Vurdering av Dendritic arborization i Dentate Gyrus av hippocampus regionen i Mus

Summary

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Abstract

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Introduction

Dynamiske endringer i antall og struktur av synapser er kjennetegn for utvikling, aldring, og mange nevrodegenerative lidelser ^1-3. Evnen av neuroner for å motta og integrere synaptiske informasjon er avhengig av dendrittiske morfologi og dynamiske forandringer i synaptiske forbindelser. Faktisk viser en klar positiv sammenheng mellom dendrittiske ryggrad og synapse nummer, som både påvirker kognitiv funksjon ^4. Dermed er det ikke overraskende at innskrenkninger i dendrittiske ryggrad nummer har blitt assosiert med kognitiv dysfunksjon i en rekke nevrologiske lidelser ^5-7, spørre stor interesse i dendrittiske ryggrad kvantifisering. Likevel kvantifisering av ryggraden tetthet forblir en tidkrevende og kjedelig oppgave som ikke klarer å generere nyttig informasjon angående topografi og fordeling av synapser på tvers av dendrittiske treet. Heldigvis fargemetoder (f.eks Golgi-Cox og doublecortin (DCX)) i forbindelsemed avanserte imaging teknikker kan brukes til å overvinne dagens barrierer og produsere høyoppløselige bilder av dendrittiske arborization i en pålitelig og rask måte. Mens Golgi-Cox farging metoden kan bli utplassert for å vurdere tilstanden av dendrittiske arborization i alle nevroner ^8, kan DCX bli deployert til å merke nyfødte nerveceller spesielt i dentate gyrus og subventricular sone ^ni, en viktig faktor gitt at neurogenesis oppstår i både disse regionene i hele levetiden ^10,11.

Etter farging ble to avbildningsmetoder utplassert for å vurdere dendrittiske kjennetegn: i) real-time imaging (RTI) og ii) utvidet dybdeskarphet imaging (EDFI). RTI teknikk gir et middel for å spore og kvantifisere lengden og rekkefølgen av arborization langs de enkelte dendrittiske segmenter og greiner. Således gjør det mulig å beregne det totale arealet og volumet som opptas av hvert dendrittiske treet. Flere specifically, i RTI fremgangsmåte brukeren identifiserer kontinuerlig segmentene og refocuses iterativt som neuron tracing programvare samler x-, y- og z-koordinatene for den dendrittiske struktur og rekonstruerer banen til dendrittiske struktur i 3D. Forholdsvis gir EDFI metoden en ganske enkel og fremskyndet midler for å vurdere dendrittiske tetthet i heller tykke vevsprøver ved å generere et sammensatt bilde, gi informasjon om hele z-aksen. For å gjøre dette, registrerer brukeren HD-videofiler gjennom hele tykkelsen på seksjonen og deretter bruker programvare for å søke i videobilder for å identifisere punkter hvor en piksel er helt i fokus. Deretter blir fokusert piksler fusjonert og integrert i en høy oppløsning, kompositt 2D-bilde. Dette sammensatte bildet inneholder alle piksler som var i fokus, uavhengig av deres posisjon i z-aksen. Kvalitativ og kvantitativ analyse av disse 2D-bilder kan deretter brukes til å bestemme tetthetenav dendrittiske forgrening i hvert felt.

Til slutt presenterer vi en panorama metode for generering av ekstremt høy oppløsning for analyse og vurdering av dendritter i en hel region av interesse. Denne teknikken kan distribueres til å overvinne mangelen på tilgang til svært høy oppløsning og dyre digitalkameraer. Ved hjelp av denne metoden, en fanger serie bilder på ulike steder langs x- og y-aksen og deretter automatisk setter dem sammen ved hjelp av en freeware (f.eks Bilde Composite Editor). Spesielt, kan denne fremgangsmåte benyttes for kvalitativ og kvantitativ vurdering av dendrittiske arborization i et ganske bredt område.

Protocol

MERK: Forsøk ble utført i samsvar med de etiske standarder godkjent av komiteen for forsøksdyr ved Veterans Affairs Palo Alto Health Care System. 1. Golgi-Cox Farging Brain utvinning og farging På den første dagen, dypt bedøve musene med 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin før euthanizing via blodtapping. Fjern forsiktig calvarium og dissekere ut hjernen. Først fjerne hud på toppen av skallen, plassere en buet saks på toppen av lillehjer…

Representative Results

Omfanget av arborization oppstår fra bevarte og nyfødte dentate granule celler ble analysert i villtype mus ved hjelp av enten Golgi-Cox eller DCX farging (figur 1). Dendrittiske segmenter av DCX-positive celler ble funnet å være 13 til 36 mikron lange. Den normale fordeling av dendritiske lengde ble testet ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov-test (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; figur 4 og 5). I analysen av lengden av segment…

Discussion

Her, to metoder ble beskrevet å kvantifisere omfanget av dendrittiske arborization i modne og nyfødte nerveceller ved hjelp av konvensjonelle fargemetoder i forbindelse med RTI og EDFI. Oppkjøpet av høyoppløselige bilder av nevroner gir en svært nyttig metode for å teste de skadelige effektene av nevrodegenerative lidelser og i sin tur gir et middel for å vurdere terapeutiske strategier som er rettet mot hippocampus nevroner.

Mens RTI metoden ble brukt til å fange grundige data knyt…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00