Introduction
تغييرات ديناميكية في عدد وهيكل من نقاط الاشتباك العصبي هي السمات المميزة للتنمية، والشيخوخة، والعديد من الاضطرابات العصبية 1-3. قدرة الخلايا العصبية لاستقبال ودمج المعلومات متشابك تعتمد على التشكل شجيري والتعديلات الديناميكية في الاتصالات متشابك. في الواقع، وجود علاقة إيجابية بين العمود الفقري شجيري وعدد المشبك، وكلاهما يؤثر الوظيفة الإدراكية 4. وبالتالي، فإنه ليس من المستغرب أن التناقصات في عدد العمود الفقري شجيري ارتبطت الخلل المعرفي في عدد من الاضطرابات العصبية 5-7، مما دفع اهتماما كبيرا في شجيري العمود الفقري الكمي. ومع ذلك، فإن القياس الكمي للكثافة العمود الفقري يبقى تستغرق وقتا طويلا ومهمة شاقة أن فشل لتوليد المعلومات المفيدة عن التضاريس وتوزيع نقاط الاشتباك العصبي في جميع أنحاء شجرة شجيري. لحسن الحظ، وأساليب تلطيخ (على سبيل المثال، جولجي كوكس وdoublecortin (DCX)) بالاشتراكمع تقنيات التصوير المتطورة يمكن استخدامها للتغلب على الحواجز الحالية وإنتاج صور عالية الدقة من تشجر شجيري بطريقة موثوقة وسريعة. في حين جولجي كوكس التلوين بطريقة يمكن نشرها لتقييم حالة تشجر شجيري في جميع الخلايا العصبية 8، DCX يمكن نشرها لتسمية الخلايا العصبية ولدت حديثا وخاصة في منطقة التلفيف المسنن وsubventricular 9، وهو عامل مهم بالنظر إلى أن تكوين الخلايا العصبية يحدث في كل من هذه المناطق في مختلف مراحل العمر 10،11.
وبعد تلطيخ، تم نشر طريقتين التصوير لتقييم الخصائص شجيري: ط) التصوير في الوقت الحقيقي (RTI) والثاني) عمق طويلة من التصوير الميدان (EDFI). وتوفر هذه التقنية RTI وسيلة لتتبع وقياس طول وترتيب تشجر على طول قطاعات وفروع شجيري الفردية. وبالتالي فإنه تمكن واحد لتقدير المساحة الكلية وحجم المحتلة من قبل كل شجرة شجيري. عن الصورةpecifically، في طريقة RTI المستخدم يحدد بشكل مستمر القطاعات ويعيد تركيز تكرارا مثل الخلايا العصبية تتبع البرمجيات بجمع X، Y، Z والإحداثيات للهيكل شجيري ويعيد مسار هيكل شجيري في 3D. نسبيا، ويوفر طريقة EDFI وسيلة بسيطة نوعا ما، والمعجل لتقييم كثافة الجذعية في عينات الأنسجة السميكة وليس عن طريق توليد صورة مركبة، وتوفير المعلومات على كامل المحور Z. للقيام بذلك، ويسجل المستخدم عالية الوضوح ملفات الفيديو في جميع أنحاء سماكة المقطع ثم يستخدم البرنامج للبحث في إطارات الفيديو للتعرف على نقاط حيث بكسل تماما في التركيز. بعد ذلك، يتم دمج بكسل مركزة وإدماج عالية الدقة، صورة 2D المركبة. تحتوي هذه الصورة المركبة كل بكسل التي كانت في التركيز بغض النظر عن وضعهم في المحور z. يمكن استخدام تحليل نوعي وكمي لهذه الصور 2D في وقت لاحق لتحديد الكثافةالمتفرعة من شجيري في كل حقل.
وأخيرا، فإننا نقدم وسيلة بانورامية لتوليد غاية صور عالية الدقة لتحليل وتقييم التشعبات في المنطقة بأسرها من الفائدة. ويمكن نشر هذه التقنية للتغلب على عدم الحصول على جدا عالية الدقة والكاميرات الرقمية باهظة الثمن. باستخدام هذه الطريقة، واحد يلتقط الصور المتسلسلة في مواقع مختلفة على طول X- و y محاور وبعد ذلك تلقائيا غرز معا باستخدام مجانية (على سبيل المثال، محرر الصور المركبة). والجدير بالذكر أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لتقييم النوعي والكمي للتشجر شجيري في منطقة واسعة إلى حد ما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب وفقا للمعايير الأخلاقية التي وافقت عليها لجنة أبحاث الحيوانية في نظام الرعاية الصحية شؤون المحاربين القدامى بالو ألتو: ملاحظة.
1. جولجي كوكس تلطيخ
- استخراج الدماغ وتلطيخ
- في يوم 1، تخدير عميق الفئران مع 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ زيلازين قبل القتل الرحيم عن طريق استنزاف.
- إزالة بعناية القبة وتشريح خارج الدماغ.
- أولا إزالة الجلد في الجزء العلوي من الجمجمة، ووضع مقص منحني على الجزء العلوي من المخيخ وبلطف قطع طريق مواز القبة إلى التلم المركزي مع غيض من مقص وأشار إلى الخارج، تتحرك في الاتجاه نحو البصلة الشمية. كرر هذه العملية على الجانبين.
- استخدام pincet الجراحي لرفع القبة بينما يحولها نحو بصيلات الشم وكسر تشغيله. ثم، والوجه الجمجمة رأسا على عقب واستخدام بيك لقطع طريق البصريةالأعصاب وتخفف الدماغ. وأخيرا، استخدام المعول لفصل المخ من الحبل الشوكي على مستوى ماغنوم الثقبة.
- تزج فورا الدماغ في 15 مل من المتاحة تجاريا، غير مخفف حل جولجي كوكس. تخزين الدماغ في حل جولجي في، 20 مل زجاجة توج في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- في اليوم 2، صب ببطء الحل واستبدالها 15 مل الطازجة حل جولجي كوكس. خلاصة الزجاجة التي تحتوي على العقول وترك دون عائق لمدة 9 أيام أخرى في الظلام.
- باجتزاء والغرز
- في اليوم ال11، ضع العقول في 30٪ من محلول السكروز، الذي أعد في DDH 2 O للجفاف. تغيير الحل مع الطازجة 30٪ سكروز بعد 12 ساعة. احتضان العقول في حل السكروز 30٪ لمدة 3 أيام في 4 درجات مئوية.
- في اليوم ال14، وملء الخزان من vibratome مع حل السكروز 30٪ حتى يتم تغطية شفرة. ضبط سرعة إلى 1 مترم / ث مع اتساع 0.95 ملم.
- صمة عار أدمغة مع Kimwipe لإزالة الرطوبة الزائدة وإزالة المخيخ باستخدام شفرة حلاقة لخفض coronally.
- بحزم تركيب الدماغ كله على منصة vibratome superglue به والسماح لها لوضع لمدة 2-4 دقيقة. إدراج منصة مع الدماغ الالتزام إلى الخزان وضبط نصل إلى الجزء العلوي من الدماغ.
- باستخدام vibratome، شريحة الدماغ إلى 150 ميكرون أبواب سميكة في درجة حرارة الغرفة، وتذكر لتغيير شفرة الدماغ بعد كل 3.
- التقاط مقاطع من الخزان باستخدام فرشاة يميل الصغيرة وتزج بهم في طبق بتري تحتوي على 0.3٪ الجيلاتين المحرز في DDH 2 O. في حين لا تزال المقاطع في طبق بتري، إضافة 0.5 مل من 0.3٪ الجيلاتين على كل شريحة واستخدام فرشاة لنشر ومعطف superfrost + الشرائح.
- اختيار بلطف صعودا الأقسام مغمورة من طبق بتري ووضعها على الشرائح مهيلم. توجيه أقسام الدماغ التي كتبهامسها فقط على جنوبهم وليس على قمم.
- بعد حوالي عشر دقائق، ومعطف الأقسام مع 30٪ السكروز قبل الأنسجة يجف تماما. ثم الهواء الجاف الشرائح مستعدة في مكان مظلم في رفوف الشريحة لمدة 3 أيام.
- تمييع المتاحة تجاريا 10X حل النامية على 1x أخرى باستخدام DDH 2 O. تزج الشرائح في تطوير الحل لمدة 7-10 دقيقة. شطف الشرائح 3 مرات في DDH 2 O.
- جفاف
- إعداد 20٪، 30٪، 40٪، 50٪، 60٪، 70٪، 80٪، 90٪، و 95٪ حلول الإيثانول باستخدام المقطر ده 2 O.
- نقع الشرائح في حلول الإيثانول أعلى على نحو متزايد لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- نقع الشرائح في 100٪ من محلول الإيثانول 3 مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة.
- نقع الشرائح في 100٪ زيلين 3 مرات متتالية لمدة 5 دقائق لكل منهما، حفظ المقاطع في الحل النهائي حتى هي من تراجع الغطاء.
- وضع كمية سخية من DPX (الفثالات دي ن بوتيل في الزيلين) تصاعد المتوسطة (أ بمن 1-1.5 مل) على كل شريحة باستخدام الماصة نقل البلاستيكية. وضع بعناية coverslips لتجنب الفقاعات.
- الهواء الجاف غطاء تراجع في الدماغ أقسام أفقيا لمدة 3 أيام.
2. Doublecortin تلطيخ
- تخدير عميق (راجع الخطوة 1.1.1) الحيوانات.
- أداء نضح القلب مع الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ المحرز في الفوسفات عازلة 12.
- استخراج العقول (انظر 1.1.2) وتخزينها في 45 مل من 4٪ امتصاص العرق في 4 درجات مئوية خلال الليل على شاكر هزاز.
- نقل أدمغة إلى حل السكروز 30٪ وانتظر الجفاف الكامل لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية. إزالة العقول من السكروز ووضعها مباشرة على كتل النحاس وضعت على الثلج الجاف.
- ملء مع كتلة المثلى درجة حرارة القطع (OCT) مجمع وبمناسبة التوجه من الدماغ باستخدام البصلة الشمية كمعلم.
- باستخدام ناظم البرد، وقطع 70 أقسام ميكرون سميكة في -20 درجة مئوية ووضعهافي حل cryoprotectant (25٪ جلايكول الإثيلين، و 25٪ الجلسرين، في 0.05 M الصوديوم العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4) والاحتفاظ في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- جعل حل 50٪ الميثانول cryoprotectant و 50٪. لهذا الحل إضافة 0.5٪ بيروكسيد الهيدروجين (المجلد / المجلد). احتضان أقسام عائمة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أقسام الدافئة في 37 درجة مئوية في TBS (المالحة تريس مخزنة) لمدة 30-40 دقيقة عن طريق وضعها في فرن النسيجي.
- احتضان المقاطع مع 0.3٪ تريتون و 3٪ مصل الحصان العادي لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل المناعية. احتضان الأقسام في 4 درجات مئوية خلال الليل في 3 مل من محلول من الأجسام المضادة DCX المخفف 1: 500 في TBS مع 0.3٪ تريتون و 1٪ الحصان العادي المصل.
- في اليوم التالي يغسل المقاطع 3 مرات متتالية في TBS (10 دقيقة لكل منهما).
- احتضان المقاطع مع الحصان المعقدة البيروكسيديز مكافحة الماعز (1: 200 في TBS) لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل أقسام 3 مرات متتالية في TBS (10 دقيقة لكل منهما).
- احتضان رتنحنح مع ABC لايت (1: 1،000) مقابل 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 5 ميكرولتر من 30٪ H 2 O 2 إلى قرص واحد من 10 ملغ من DAB (3،3 "-Diaminobenzidine) حل الذائبة في 15 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6). احتضان أقسام فورا في هذا الحل لمدة 5 دقائق.
- إنهاء رد فعل من قبل غسلها مع TBS الجليد الباردة ثلاث مرات تليها واحد يغسل في TBS في درجة حرارة الغرفة.
- يذوى المقاطع باستخدام سلسلة من الحلول الإيثانول (50٪، 60٪، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪، 100٪، 5 دقائق لكل منهما)، واضحة في الزيلين، ومن ثم تغطية زلة باستخدام DPX كما في الخطوة 1.3.
3. التصور
- وبعد التجفيف الكامل للأقسام، وإزالة DPX الزائد على رأس الشرائح مع شفرة حادة، ووضعها على الساحة مسح المجهر. ويتكون نظام المجهر مجهزة مرحلة المسح، ذراع التحكم، ولون كاميرا 12-بت.
- بدء تشغيل البرنامج. فتح ملف بيانات جديد.
- مكاننقطة مرجعية على الشاشة من خلال النقر بمؤشر الماوس في أي مكان. هذا وسوف تفعيل كافة الرموز من لوحة أداة من نافذة البرنامج.
- انقر على "المقود الحرة" أيقونة على شريط الأدوات ثم استخدم عصا التحكم لتحديد موقع التلفيف المسنن من الحصين في القسم الأول.
- في "أدوات" التبويب من نافذة البرنامج، حدد "المسلسل إدارة القسم". انقر على "قسم جديد" أيقونة في الزاوية السفلى اليسرى من النافذة. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة "إعداد القسم المسلسل".
- حدد المسلسل نافذة إعداد القسم ومن ثم أدخل العدد الإجمالي للأقسام التي تحتوي على مناطق قرن آمون. حدد الفاصل التقييم. أدخل سمك قسم قطع (70 ميكرون لDCX و 150 ميكرون لقطاعات جولجي الملون).
- بدء تتبع منطقة التلفيف المسنن من خلال النقر على "حر كونتور رسم" أيقونة في شريط الأدوات. الخطوط العريضة للطبقة الخلايا الحبيبية المسنن. </ لى>
- حدد "100X" من القائمة "التكبير". إضافة قطرة من زيت الغمر في القسم والتبديل الهدف إلى 100X. تحديد موقع أجسام الخلايا الحبيبية المسنن والتشعبات في إطار هذا الهدف.
- التركيز على الخلايا العصبية المختارة وانقر على "الخلية العصبية للبحث عن المفقودين" أيقونة على شريط الأدوات. تتبع محيط من جسم الخلية الحبيبية المسنن. عند الانتهاء من البحث عن المفقودين، انقر بزر الماوس الأيمن لتحديد "إنهاء خلية الجسم".
- بدء تتبع التشعبات يدويا في X، Y، Z والاتجاهات واتبع كل فرع باستخدام عصا التحكم و z-السيارات مقبض الباب. في عقدة التشعب أو انفراق ثلاثي، حدد الخيار المعني من القائمة المنسدلة على النقر بزر الماوس الأيمن. تتبع كل من الفروع التي تنشأ من هذه العقد. في نهاية كل فرع انقر بزر الماوس الأيمن واختر "إنهاء" من القائمة المنسدلة.
- باستخدام السهم الرموز الرئيسية في إطار البرنامج باختيار عشوائي الخلية الحبيبية المسنن آخر، واتبع نفس الإجراء كما أن described في الخطوة 3،9-3،10. حفظ تتبع بأكمله.
- بدء تشغيل البرنامج تتبع الخلايا العصبية.
- فتح ملف البيانات NRX الأول من الماوس الأول من المجموعة التجريبية. إلحاق ملف NRX من الفأرة الثاني من المجموعة التجريبية. تستمر حتى يتم إلحاق كافة الملفات NRX من هذه المجموعة.
- تحت علامة التبويب تحليل، حدد "مروحة في-مخطط". هذا يفتح مروحة في تحليل النافذة. تحقق علامة "التشعبات" ثم انقر فوق عرض، الذي يصور أطوال وأنماط المتفرعة من التشعبات لهذه المجموعة من الفئران (الشكل 1).
4. EDFI
ملاحظة: هذه الطريقة تمكن المستخدم من تسجيل بسرعة عدد كبير من الصور من خلال ض محور كل حقل وتوليد صورة 2D الذي يحتوي على كافة بكسل مركزة في جميع أنحاء-المحور z. ستكون النتيجة صورة المركبة التي تحتوي على كافة بكسل مركزة من الصور التي تم جمعها.
- توصيل المجهر لكام الرقميةالعصر. ضع أقسام أولا على مرحلة المسح متصلة المجهر ومن ثم التبديل إلى الهدف 10X. نقل مرحلة إلى مجال الاهتمام.
- بدء برنامج التقاط الفيديو.
- اضغط على زر التسجيل. بمجرد الضغط على زر التسجيل، استخدم مقبض التركيز الكلي للانتقال من أعلى إلى أسفل القسم ليصبح المجموع 4 ثانية. حفظ ملف الفيديو الناتج.
- استخدام يماغيج مجانية لتحويل ملفات AVI الفيديو إلى تنسيق غير مضغوط عن طريق فتح الملف وحفظها في تنسيق ملف غير مضغوط.
- بدء تشغيل برنامج تحليل الصور وفتح ملف AVI. انتقل إلى القائمة "عملية" وانقر على "عمق الممتدة من الميدان". حدد ملف فيديو المقابلة. في "إخراج" خيارات، اختر "إنشاء مركب أفضل-التركيز على الصورة".
- في "تحليل التركيز" خيارات، حدد "تطبيع الإضاءة" و "ماكس التباين المحلي" الخيارات. ثم، حدد "لجنة المساواة العرقيةأكل ". تمثل الصورة الناتجة عن بكسل مركزة في جميع أنحاء-المحور z (الشكل 2).
- حفظ الصورة الناتجة عن ذلك.
5. توليد للغاية عالية الدقة صور
ملاحظة: هذا الأسلوب يسمح للمستخدم لتوليد تضخم منخفضة للغاية وصور عالية الدقة من الصور عالية التكبير عالية الدقة تلقائيا بطريقة المؤتمتة.
- ضع أقسام أولا على مرحلة المسح متصلة المجهر. يتم توصيل المجهر لكاميرا رقمية. نقل مرحلة إلى مجال الاهتمام.
- بدء تشغيل برنامج الحصول على الصور.
- استخدام هدفا 10X واكتساب وحفظ عالية الدقة (4076 X 3116) الصور من منطقة الفائدة والتأكد من أن لدينا 10٪ على الأقل التداخل.
- صورة تشغيل محرر المركب إلى غرزة الصور.
- انتقل إلى القائمة ملف، وانقر على "بانوراما الجديد". حدد المجلد الذي كانت الصور الحاديored. حدد الصور التي تنتمي إلى نفس المنطقة ثم اضغط على "موافق".
- اضغط على "تصدير إلى القرص" الزر، وحفظ الصورة. تمثل هذه الصورة صورة للغاية عالية الدقة من مساحة الفائدة التي يمكن استخدامها لتحليل و / أو مظاهرة (الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تحليل مدى تشجر الناشئة من الخلايا الحبيبية المسنن موجودة ولدت حديثا في الفئران نوع البرية باستخدام إما جولجي كوكس أو DCX تلطيخ (الشكل 1). تم العثور على قطاعات الجذعية من خلايا DCX إيجابية لتكون 13-36 ميكرون طويلة. تم اختبار التوزيع الطبيعي للطول شجيري باستخدام كولموغوروف-سميرنوف اختبار (D = 0،1217، ص <0.01، Liliefors P <0.001، أرقام 4 و 5).
في تحليل طول شرائح في ترتيب تشجر، تم العثور على أطول قطاعات في الترتيب الأول من تشجر (38.38 + 1.45 ميكرون). تم العثور على أنماط مماثلة لسطح (111.98 + 3.93 ميكرون مربع) والحجم (27.93 + 1.03 ميكرون مكعب). تم اختبار أيضا علاقة خطية بين طول شرائح ومساحة السطح و / أو حجم المحتلة من قبل هذه القطاعات. السطحية (ع = 0.001، ص 2 = 0.873) وحدة التخزين (ع = 0.001، ص 2 = 0.621) جorrelated بشكل كبير مع طول كل قطعة شجيري.
الشكل 1: تم استخدام هنا فان الرسم البياني لتقييم طول شجيري من الخلايا الحبيبية المسنن في قرن آمون يمكن استخدام هذه الأداة التصور لمقارنة آثار التدخلات العلاجية المختلفة أو الأنماط الجينية على طول شجيري. وحدة القياسات هي ميكرون.
الشكل 2: تصور تشجر شجيري دون (A) ومع EDFI (ب) الأساليب. تمت مقارنة الطريقة التقليدية في إيجاد أفضل طائرة التركيز مع EDFI (لا تظهر البيانات) وجدت القيم أعلى بكثير من مساحة الجذعية باستخدام طريقة EDFI (ع = 0.02). شريط النطاق= 100 ميكرون.
الشكل (3): وصورة عالية الدقة للمنطقة قرن آمون في الماوس هي التي شيدت هذا صورة عالية الدقة للغاية تلقائيا من خياطة 10 (4،076 خ 3،116) الصور -pixel. توسيع نطاق عارية = 100 ميكرون.
الرقم 4: القياس الكمي لطول وحجم تحتلها التشعبات في أوامر مختلفة من المتفرعة تحققت الحد الأقصى لطول وحجم وفقا للترتيب 1.
الشكل 5: رسم بياني لطول شجيري من الخلايا الحبيبية المسنن غالبية شرائح شجيري من Dكانت التشعبات CX الملون و13-26 في الطول. خط منقط الأحمر يصور التوزيع الطبيعي للبيانات المقدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، وقد وصفت طريقتين لقياس مدى تشجر شجيري في الخلايا العصبية الناضجة ولدت حديثا باستخدام أساليب تلطيخ التقليدية جنبا إلى جنب مع RTI وEDFI. الحصول على صور عالية الدقة من الخلايا العصبية يوفر وسيلة مفيدة للغاية لاختبار الآثار الضارة للاضطرابات العصبية، وبالتالي، يوفر وسيلة لتقييم الاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف الخلايا العصبية قرن آمون.
في حين تم استخدام طريقة RTI لالتقاط البيانات متعمقة تتعلق بمدى تشجر والتضاريس، يفشل الأسلوب EDFI لتوفير المعلومات المتعلقة تعقيد الأفراد شرائح أو الأشجار. ومع ذلك، فإن فوائد طريقة EDFI تكمن في حقيقة أنه لا تتطلب شراء أجهزة باهظة الثمن وأقل إستهلاك الوقت.
تم استخدام برنامج تحليل الصور لأداء EDFI في ملفات الفيديو. وبعد الوصول إلى دقة عالية وبسرعةكاميرات تتيح جمع عدد كبير من الصور في جميع أنحاء سمك كل حقل ويولد الصور التي تمثل حقا أبعاد X، Y، Z و. عيب واحد من طريقة EDFI ويتعلق ذلك إلى حقيقة أنه لن يكون هناك بكسل أكثر من واحد (نفس x و y) ركز في الطائرات المختلفة في جميع أنحاء-المحور z. ومن المتوقع طريقة لتعيين ألوان مختلفة لهذه بكسل يمثل على وجه التحديد مدى ملامح 3D في الصور 2D. وتجدر الإشارة إلى أن طريقة EDFI ويمكن أيضا أن تستخدم لتحليل الشخصية الخلوية (على سبيل المثال، نقاط الاشتباك العصبي، الخلايا الدبقية الصغيرة، والخلايا النجمية). وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لتحليل مدى التوزيع دبقية في جميع أنحاء سمك الباب 7. طريقتين الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم بطريقة متكاملة. في حين يوفر طريقة ار تي أي معلومات دقيقة عن تضاريس المتفرعة نمط، وEDFI يعطينا طريقة بسيطة إلى حد ما وسريعة لتقييم كثافة التشعبات في منطقة فيالمترتبة عليك. والجدير بالذكر أن سمك المقاطع التي يمكن الحصول عليها مع EDFI هي المتغير للغاية لمجموعة من التركيز ض على المسرح المجهر في تركيبة مع التركيز البصري للأهداف المجهر تملي حدود EDFI.
الطرق الموضحة في هذه الوثيقة لديها القدرة على نشرها في سياقات متعددة. في هذه الدراسة قدمنا وسيلة لتقييم التغيرات في شجيري تشجر قبل وبعد التدخل، في حين كان يستخدم EDFI لتحديد تفعيل دبيقي 7. وهكذا، وهذا الأسلوب هو قابلة للأي تطبيق حيث أن الهدف النهائي هو لتقييم التغيرات في التشكيلات الصغيرة التي يمكن العثور عليها في طبقات متعددة.
وأخيرا، يمكن لهذه التقنيات التغلب على عدم الحصول على دقة عالية جدا والكاميرات الرقمية باهظة الثمن. في جوهرها، وظهر أسلوب على كيفية التقاط الصور المتسلسلة في نقاط مختلفة من المواقع داخل عينة ثم غرزة معا باستخدام مجانية، في نهاية المطاف yieldinز صور عالية الدقة بطريقة أكثر موثوقية بكثير وسريعة من الطرق التقليدية.
الخطوات الحاسمة
جولجي تلطيخ
يتم الاحتفاظ كميات المخزون من جولجي وحلول تطوير في 4 درجة مئوية لمدة التخزين وبعد تتطلب البروتوكولات تلطيخ وحضانة الحل لاستخدامها في درجة حرارة الغرفة. تبريد جولجي وتطوير الحلول على الجليد أو في الثلاجة يؤثر سلبا على نوعية تلطيخ شجيري. وعلاوة على ذلك، ينبغي الإشارة إلى أن كنا حلول جولجي سريعة النمو. في حين أن التكوين الدقيق من الحل جولجي كوكس المستخدمة في هذه الدراسة هو الملكية، وهناك مصادر متعددة أن القائمة في بروتوكول التفاصيل التي يمكن استخدامها لتنفيذ جولجي كوكس تلطيخ 13. ومع ذلك، فإن استخدام غيرها من الحلول جولجي يغير كثيرا تلطيخ فترات والتعديلات للينبغي وفقا لذلك هذه الخطوات. أيضا، ونحن مع آخرين يكون لناإد 150 ميكرون أبواب سميكة لتحليل الخلايا العصبية DGC 14،15 كما هو المتفق عليه عموما أن قطع أجزاء من هذا السمك coronally وبالتوازي مع المسنن arborizations الخلية الحبيبية يقلل من خطر قطع الفروع الشجيرية.
DCX تلطيخ
يتطلب بروتوكول تلطيخ DCX اهتماما واضحا لدرجة الحرارة. وفشل لتسخين الحل إلى 37 درجة مئوية خلال الفترة حضن مسبق يضعف بشكل كبير تلطيخ ويؤدي إلى فقدان التصور شجيري. وعلاوة على ذلك، هناك ما يبرر الاهتمام لسمك الباب. في هذه الدراسة كنا 70 ميكرون أبواب سميكة لالتقاط أقصى حد من DGCS تشجر شجيري. في تجربتنا، واستخدام 0.3٪ تريتون هو ضرورة لأنه يسهل إلى حد كبير الاختراق من الأجسام المضادة في جميع أنحاء سمك أقسام العائمة. في الواقع، استخدمت دراسات سابقة تريتون لاختراق 70 ميكرون سميكة 16 أو حتى أكثر سمكا (120 ميكرون) 17أقسام عند تسمية التشعبات DGC. يرجى الاطلاع الحسيني للحصول على التفاصيل الكاملة للDCX تلطيخ 18.
وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن البرامج المفتوحة المصدر البديلة (مثل flNeuronTool أو Simple_Neurite_Tracer) موجودة مع القدرة على تسجيل حركة المسرح في اتجاهات x و y و z. يمكن استخدام هذه البرامج لتتبع شجيري طالما كانت ممكنة للتواصل مع مرحلة المسح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وترعى رسوم النشر لهذا المقال من قبل MBF العلوم البيولوجية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
References
- Bosch, M., Hayashi, Y.
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C.
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).
- Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).
- Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).
- Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).
- Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).
- Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).
- Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R.
- Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
- Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6 (9), e24566 (2011).
- Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
- Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8 (5), e62693 (2013).
- Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).
