Introduction
Alterações dinâmicas no número e na estrutura das sinapses são características de desenvolvimento, envelhecimento, e inúmeras doenças neurodegenerativas 1-3. A capacidade dos neurônios de receber e integrar informações sináptica depende morfologia dendrítica e alterações dinâmicas em conexões sinápticas. Na verdade, existe uma correlação positiva entre a espinha dendrítica e número de sinapses, que tanto impacto função cognitiva 4. Assim, não é surpreendente que decréscimos da espinha dorsal dendríticas têm sido associados com a disfunção cognitiva em um número de distúrbios neurológicos 5-7, provocando um grande interesse em dendrítica quantificação espinha. No entanto, a quantificação da densidade da coluna continua a ser uma tarefa consumidora de tempo e tedioso que falha para gerar informação útil a respeito da topografia e distribuição de sinapses em toda a árvore dendrítica. Felizmente, métodos de coloração (por exemplo, de Golgi-Cox e duplacortina (DCX)) em conjuntocom técnicas de imagem sofisticadas podem ser utilizadas para superar as barreiras atuais e produzir imagens de alta resolução de arborização dendrítica de uma maneira confiável e rápida. Enquanto método de coloração Golgi-Cox pode ser implantado para avaliar o estado de arborização dendrítica em todos os neurônios 8, DCX pode ser implantado para rotular os neurônios recém-nascidos particularmente no giro denteado e zona subventricular 9, uma consideração importante, dado que a neurogênese ocorre tanto estas regiões em todo o tempo de vida 10,11.
Após a coloração, dois métodos de imagem foram mobilizados para avaliar as características dendríticas: i) imagens em tempo real (RTI) e ii) Maior profundidade do campo de imagem (EDFI). A técnica RTI fornece um meio para localizar e quantificar o comprimento e ordem de arborização ao longo dos segmentos dendríticas individuais e galhos. Assim, possibilita estimar a área total e do volume ocupado por cada árvore dendrítica. Mais specifically, no método RTI o usuário identifica continuamente os segmentos e reorienta iteratively como o rastreamento de software neurônio recolhe os x, y, e z coordenadas da estrutura dendrítica e reconstrói a trajetória da estrutura dendrítica em 3D. Comparativamente, o método EDFI fornece um meio bastante simples e rápidos para avaliar a densidade dendrítica em amostras de tecido, em vez de espessura, gerando uma imagem composta, fornecendo informações sobre o eixo z inteiro. Para fazer isso, o utilizador grava arquivos de vídeo de alta definição em toda a espessura da secção e, em seguida, usa software para pesquisar os quadros de vídeo para identificar pontos em que um pixel é completamente no foco. Em seguida, os pixels focadas são fundidas e integradas em uma imagem 2D compósito de alta resolução,. Esta imagem composta contém todos os pixels que estavam em foco, independentemente da sua posição no eixo z. A análise qualitativa e quantitativa destas imagens 2D pode ser utilizada subsequentemente para determinar a densidadede ramificação dendrítica em cada campo.
Por fim, apresentamos um método panorâmica para a geração de imagens extremamente de alta resolução para a análise e avaliação das dendrites em toda uma região de interesse. Esta técnica pode ser implantado para superar a falta de acesso a muito alta resolução e câmeras digitais caros. Usando este método, uma captura imagens em série em diferentes locais ao longo do xey eixos e, em seguida, automaticamente junta-as usando um freeware (por exemplo, Imagem Composite Editor). Notavelmente, este método pode ser utilizado para a avaliação qualitativa e quantitativa de arborização dendrítica numa área bastante larga.
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Protocol
NOTA: Os experimentos foram conduzidos de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal no Sistema Único de Saúde Veterans Affairs Palo Alto.
1. A coloração de Golgi-Cox
- Extracção do cérebro e coloração
- No 1º dia, profundamente anestesiar ratos com 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina antes eutanásia via sangria.
- Retire cuidadosamente o calvarium e dissecar o cérebro.
- Primeiro remover a pele na parte superior do crânio, colocando uma tesoura curvada na parte superior do cerebelo e cortado suavemente através da calvária paralelo ao sulco central, com a ponta da tesoura apontado para fora, movendo-se na direcção para o bolbo olfactivo. Repita esse processo em ambos os lados.
- Use um pincet cirúrgico para levantar o calvarium enquanto girando-a para os bulbos olfatórios e quebrá-lo fora. Em seguida, vire o crânio de cabeça para baixo e usar uma picareta para cortar através da óticanervos e afrouxe o cérebro. Finalmente, use a pick para separar o cérebro da medula espinhal ao nível do forame magno.
- Mergulhe imediatamente o cérebro em 15 ml de venda no mercado, não diluído solução Golgi-Cox. Armazenar o cérebro em solução de Golgi de uma tampado, 20 ml garrafa de vidro à temperatura ambiente no escuro.
- No 2º dia, despeje lentamente a solução e substituí-lo com 15 ml de solução de Golgi-Cox fresco. Tampe novamente a garrafa que contém o cérebro e deixar em repouso por mais 9 dias no escuro.
- Seccionamento e embedment
- No 11º dia, coloque os cérebros em solução de sacarose 30%, preparadas em ddH2O para a desidratação. Alterar a solução preparada de fresco com sacarose a 30% após 12 horas. Incubar os cérebros em uma solução de sacarose a 30% durante 3 dias a 4 ° C.
- No 14 ° dia, encher o reservatório de vibratome com uma solução de sacarose a 30% até que a lâmina está coberta. Defina a velocidade de 1 mm / s com uma amplitude de 0,95 mm.
- Seque os cérebros com um Kimwipe para remover o excesso de umidade e remover o cerebelo usando uma lâmina de barbear para cortar coronally.
- Monte firmemente todo o cérebro para a plataforma vibratome usando supercola e deixe-a marcada para 2-4 min. Inserir a plataforma com o cérebro respeitado para dentro do reservatório e ajustar a lâmina para o topo do cérebro.
- Usando o vibratome, fatiar o cérebro em 150 mm de espessura à temperatura ambiente, lembrando-se de mudar a lâmina após cada 3 cérebro.
- Pegue as seções do reservatório usando um pequeno pincel de ponta e mergulhe-os em uma placa de Petri contendo 0,3% de gelatina feita em DDH 2 O. Embora as secções permanecem na placa de Petri, adicionar 0,5 ml de 0,3% de gelatina em cada lâmina e usar uma escova para espalhar e revestem-se as lâminas SuperFrost +.
- Levante com cuidado as seções imersos da placa de petri e colocá-los nas lâminas gelatinizadas. Orientar as seções do cérebro portocá-los apenas em seus lados e não nos tops.
- Depois de cerca de dez minutos, revestir as seções com 30% de sacarose antes do tecido secar completamente. Em seguida, o ar seco das lâminas preparadas em um lugar escuro em um rack de slides durante 3 dias.
- Diluir disponível comercialmente 10x solução Desenvolvendo para 1x usando DDH 2 O. Mergulhe as lâminas em solução de desenvolvimento para 7-10 min. Lavar as lâminas três vezes em DDH 2 O.
- Desidratação
- Preparar 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e soluções de etanol usando destilada DDH 2 O.
- Mergulhe as lâminas em soluções de etanol cada vez mais elevados para 10 min cada.
- Mergulhe as lâminas em solução de etanol 100% 3 vezes por 10 min de cada vez.
- Mergulhe as lâminas em 100% xileno 3 vezes consecutivas por 5 min cada, mantendo as seções na solução final até que estejam escorregou-cover.
- Coloque uma quantidade generosa de DPX (ftalato de di-n-butil em xileno) meio de montagem (abfora de 1-1,5 ml) em cada slide usando uma pipeta de transferência de plástico. Com cuidado, coloque lamelas para evitar bolhas.
- Ar seco tampa escorregou-cerebrais seções horizontalmente durante 3 dias.
2. duplacortina Coloração
- Profundamente anestesiar (veja o passo 1.1.1) os animais.
- Execute perfusão cardíaca com recém-preparados paraformaldeído 4% em tampão fosfato 12.
- Extraia os cérebros (ver 1.1.2) e loja em 45 ml de 4% de paraformaldeído a 4 ° C durante a noite num agitador de balanço.
- Transferir os cérebros a uma solução de sacarose a 30% e esperar por desidratação completa durante 48 horas a 4 ° C. Remover os cérebros a partir de sacarose e colocá-las directamente em blocos de cobre colocados sobre gelo seco.
- Preencha o bloco com a temperatura ideal de corte (OCT) composto e marcar a orientação do cérebro usando o bulbo olfatório como um marco.
- Usando um criostato, cortar 70 seções micron de espessura a -20 ºC e colocá-losem solução de crioprotector (25% de etileno glicol, glicerol a 25%, em tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,4) e manter a -20 ° C até à sua utilização.
- Adicione uma solução de 50% de metanol e 50% de crioprotector. A esta solução junta-se 0,5% de peróxido de hidrogénio (vol / vol). Incubar secções de flutuação durante 30 minutos à temperatura ambiente.
- Seções quentes em 37 ºC em TBS (salina Tris) por 30-40 min, colocando-os em um forno histológica.
- Incubam-se as secções com 0,3% de triton e 3% de soro normal de cavalo durante 45 min à temperatura ambiente antes da imunocoloração. Incubam-se as secções durante a noite a 4 ° C em 3 ml de solução de anticorpo a DCX diluído 1: 500 em TBS com 0,3% de triton e 1% de soro normal de cavalo.
- No dia seguinte, lave as seções 3 vezes consecutivas em TBS (10 min cada).
- Incubar secções com um cavalo anti-cabra biotinilado (1: 200 em TBS) durante duas horas à temperatura ambiente. Lave as seções 3 vezes consecutivas em TBS (10 min cada).
- Incubar tbainha com ABC Lite (1: 1000) durante 1,5 h à temperatura ambiente.
- Adiciona-se 5 ul de 30% de H 2 O 2 para um comprimido de 10 mg de DAB solução (3,3 "-Diaminobenzidine) dissolvido em 15 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 7,6). Incubar as secções imediatamente nesta solução durante 5 minutos.
- Terminar a reacção por lavagem com TBS gelado três vezes, seguido por uma lavagem em TBS à temperatura ambiente.
- Desidratar secções, utilizando uma série de soluções de etanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min cada), clara em xileno e, em seguida cobrir deslizamento usando DPX como no passo 1.3.
3. Visualização
- Após a secagem completa das secções, remover o excesso de DPX no topo das lâminas com uma lâmina afiada, e colocá-las sobre a plataforma de varrimento do microscópio. O sistema é composto por um microscópio equipado com plataforma de varrimento, joystick, e uma câmara de 12 bits cor.
- Inicie o programa. Abra um novo arquivo de dados.
- Lugarum ponto de referência na tela, clicando com o ponteiro do mouse em qualquer lugar. Isso irá ativar todos os ícones do painel de ferramentas da janela do programa.
- Clique no ícone "Joystick Livre" na barra de ferramentas e, em seguida, usar o joystick para localizar giro dentado do hipocampo na primeira seção.
- Na aba "Ferramentas" da janela do programa, selecione "Serial Seção Manager". Clique no ícone "Novo capítulo" no canto inferior esquerdo da janela. Isso abrirá a janela "Serial Seção Configuração".
- Selecione a janela Configuração da Seção de série e, em seguida, digite o número total de seções que contêm regiões do hipocampo. Selecione o intervalo de avaliação. Digite a espessura de corte de corte (70 mm para DCX e 150 mm para seções Golgi-coradas).
- Comece traçando a região giro denteado, clicando no ícone "Freehand Desenho do Contorno" na barra de ferramentas. Faça o contorno da camada granular denteado. </ Li>
- Selecione "100X" a partir do menu "Ampliação". Adicionar uma gota de óleo de imersão em secção e exibir o objectivo de 100X. Localize os corpos celulares giro denteado e dendrites no âmbito deste objectivo.
- Concentre-se em um neurônio selecionado e clique no ícone "Neuron Tracing" na barra de ferramentas. Traçar a circunferência do corpo celular giro denteado. Quando terminar o rastreio, clique direito para selecionar "Finish celular Body".
- Comece traçando as dendrites manualmente em X, Y e Z e siga cada ramo usando o botão de joystick e z-motor. Em um nó bifurcação ou trifurcação, selecione a opção correspondente no menu suspenso em cima do botão direito. Seguir a cada um dos ramos que surgem a partir desses nós. No final de cada ramo botão direito e selecione "Ending" no menu suspenso.
- Usando os ícones chave de seta na janela do software selecionar aleatoriamente outra célula giro denteado e siga o mesmo procedimento que described na etapa 3,9-3,10. Salve todo o traçado.
- Inicie o software de rastreamento neuronal.
- Abra o primeiro arquivo de dados NRX do primeiro mouse do grupo experimental. Anexe o arquivo NRX do segundo rato do grupo experimental. Continue até que todos os arquivos NRX deste grupo são acrescentados.
- Sob a guia Análise, selecione "Fan In-diagrama". Isso abre a janela In-análise a Fan. Marca de verificação "dendrites" e clique em Exibir, que retrata os comprimentos e padrões de ramificação dos dendritos para este grupo de ratos (Figura 1).
4. EDFI
NOTA: Este método permite ao utilizador gravar rapidamente um grande número de imagens por meio do eixo z de cada campo e gerar uma imagem 2D que contém todos os pixels focadas em todo o eixo z. O resultado será uma imagem composta que contém todos os pixels focadas a partir de imagens recolhidas.
- Ligue o microscópio para uma cam digitaisera. Coloque as secções em primeiro lugar na fase de varredura ligado ao microscópio e depois mudar para uma objetiva de 10X. Mover a fase com a área de interesse.
- Iniciar um programa de captura de vídeo.
- Pressione o botão de gravação. Assim que o botão é pressionado ficha, usar o botão de macro-focagem para mover a partir do topo para o fundo da secção de um total de 4 segundos. Salve o arquivo de vídeo resultante.
- Use ImageJ freeware para converter os arquivos de vídeo AVI em um formato não comprimido, abrindo o arquivo e salvá-las no formato de arquivo descompactado.
- Iniciar um programa de análise de imagem e abra o arquivo AVI. Ir para o menu "Processos" e clique em "profundidade de campo estendida". Selecione o arquivo de vídeo correspondente. Nas opções de "Saída", selecione "Gerar Composite Melhor-Focus Imagem".
- Nas opções de "análise de Foco", selecione "Iluminação Normalizado" e opções "Max contraste local". Em seguida, selecione "Crecomi ". A imagem resultante representa todos os pixels focadas em todo o eixo z (Figura 2).
- Salve a imagem resultante.
5. Gerando Extremamente-imagens de alta resolução
NOTA: Este método permite que o usuário para gerar automaticamente baixa ampliação e extremamente imagens de alta resolução a partir de imagens de alta ampliação de alta resolução de uma forma automatizada.
- Coloque as secções em primeiro lugar na plataforma de varrimento ligado ao microscópio. O microscópio é ligado a uma câmara digital. Mover a fase com a área de interesse.
- Iniciar um programa de aquisição de imagem.
- Use uma objetiva de 10X e adquirir e guardar as imagens de alta resolução (4076 x 3116) a partir da região de interesse certificando-se de ter pelo menos 10% de sobreposição.
- Execute Imagem Composite Editor para costurar imagens.
- Ir para o menu Arquivo e clique em "Novo Panorama". Selecione a pasta na qual as imagens são stORed. Selecione as imagens que pertencem a uma mesma região e pressione "OK".
- Pressione o botão "Exportar para o disco" e salve a imagem. Esta imagem representa uma imagem extremamente alta-resolução da zona de interesse que pode ser utilizado para a análise e / ou demonstração (figura 3).
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Representative Results
O grau de arborização resultantes de células de grânulos dentados existentes e recém-nascidos foi analisado em ratinhos do tipo selvagem usando o Golgi-Cox ou coloração DCX (Figura 1). Segmentos de células dendríticas DCX-positivos foram encontrados para ser 13-36 mícrons de comprimento. A distribuição normal de comprimento dendríticas foi testada utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; As Figuras 4 e 5).
Na análise de comprimento de segmentos de arborização por fim, os segmentos mais longos foram encontrados no primeiro fim de arborização (38,38 + 1,45 mm). Padrões semelhantes foram encontrados para a superfície (111,98 + 3,93 micron quadrado) e volume (27,93 + 1,03 mm cúbico). A correlação linear entre o comprimento dos segmentos e a área de superfície e / ou o volume ocupado por estes segmentos foram também testados. Tanto a superfície (p = 0,001, r 2 = 0,873) e volume (p = 0,001, r 2 = 0,621) correlated significativamente com o comprimento de cada segmento dendrítica.
Figura 1:. Aqui Ventilador diagrama foi utilizado para avaliar o comprimento dendrítico das células granulares do denteado do hipocampo Esta ferramenta de visualização pode ser utilizado para comparar os efeitos de diferentes intervenções terapêuticas ou genótipos em comprimento dendrítica. A unidade de medição é um.
Figura 2: Visualização da arborização dendrítica sem (A) e com (B) EDFI métodos. O método tradicional de encontrar o melhor plano de foco foi comparada com a EDFI (dados não mostrados) e considerados significativamente maiores valores de área dendrítica usando o método EDFI (p = 0,02). Barra de escala= 100 pm.
Figura 3:. A imagem de alta resolução da região do hipocampo em um rato Esta imagem extremamente alta resolução é automaticamente construído a partir de 10 de costura (4076 x 3116) imagens -pixel. Escala bare = 100 mm.
Figura 4:. A quantificação de comprimento e volume ocupado por dendritos em diferentes ordens de ramificação O comprimento e volume máximo foram realizados na ordem 1.
Figura 5:. Histograma de comprimento dendrítico das células granulares do denteado A maioria dos segmentos de D dendríticasDendritos CX-coradas foram 13-26 em comprimento. A linha pontilhada vermelho descreve a distribuição normal dos dados apresentados.
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Discussion
Aqui, dois métodos foram descritos para quantificar a extensão da arborização dendrítica em neurônios maduros e recém-nascidos, usando métodos de coloração convencionais em conjunto com RTI e EDFI. A aquisição de imagens de alta resolução de neurónios proporciona um método extremamente útil para testar os efeitos deletérios de doenças neurodegenerativas e, por sua vez, proporciona um meio para avaliar estratégias terapêuticas que visam neurónios do hipocampo.
Enquanto o método RTI foi utilizada para capturar os dados em profundidade relativas à quantidade de arborização e topografia, o método EDFI falhar a fornecer informação referente à complexidade dos segmentos individuais ou árvores. Não obstante, os benefícios do método EDFI advir do facto de que ele não requer a compra de equipamento caro e é menos demorado.
Um programa de análise de imagens foi usado para realizar EDFI em arquivos de vídeo. Ter acesso a alta resolução e rápidocâmaras permite a recolha de um grande número de imagens de toda a espessura de cada campo e gera imagens que representam verdadeiramente as dimensões x, y, e z. Uma desvantagem do método EDFI refere-se ao facto de que pode haver mais do que um pixel (mesmo x e y) centrada em planos diferentes ao longo do eixo z. Um método está sendo prevista para atribuir cores diferentes para esses pixels que representam precisamente a extensão dos perfis 3D em imagens 2D. Deve notar-se que o método EDFI também poderia ser usado para a análise de perfis celulares (por exemplo, sinapses, microglia e astrócitos). Além disso, este método pode ser utilizado para analisar o grau de distribuição da microglia, em toda a espessura de uma secção 7. Os dois métodos descritos aqui podem ser utilizados de uma forma complementar. Enquanto o método RTI fornece informação exacta sobre a topografia do padrão de ramificação, o EDFI dá-nos um método bastante simples e expedito para avaliar a densidade de dendritos em uma área de noteresse. Notavelmente, a espessura das secções que podem ser adquiridos com a EDFI são altamente variáveis como o intervalo de focagem z na platina do microscópio, em combinação com a focagem óptica dos objectivos microscópio ditam as fronteiras dos EDFI.
Os métodos aqui descritos têm o potencial para ser implantado em vários contextos. Neste estudo, forneceu um meio para avaliar mudanças na pré arborização dendrítica e pós-intervenção, enquanto EDFI foi utilizado para quantificar a ativação microglial 7. Assim, esta técnica pode ser objecto de qualquer aplicação em que o objectivo final é o de avaliar as modificações nas pequenas perfis que podem ser encontrados em várias camadas.
Finalmente, estas técnicas podem superar a falta de acesso a muito alta resolução e câmaras digitais caros. Em essência, um método mostrou-se sobre a forma de capturar imagens em série em diferentes pontos de locais dentro de um espécime e depois uni-las usando um freeware, em última análise, yielding imagens de alta resolução de uma maneira que é muito mais confiável e rápida do que os métodos convencionais.
As etapas críticas
Coloração Golgi
Banco de quantidades de Golgi e soluções em desenvolvimento são mantidas a 4 ° C durante o armazenamento e no entanto os protocolos de coloração e requerem incubação da solução a ser utilizados à temperatura ambiente. O resfriamento do Golgi e Desenvolvimento de soluções no gelo ou na geladeira afeta negativamente a qualidade da coloração dendrítica. Além disso, deve-se notar que usamos soluções de Golgi em rápido desenvolvimento. Enquanto a composição exacta da solução de Golgi-Cox utilizado neste estudo é proprietária, existem várias fontes que lista em detalhe protocolo que pode ser usado para realizar a coloração de Golgi de Cox-13. No entanto, a utilização de outras soluções-Golgi irão alterar significativamente a coloração durações e modificações para estes passos deverá ser feita em conformidade. Além disso, nós, juntamente com os outros têm de nósed 150 mm de espessura para analisar neurônios DGC 14,15 como é geralmente aceite que o corte de seções deste espessura coronally e em paralelo com as arborizações célula granular dentados minimiza o risco de corte de galhos dendríticas.
Coloração DCX
O protocolo de coloração DCX requer atenção explícita à temperatura. A não aquecer a solução a 37 ° C durante o período de pré-incubação vai prejudicar significativamente a coloração e resultar em perda de visualização dendrítica. Além disso, é garantido atenção a espessura de corte. Neste estudo foram utilizadas 70 mm de espessura para capturar o limite máximo dos PEDs arborização dendrítica. Na nossa experiência, a utilização de 0,3% de triton é uma necessidade, uma vez que facilita significativamente a penetração do anticorpo através da espessura das secções flutuantes. De fato, estudos anteriores usaram triton para penetrar 70 mm de espessura 16 ou mesmo mais grosso (120 mm) 17seções quando rótulo dendritos DGC. Por favor, veja Hussaini para detalhes completos de DCX coloração 18.
Finalmente, deve notar-se que existem programas de código aberto alternativos (por exemplo, flNeuronTool ou Simple_Neurite_Tracer) com a capacidade de gravar o movimento da fase em direcções x, y, e z. Esses programas podem ser utilizados para o rastreio dendríticas, enquanto eles estão habilitados a comunicar com a plataforma de varrimento.
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Disclosures
Taxas de publicação do presente artigo são patrocinados por MBF Bioscience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
References
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