את המהירות 1 מ 'ים עם משרעת של 0.95 מ"מ מ '/.
- למחוק את המוח עם Kimwipe כדי להסיר לחות עודפת ולהסיר את המוח הקטן באמצעות סכין גילוח לחתוך coronally.
- בתוקף לעלות את המוח כולו על גבי פלטפורמת vibratome באמצעות דבק מגע ולאפשר לו להגדיר במשך 2-4 דקות. הכנס את הפלטפורמה עם המוח דבק לתוך המאגר ולהתאים את הלהב לחלק העליון של המוח.
- באמצעות vibratome, פורס את המוח ל-150 מיקרומטר חלקים עבים בטמפרטורת חדר, לזכור להחליף את הלהב לאחר כל מוח 3.
- להרים את החלקים מהמאגר בעזרת מברשת היטה קטנה ולטבול אותם לתוך צלחת פטרי המכילה ג'לטין 0.3% תוצרת DDH 2 O. בעוד הסעיפים יישארו בצלחת פטרי, להוסיף 0.5 מיליליטר של ג'לטין 0.3% בכל שקופית ולהשתמש במברשת כדי להפיץ ומעיל Superfrost + השקופיות.
- בעדינות להרים את החלקים שקועים מצלחת פטרי ומניח אותם על גבי שקופיות gelatinized. כוון את החלקים במוח על ידילגעת בם רק על צדם ולא על ראשי.
- לאחר כעשר דקות, מעיל הקטעים עם סוכרוז 30% לפני הרקמה מתייבשת לגמרי. לאחר מכן אוויר יבש השקופיות מוכנות במקום חשוך במעמד שקופית במשך 3 ימים.
- לדלל פתרון 10x מסחרי-זמין לפיתוח 1x באמצעות DDH 2 O. לטבול את השקופיות בפיתוח פתרון ל7-10 דקות. יש לשטוף את השקופיות 3 פעמים בDDH 2 O.
- התייבשות
- הכן 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ופתרונות אתנול% 95 באמצעות DDH 2 O. מזוקק
- משרים את השקופיות בפתרונות אתנול גבוהים יותר ויותר במשך 10 דקות כל אחד.
- משרים את השקופיות ב 100% פתרון אתנול 3 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
- משרים את השקופיות ב 100% קסילן 3 פעמים ברציפות במשך 5 דקות כל אחד, שמירה על הסעיפים בפתרון הסופי עד שהם החליקו-כיסוי.
- מניחים כמות נדיבה של DPX (phthalate Di-n-בוטיל בקסילן) הרכבה בינונית (ab1-1.5 מתוך מיליליטר) על כל שקופית באמצעות pipet העברת פלסטיק. זהירות במקום coverslips כדי למנוע בועות.
- כיסוי האוויר יבש החליק-מוח סעיפים אופקי במשך 3 ימים.
2. Doublecortin מכתים
- עמוק להרדים (ראה שלב 1.1.1) בעלי החיים.
- בצע זלוף לב עם paraformaldehyde 4% מוכנים טרי שנעשה בחיץ פוספט 12.
- חלץ את המוח (ראה 1.1.2) וחנות ב -45 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב 4 ° C למשך לילה על שייקר נדנדה.
- העבר את המוח לפתרון סוכרוז 30% ולחכות להתייבשות מלאה במשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את המוח מסוכרוז ומניח אותם ישירות על בלוקי נחושת מונחים על קרח יבש.
- מלא את הבלוק עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך מתחם (אוקטובר) ולסמן את הכיוון של המוח באמצעות הנורה חוש הריח כנקודת ציון.
- באמצעות cryostat, לחתוך 70 סעיפים מיקרון עבים ב -20 ºC ולמקם אותםבפתרון cryoprotectant (25% אתילן גליקול, גליצרול 25%, ב0.05 חיץ פוספט M נתרן, pH 7.4) ולשמור ב -20 ° C עד לשימוש.
- הפוך פתרון של 50% מתנול cryoprotectant ו -50%. לפתרון זה מוסיף 0.5% מי חמצן (כרך / כרך). סעיפי דגירה צף במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- קטעים חמים ב -37 ºC בTBS (נאגר מלוח טריס) במשך 30-40 דקות על ידי הצבת אותם בתנור היסטולוגית.
- דגירה הקטעים עם טריטון 0.3% ו -3% בסרום סוס רגיל במשך 45 דקות בטמפרטורת חדר לפני immunostaining. דגירה הסעיפים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב 3 מיליליטר פתרון של נוגדן DCX בדילול 1: 500 בTBS עם טריטון 0.3% ו -1% בסרום סוס רגיל.
- למחרת לשטוף את הסעיפים 3 פעמים רצופות בTBS (10 דקות כל אחד).
- סעיפי דגירה עם אנטי-עז סוס biotinylated (1: 200 בTBS) לשתי שעות בטמפרטורת חדר. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים רצופות בTBS (10 דקות כל אחד).
- דגירה tמכפלת עם ABC לייט (1: 1000) תמורת 1.5 שעות בטמפרטורת חדר.
- הוסף 5 μl של H 30% 2 O 2 לטבליה אחת של 10 מ"ג של DAB (3,3 "-Diaminobenzidine) פתרון המומס ב 15 מיליליטר של 1 M טריס- HCl (pH 7.6). דגירה הסעיפים מייד בפתרון זה במשך 5 דקות.
- לסיים את התגובה על ידי שטיפתם עם כפות קרות כקרח שלוש פעמים ואחרי שטיפה אחת בTBS בטמפרטורת חדר.
- ליבש חלקים באמצעות סדרה של פתרונות אתנול (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 דקות כל אחד), ברורה בקסילן, ואז לכסות להחליק באמצעות DPX כמו בשלב 1.3.
3. ויזואליזציה
- בעקבות ייבוש של החלקים שלמים, להסיר DPX העודף על גבי השקופיות עם להב חד, ומניח אותם על הבמה הסריקה של מיקרוסקופ. המערכת מורכבת של מיקרוסקופ מצויד בשלב סריקה, ג'ויסטיק, ומצלמה 12-bit צבע.
- הפעל את התכנית. פתיחת קובץ נתונים חדש.
- מקוםנקודת התייחסות על המסך על ידי לחיצה עם סמן העכבר בכל מקום. זה יהיה להפעיל את כל הסמלים מהלוח הכלי של חלון תכנית.
- לחץ על הסמל "ג'ויסטיק חינם" בסרגל הכלים ולאחר מכן להשתמש בג'ויסטיק כדי לאתר את gyrus המשונן של ההיפוקמפוס בסעיף הראשון.
- בכרטיסייה "כלים" של חלון התכנית, בחר "מנהל מדור סידורי". לחץ על הסמל "סעיף חדש" בפינה השמאלית התחתונה של החלון. הפעולה זו תפתח את החלון "הגדרת סעיף סידורי".
- בחר את חלון הגדרת סעיף הסידורי ולאחר מכן להזין את המספר הכולל של קטעים המכילים אזורים בהיפוקמפוס. בחר את מרווח ההערכה. הזן את עובי חתך סעיף (70 מיקרומטר לDCX ו -150 מיקרומטר לחלקים צבעוניים Golgi).
- התחל התחקות אזור gyrus המשונן על ידי לחיצה על הסמל "Freehand Contour הציור" בסרגל הכלים. להתוות את שכבת תאים הגרעינית משוננת. </ Li>
- בחר באפשרות "100X" מתפריט "הגדלה". להוסיף טיפה של שמן טבילה בסעיף ולעבור למטרת 100X. אתר את הגופים המשונן תא גרגיר ודנדריטים תחת מטרה זו.
- להתמקד בנוירון שנבחר ולחץ על הסמל "Neuron Tracing" בסרגל הכלים. עקוב אחר ההיקף של גוף תא גרגיר המשונן. בסיום מעקב, לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור "תא בגוף סיום".
- התחל מעקב דנדריטים ידני בx, y, z וכיוונים ועיקבו אחרי כל ענף באמצעות כפתור הג'ויסטיק וz-מוטורי. בצומת הסתעפות או trifurcation, בחר את האפשרות המתאימה מהתפריט הנפתח על הלחצן ימני של העכבר. עקוב אחר כל אחד מהענפים הנובעים מבלוטות אלה. בסופו של כל סניף קליק ימני ובחר "סיום" מהתפריט הנפתח.
- שימוש בסמלי מקש החץ בחלון התוכנה יבחר באופן אקראי תא אחר גרגיר המשונן ובצע את אותו הנוהל כמו described בשלב 3.9-3.10. שמור את כל המעקב.
- הפעל את תוכנת מעקב העצבית.
- פתח את קובץ נתוני NRX הראשון מהעכבר הראשון של קבוצת הניסוי. צרף את קובץ NRX של העכבר השני של קבוצת הניסוי. המשך עד שכל קבצי NRX מקבוצה זו יתווספו.
- תחת לשונית ניתוח, בחר "מאוורר ב- תרשים". פעולה זו פותחת את החלון ב- ניתוח המאוורר. בדוק "דנדריטים" סימן ולחץ על תצוגה, המתארת את האורכים ודפוסי הסתעפות של הדנדריטים עבור קבוצה זו של עכברים (איור 1).
4. EDFI
הערה: שיטה זו מאפשרת למשתמש להקליט במהירות מספר רב של תמונות דרך Z- הציר של כל שדה וליצור תמונת 2D המכילה את כל הפיקסלים ממוקדים לאורך ציר z. התוצאה תהיה תמונה מורכבת המכילה את כל הפיקסלים ממוקדים מתמונות שנאספו.
- חבר את המיקרוסקופ למצלמת דיגיטליתעידן. מניחים את החלקים הראשונים על הבמה הסריקה המחוברת למיקרוסקופ ולאחר מכן לעבור למטרת 10X. הזז את הבמה לאזור של עניין.
- להפעיל תכנית לכידת וידאו.
- לחץ על כפתור ההקלטה. ברגע שכפתור ההקלטה נלחץ, השתמש בכפתור מאקרו הפוקוס כדי לעבור מהחלק העליון לחלק התחתון של הסעיף עבור הסכום כולל של 4 שניות. שמור את קובץ וידאו וכתוצאה מכך.
- השתמש בתוכנה חופשית ImageJ להמיר קבצי וידאו מסוג AVI לפורמט דחוס על ידי פתיחת הקובץ ולשמור אותם בפורמט קובץ דחוס.
- התחל תכנית ניתוח תמונה ולפתוח את קובץ AVI. עבור לתפריט "תהליך" ולחץ על "עומק שדה מורחב". בחר את קובץ וידאו המתאים. באפשרויות "פלט", בחר "צור תמונה הטובה ביותר-פוקוס Composite".
- באפשרויות "פוקוס ניתוח", בחר "מנורמלת תאורה" ואפשרויות "ניגודיות המקומית מקס". לאחר מכן, בחר "Creאכל ". התמונה המתקבלת מייצגת את כל הפיקסלים ממוקדים לאורך ציר z (איור 2).
- שמור את התמונה וכתוצאה מכך.
5. יצירת תמונות ברזולוציה מאוד גבוהות
הערה: שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור באופן אוטומטי בהגדלה נמוכה ומאוד תמונות ברזולוציה גבוהה מתמונות ברזולוציה גבוהה בהגדלה גבוהה באופנת automatized.
- מניחים את החלקים הראשונים על הבמה הסריקה המחוברת למיקרוסקופ. מיקרוסקופ מחובר למצלמה דיגיטלית. הזז את הבמה לאזור של עניין.
- התחל תכנית רכישת תמונה.
- השתמש במטרת 10X ולרכוש ולשמור ברזולוציה גבוהה (4076 x 3116) תמונות מהאזור של עניין ולוודא שיש לפחות 10% חפיפה.
- תמונה לרוץ Composite עורך לתפור תמונות.
- עבור אל תפריט קובץ, ולחץ על "ניו פנורמה". בחר את התיקייה שבה התמונות הן stכבדתי. בחר את התמונות ששייכים לאותו האזור ולחץ על "אישור".
- לחץ על לחצן "יצוא לדיסק" ולשמור את התמונה. תמונה זו מייצגת תמונה ברזולוציה גבוהה מאוד של תחומי עניין של שיכול לשמש לניתוח ו / או הפגנה (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
של arborization הנובע מתאי גרגיר המשונן קיימים ושזה עתה נולדו המידה נותחה בעכברים מסוג בר או באמצעות Golgi-קוקס או הכתמת DCX (איור 1). מגזרי דנדריטים של תאי DCX-חיוביים נמצאו להיות ארוך 13-36 מיקרון. ההתפלגות הנורמלית של אורך דנדריטים נבדקה באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב (D = .1217, p <0.01, p Liliefors <0.001; איורים 4 ו -5).
בניתוח האורך של מגזרים לכל הסדר של arborization, הקטעים הארוכים ביותר נמצאו בצו הראשון של arborization (38.38 1.45 + מיקרומטר). דפוסים דומים נמצאו למשטח (111.98 3.93 + מיקרון המרובע) והנפח (27.93 1.03 + מיקרומטר מעוקב). קשר לינארי בין האורך של מגזרים ושטח הפנים ו / או הנפח שנכבש על ידי מגזרים אלו נבדקו גם. שני פני השטח (p = 0.001, r 2 = .873) ונפח (p = 0.001, r 2 = .621) גorrelated באופן משמעותי עם האורך של כל מגזר דנדריטים.
איור 1:. הנה תרשים המאוורר שימש להערכת אורך הדנדריטים של תאי גרגיר המשונן בהיפוקמפוס כלי להדמיה זו יכול לשמש כדי להשוות את ההשפעות של התערבויות טיפוליות שונות או גנוטיפים על אורך דנדריטים. היחידה של מדידות היא מיקרומטר.
איור 2: ויזואליזציה של arborization הדנדריטים ללא () ועם EDFI שיטות (B). השיטה המסורתית של מציאת מטוס המיקוד הטוב ביותר הייתה בהשוואה לEDFI (מידע לא מוצג) ונמצא ערכים גבוהים יותר באופן משמעותי של אזור דנדריטים בשיטת EDFI (p = 0.02). בר סולם= 100 מיקרומטר.
איור 3:. תמונה ברזולוציה גבוהה של האזור בהיפוקמפוס בעכבר תמונה ברזולוציה גבוהה מאוד זה בנוי באופן אוטומטי מתפרי 10 (4,076 x 3,116) תמונות -pixel. קנה מידה החשוף = 100 מיקרומטר.
איור 4:. כימות של אורך ונפח שנכבשה על ידי דנדריטים בהזמנות שונות של הסתעפות האורך והנפח המרביים הושגו בצו 1.
איור 5:. היסטוגרמה של אורך הדנדריטים של תאי גרגיר המשונן רוב מגזרי הדנדריטים של Dדנדריטים הצבעוניים CX היו 13-26 באורך. הקו המקווקו האדום מתאר התפלגות נורמלית של הנתונים שהוצגו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, שתי שיטות שתוארו לכמת את היקף arborization הדנדריטים בתאים בוגרים וזה עתה נולד בשיטות צביעה קונבנציונליות בשיתוף עם RTI וEDFI. הרכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי עצב מספקת שיטה מאוד שימושית לבדיקת ההשפעות המזיקות של הפרעות ניווניות ו, בתורו, מספקת אמצעי להערכת אסטרטגיות טיפוליות המתמקדות בתאי עצב בהיפוקמפוס.
בעוד שיטת RTI נוצלה כדי ללכוד את הנתונים לעומק הנוגעים להיקף arborization וטופוגרפיה, שיטת EDFI אינה מספקת מידע הנוגע למורכבות של מגזרי יחידים או עצים. עם זאת, היתרונות של שיטת EDFI לשקר בעובדה שהיא אינה דורשת רכישת החומרה יקרה ופחות זמן רב.
תכנית ניתוח תמונה שימשה לביצוע EDFI בקבצי וידאו. גישה שיש לרזולוציה גבוהה ומהירהמצלמות מאפשרת האיסוף של מספר גדול של תמונות בכל עוביו של כל שדה ומייצרת תמונות שבאמת מייצגים את ממדי x, y, z. חסרון אחד של שיטת EDFI נוגע לעובדה שיכולה להיות שיש פיקסל אחד או יותר (אותו x ו- y) התמקד במישורים שונים ברחבי Z- הציר. שיטה היא חזתה להקצות צבעים שונים לפיקסלים אלה דווקא המייצגים את המידה של פרופילי 3D בתמונות 2D. יש לציין כי שיטת EDFI יכולה לשמש גם לניתוח של פרופילים סלולריים (לדוגמא, סינפסות, מיקרוגליה, והאסטרוציטים). יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לנתח את היקף הפצת microglial לאורך העובי של סעיף 7. שתי שיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש בצורה משלימה. בעוד שיטת RTI מספקת מידע מדויק על טופוגרפיה של דפוס מסועף, EDFI נותן לנו שיטה פשוטה למדי ומזורזת על מנת להעריך את הצפיפות של דנדריטים באזור של בהתעניינות. יש לציין, העובי של חלקים שניתן לרכוש עם EDFI הם משתנה מאוד כטווח של מוקד z על הבמה מיקרוסקופ בשילוב עם המוקד האופטי של מטרות מיקרוסקופ להכתיב את הגבולות של EDFI.
השיטות שתוארו במסמך זה יש הפוטנציאל לפריסה בהקשרים רבים. במחקר זה אנו סיפקנו אמצעי להערכת שינויים במראש arborization הדנדריטים ולאחר התערבות, ואילו EDFI שימש לכמת הפעלת microglial 7. כך, טכניקה זו ניתנת לכל יישום שבו המטרה הסופית היא להעריך שינויים בפרופילים קטנים שניתן למצוא במספר שכבות.
לבסוף, טכניקות אלה יכולים להתגבר על חוסר הנגישות לרזולוציה גבוהה מאוד ומצלמות דיגיטליות יקרות. בעיקרו של דבר, שיטה הוצגה על איך ללכוד תמונות סידורי בנקודות שונות של מיקומים בתוך דגימה ואז לתפור אותם יחד באמצעות תוכנה חופשית, סופו של דבר yieldinתמונות ברזולוציה גבוהה גרם באופן שהוא הרבה יותר אמין ומהיר יותר מאשר בשיטות קונבנציונליות.
שלבים קריטיים
צביעת Golgi
כמויות המלאי של Golgi ופתרונות פיתוח נשמרים על 4 מעלות צלזיוס לאחסון ועדיין הפרוטוקולים מכתים ודגירה דורשים הפתרון כדי להיות מנוצלים בטמפרטורת חדר. קירור Golgi ופיתוח פתרונות בקרח או במקרר משפיע לרעה על איכות הצביעה דנדריטים. יתר על כן, יש לציין כי השתמשנו פתרונות Golgi פיתוח מהירים. בעוד ההרכב המדויק של פתרון Golgi-קוקס השתמש במחקר זה הוא קניינית, יש מספר רב של מקורות רשימה שבפרוטוקול פרט שיכול לשמש כדי לבצע Golgi-קוקס מכתים 13. עם זאת, השימוש בGolgi-פתרונות אחרים יהיה לשנות באופן משמעותי את משך מכתים ושינויים לשלבים הבאים צריכים להיעשות בהתאם. כמו כן, יחד עם אחרים שיש לנו אותנוed 150 מיקרומטר חלקים עבים לנתח נוירונים DGC 14,15 כפי שיש הסכמה כללית כי חיתוך חלקים של עובי זה coronally ובמקביל לarborizations תא גרגיר המשונן ממזער את הסיכון של חיתוך ענפים דנדריטים.
צביעת DCX
הפרוטוקול מכתים DCX דורש תשומת לב מפורשת לטמפרטורה. כישלון כדי לחמם את הפתרון עד 37 מעלות צלזיוס במהלך תקופת preincubation יפגע באופן משמעותי מכתים ולגרום לאובדן של הדמיה דנדריטים. יתר על כן, תשומת לב לעובי סעיף הוא מוצדק. במחקר זה השתמשנו 70 מיקרומטר חלקים עבים כדי ללכוד את המידה המרבית של arborization הדנדריטים DGCs. מניסיוננו, השימוש בטריטון 0.3% הוא הכרח כפי שמקל באופן משמעותי את החדירה של הנוגדנים בכל העובי של החלקים הצפים. ואכן, מחקרים קודמים השתמשו טריטון לחדור 70 מיקרומטר 16 עבים או אפילו (מיקרומטר 120) העבה יותר 17חלקים כאשר דנדריטים DGC תווית. אנא ראה חוסייני לפרטים מלאים DCX מכתים 18.
לבסוף, יש לציין כי תוכניות חלופיות קוד פתוח (לדוגמא flNeuronTool או Simple_Neurite_Tracer) קיימות עם היכולת להקליט את התנועה של השלב בכיוונים x, y, z. תוכניות מסוג זה יכול לשמש למעקב הדנדריטים כל עוד הם מופעלים כדי לתקשר עם שלב הסריקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עמלות פרסום לכתבה זו ממומנות על ידי MBF Bioscience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
References
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777 (2012).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).
- Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).
- Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).
- Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).
- Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).
- Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).
- Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
- Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6 (9), e24566 (2011).
- Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
- Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8 (5), e62693 (2013).
- Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).
