Évaluation de l'arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l'hippocampe chez la souris

Summary

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Abstract

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Introduction

Modifications dynamiques dans le nombre et la structure des synapses sont les caractéristiques de développement, le vieillissement, et de nombreux troubles neurodégénératifs ^1-3. La capacité des neurones à recevoir et à intégrer l'information synaptique dépend de la morphologie dendritique et modifications dynamiques dans les connexions synaptiques. En effet, une corrélation positive existe entre épines dendritiques et le nombre de synapses, qui à la fois un impact fonction cognitive ^4. Ainsi, il ne est pas surprenant que les dégradations de nombre d 'épines dendritiques ont été associés à un dysfonctionnement cognitif dans un certain nombre de troubles neurologiques ^5-7, incitant un grand intérêt pour la quantification des épines dendritiques. Cependant, la quantification de la densité de la colonne vertébrale reste un temps long et fastidieux qui ne parvient pas à générer des informations utiles concernant la topographie et la distribution des synapses à travers l'arbre dendritique. Heureusement, les méthodes de coloration (par exemple, l'appareil de Golgi-Cox et doublecortine (DCX)) en conjonctionavec des techniques d'imagerie sophistiquées peuvent être utilisées pour surmonter les obstacles actuels et produire des images haute résolution de l'arborisation dendritique d'une manière fiable et rapide. Alors que méthode de coloration de Golgi-Cox peut être déployée pour évaluer l'état de l'arborisation dendritique dans tous les neurones ^8, DCX peut être déployé pour étiqueter neurones nouveau-nés en particulier dans le gyrus denté et la zone sous-ventriculaire ^9, une considération importante étant donné que la neurogenèse se produit à la fois ces régions tout au long de la durée de vie ^10,11.

Après la coloration, deux méthodes d'imagerie ont été déployés pour évaluer les caractéristiques dendritiques: i) l'imagerie en temps réel (RTI) et ii) la profondeur de l'imagerie de champ (EDFI) étendu. La technique RTI fournit un moyen de retracer et de quantifier la longueur et l'ordre des arborisation le long des segments et des branches dendritiques individuelles. Ainsi il permet une estimation de la surface totale et le volume occupé par chaque arbre dendritique. Plus de specifically, dans le procédé RTI l'utilisateur identifie de façon continue les segments et recentre itérative comme le neurone traçage logiciel recueille les x, y et z des coordonnées de la structure dendritique et reconstitue la trajectoire de la structure dendritique en 3D. En comparaison, la méthode EDFI fournit un moyen assez simples et rapides pour évaluer la densité dendritique dans des échantillons de tissus assez épaisses en générant une image composite, fournissant des informations sur l'ensemble de l'axe z. Pour ce faire, l'utilisateur enregistre des fichiers vidéo à haute définition sur toute l'épaisseur de la section puis utilise un logiciel pour rechercher les images vidéo pour identifier les points dans lequel un pixel est entièrement mis au point. Par la suite, les pixels ciblées sont fusionnés et intégrés dans une haute résolution, image 2D composite. Cette image composite contient tous les pixels qui sont de mise au point quelle que soit leur position dans l'axe z. L'analyse qualitative et quantitative de ces images en 2D peut être utilisé par la suite pour déterminer la densitéramification dendritique de chaque zone.

Enfin, nous présentons une méthode pour générer panoramique images de très haute résolution pour l'analyse et l'évaluation des dendrites dans toute une région d'intérêt. Cette technique peut être déployé pour surmonter le manque d'accès à très haute résolution et les appareils photo numériques coûteux. En utilisant cette méthode, permet de capturer des images en série à différents endroits le long du x et y axes et ensuite automatiquement des points les ensemble en utilisant un logiciel (par exemple, Image Composite Editor). En particulier, ce procédé peut être utilisé pour l'évaluation qualitative et quantitative de l'arborisation dendritique dans un assez large domaine.

Protocol

NOTE: Des expériences ont été menées en conformité avec les normes éthiques approuvés par le Comité de la recherche animale au système de soins de santé Anciens Combattants Palo Alto. 1. Golgi-Cox Coloration l'extraction du cerveau et de la coloration Le 1er jour, anesthésier profondément souris avec 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine avant euthanasie par exsanguination. Retirez délicatement la calotte crânienne et disséquer le…

Representative Results

L'étendue de l'arborisation résultant de cellules granulaires du dentate existants et nouveaux-nés a été analysée chez des souris de type sauvage en utilisant soit Golgi-Cox ou DCX coloration (figure 1). Segments de cellules dendritiques DCX-positifs ont été trouvés pour être de 13 à 36 microns de long. La distribution normale de longueur dendritique a été testé en utilisant le test de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; les figures 4…

Discussion

Ici, deux méthodes ont été décrites pour quantifier l'ampleur de l'arborisation dendritique dans les neurones matures et les nouveaux-nés en utilisant des méthodes classiques de coloration en collaboration avec RTI et EDFI. L'acquisition d'images haute résolution de neurones fournit une méthode extrêmement utile pour tester les effets délétères des troubles neurodégénératifs et, à son tour, fournit un moyen d'évaluer les stratégies thérapeutiques qui ciblent les neurones de l'h…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00