Abstract
De intestinale lymfestelsel speelt een belangrijke rol in vochttransport, lipide absorptie en het immuunsysteem. Lymfe stroomt direct uit de dunne darm via een reeks lymfevaten en knooppunten die convergeren de superieure mesenterische lymfklieren duct. Canulatie van de mesenteriale lymfeklieren duct stelt derhalve het verzamelen van mesenteriale lymfe stroomt uit de darm. Mesenterium bestaat uit een cellulaire fractie van immuuncellen (99% lymfocyten), waterfractie (vloeistof, peptiden en eiwitten, zoals cytokines en hormonen darm) en lipoproteïne fractie (lipiden, lipofiele moleculen en apo-eiwitten). Het mesenterium kanaal infusen model kan derhalve worden gebruikt om de concentratie en de transportsnelheid van een aantal factoren van de darm via het lymfestelsel meten. Wijzigingen in deze factoren in reactie op verschillende problemen (bijvoorbeeld diëten, antigenen, drugs) en ziekte (bijvoorbeeld inflammatoire darmziekte, HIV, diabetes) kan ook be bepaald. Een gebied van de uitbreiding van belang is de rol van lymfatische vervoer in de absorptie van oraal toegediende lipofiele geneesmiddelen en pro-geneesmiddelen die associëren met intestinale lipide absorptiewegen. Hier beschrijven we, in detail, een mesenteriale lymfe duct canule rat model dat de evaluatie van de snelheid en mate van lipide en drugs transport via het lymfestelsel maakt voor enkele uren na intestinale levering. De werkwijze is gemakkelijk aan het meten van andere parameters lymfe. Wij bieden gedetailleerde beschrijvingen van de moeilijkheden die zich kunnen voordoen bij het vaststellen van dit complexe chirurgische methode, evenals representatieve gegevens van mislukte en geslaagde experimenten om instructie over hoe om experimentele succes te bevestigen en de verkregen gegevens te interpreteren bieden.
Introduction
Lymfe stroomt van de dunne darm via een unidirectionele proces beginnend op één melkvaten die zijn opgenomen in elke kleine darmvlokken 1. Melkvaten zijn relatief doorlaatbaar voor vocht, macromoleculen en cellen en de lymfe formatie dus begint met de komst van deze factoren in melkvaten. De eerste lymfe in de melkvaten stroomt vervolgens uit de darm via een netwerk van lymfatische haarvaten, verzamelen (afferente) lymfevaten, een reeks mesenteriale lymfeklieren en uiteindelijk de post-nodale (efferente) lymfevaten. Binnen de knooppunten, lymfe gaat door een reeks medullaire sinussen waarbij uitwisseling plaatsvindt met knooppunt resident immuuncellen en materiaal die het knooppunt uit het bloed. Alle lymfe stroomt uit de dunne darm uiteindelijk convergeert naar de efferente superieure mesenteriale lymfe kanaal en vervolgens de cisterna chyli. De Cisterna chyli verzamelt tevens lymfedrainage de caudale perifere weefsels, INTESTinal, lever- en lumbale regio's en voegt zich bij de thoracale lymfe kanaal samen met lymfe uit het mediastinum en craniale delen van het lichaam. De thoracale lymfe kanaal uitmondt lymfe rechtstreeks in het veneuze systeem bij de verbinding van de linker interne halsader en subclavia. Faciliteert de hier beschreven protocol, waarin de collectie van lymfe direct in staat stelt van de superieure mesenteriale lymfe kanaal, waardoor de analyse van de verschillende factoren die rechtstreeks op doorreis vanuit de darm naar de systemische (algemene) circulatie via de intestinale lymfestelsel.
De belangrijkste fysiologische functies toegewezen aan de intestinale lymfestelsel zijn om de vochtbalans te behouden, om lipide en lipofiel molecuul absorptie te vergemakkelijken, en om passende immuunreacties 1 mogelijk te maken. Tumorcellen en virussen ook verspreiden via de intestinale lymfevaten 2-4 en belangrijke wijzigingen voordoen in de lymfevaten in verschillende inflammatoire en metabolische ziekten 5-7. Kannulation van de mesenteriale lymfe kanaal om de lymfe te verzamelen binnen het mesenterium maakt een analyse van bulk vloeistofstroom via de intestinale lymfevaten evenals kwantificering van de concentratie en het vervoer tarief van verschillende cellen en moleculen. Wijzigingen in de concentratie of doorvoer van die factoren als reactie op verschillende uitdagingen (bijvoorbeeld diëten, antigenen, drugs) en ziektemodellen (bijvoorbeeld colitis, HIV, diabetes) kan ook worden beoordeeld. Hoewel het onmogelijk is elke lymfe component die kan worden geanalyseerd en vergeleken hier uitgebreid beschreven, mesenterische lymfklieren simplistisch uit waterige, lipiden en cellulaire fasen. Onderdelen van belang in de waterige fase omvatten peptiden en eiwitten zoals antigenen of tolerogenen 8, immuun boodschappers zoals cytokinen en mestcel mediatoren 9 en metabole mediatoren zoals incretines 10. De cellulaire fractie van de post-nodale mesenteriale lymfeklieren bestaat bijna volledig (meer dan 99%) van lymphocytes 11. Verscheidene immuuncellen (dendritische cellen, mestcellen, etc.) voert de pre-nodale mesenterische lymfevaten maar binnen het knooppunt 12 blijven. Indien de cellen in afferente lymfe van belang, is het mogelijk om deze cellen te verzamelen door verwijdering van de mesenterische lymfeklieren enkele dagen voor canulatie van de mesenterische lymfklieren kanaal 12. Zo de afferente en efferente lymfevaten zijn direct verbonden en de lymfe cellen in afferente lymfe direct doorgeven aan de mesenterische lymfklieren kanaal. De doorvoer en fenotype van verschillende immuuncellen die door de intestinale lymfevaten kan dus worden onderzocht. Wellicht wordt aangevoerd verzamelen mesenterium actueel meest voorkomende reden is echter de intestinale verwerking, opname en het transport van voedingslipiden en lipofiele moleculen 10 bestuderen.
Na inslikken wordt voedingslipiden gedigereerd (bijvoorbeeld van triglyceride vetzuren en monoglyceride, Phospholipid vetzuren en lysofosfolipide en cholesterol ester tot vetzuur en cholesterol, etc.) en gedispergeerd in het darmlumen in kleine micellen en vesiculaire structuren door de toevoeging van amfifielen van gal (fosfolipiden, cholesterol en galzouten) en de werking van pancreasenzymen 10,13. Vanaf hier zijn ze opgenomen in enterocyten. Een deel van de geabsorbeerde componenten worden opnieuw veresterd aan triglyceriden, fosfolipiden en cholesterol esters in het absorberende cellen (enterocyten) vormen. Deze opnieuw veresterd lipiden zijn opgebouwd uit een combinatie van exogeen ingenomen lipidecomponenten en endogene lipide componenten van de gal uitgescheiden, mucosale lipidendepots of intestinale bloedtoevoer 13. Vanaf hier de veresterde lipiden zijn ofwel opgeslagen in enterocyten of geassembleerd tot intestinale lipoproteïnen (chylomicronen, zeer lage dichtheid lipoproteïnen (VLDL)) samen met diverse apoproteins en andere lipofiele moleculen (
De verzameling mesenterium maakt het aldus mogelijk de beoordeling van het transport van lipoproteïnen en bijbehorende onderdelen (lipiden, lipofiele moleculen, apo-eiwitten) uit de darm. De lipoproteïnen kan worden gekwantificeerd en gekarakteriseerd met als voordeel dat het mesenterium lipoproteïnen in het algemeen in een nascent staat aangezien ze niet uitgebreid door systemische enzymen gemodificeerd zoals lipoproteïne lipase 15. Terwijl de mesenteriale lymfeklieren model gecannuleerd rat is misschien historisch gezien het meest uitgebreid beschreven voor de analyse van lipiden / lipoproteïne transport vanuit de darm, een gebied van de uitbreiding van belang is de rol van lymfevaten bij het transport van lipofiele geneesmiddelen, pro-drugs en andere lichaamsvreemde stoffen 13,16 dat de focus van de hier beschreven model. Lipofiele geneesmiddelen (over het algemeen mensen met een log P> 5 en oplosbaarheid in lange-keten triglyceriden> 50 mg / g, hoewel uitzonderingen zijn schijnbare) 17,18, prodrugs 19 en andere lichaamsvreemde stoffen 13,16 kan de toegang tot de intestinale lymfevaten ofwel passief of door te krijgen actief te integreren in intestinale lipoproteïne transportroutes 19.
De rat mesenteriale lymfe canulatie techniek heeft dus vele toepassingen. Bollman et al. Beschreef een eerste techniqUE het mesenterium kanaal bij ratten canule in 1948 20. Sindsdien is een aantal variaties op het model beschreven. Zo kan verzamelen optreden wanneer de rat wordt verdoofd met verschillende anesthetica 21,22 of in de bewustzijnstoestand terwijl tegengehouden 15 of vrij bewegende 23,24. Ratten worden toegediend verschillende rehydratatie oplossingen en andere stoffen zoals lipiden en geneesmiddelformuleringen met verschillende snelheden in de maag, darm of parenteraal (gewoonlijk 0-5 ml / h) 25. In sommige studies de thoracale lymfklieren kanaal plaats mesenterium duet canule te schatten transport van de darm via de lymfevaten hoewel dit doorvoer kunnen overschatten van de dunne darm, afhankelijk van de factor van belang, zoals de thoracale lymfe kanaal ontvangt ook lymfe uit andere regio 22,26. Lymfe canule modellen zijn ook beschreven in verschillende andere soorten waaronder muizen 15,27, mini-pigs 12, 28,29 schapen, varkens 30 en 31 honden. De ratmodel is het meest consistent en geciteerd. Gedetailleerde protocollen voor canulatie van de mesenteriale lymfe kanaal gevolgd door verzameling van lymfe in het bewuste 25 of verdoofd 22 ratten en muizen 15,27 zijn eerder gepubliceerd en de geïnteresseerde lezer wordt doorverwezen naar deze protocollen. Dit protocol is de eerste om de techniek in een gevisualiseerde formaat tonen.
De lymfe gecanuleerde rat model heeft voordelen ten opzichte van grotere diermodellen in termen van kosten, het gemak van de operatie en ethische overwegingen. In vergelijking met het muismodel, mesenterium canulatie chirurgie is ook makkelijker in de rat hoewel het muismodel kunnen meer gedetailleerde studies in transgene dieren 27. Toch zijn er enkele beperkingen van de rat model, met name die geassocieerd met verschillen in fysiologie, deze grens extrapolation andere preklinische en klinische situaties. Bijvoorbeeld, in de rat galstroom is constant en onafhankelijk van de voedselinname, terwijl hogere soorten voedsel of lipiden stimuleert galstroom 32. Dit creëert uitdagingen verkrijgen representatief pre- en postprandiale omgevingen ratten die weerspiegelen wat wordt gezien in grotere soorten en mensen. Voor drug delivery studies, kunnen grotere soorten ook de voorkeur bij de beoordeling van lymfatische transport na de toediening van realistische menselijke toedieningsvormen 25. In een recente studie, werden lipiden transportsnelheden in de mesenterische lymfklieren vond vergelijkbaar tussen soorten (muis, rat, hond) na toediening van een equivalente massa en type lipide die enig vertrouwen extrapoleren lipide datatransport tussen soorten 27 verschaft zijn. Echter, het vervoer van een model lipofiel geneesmiddel, halofantrine, gerangschikt in de orde van grootte van dieren (dwz, hond> rat> muis). Een schaalfactor kan dus nodig zijn om extrapolate lymfatische gegevens drug vervoer van rat naar andere soorten.
Een beperking van lymfe cannulatie modellen, in het algemeen, dat passieve lymfe rechtstreeks vanaf een lymfevat kan lymfestroom en transport niet, omdat lymfevaten tegen een drukgradiënt die wordt veranderd wanneer het vaartuig canule 33 werken. De lymfe canulatie model kan ook moeilijk zijn om vast te stellen in laboratoria die niet vertrouwd zijn met de techniek zijn. Alternatieve modellen zijn derhalve beschreven. Bijvoorbeeld, de doorvoer factoren via de intestinale lymfestelsel, zoals lipoproteïnen en lipofiele moleculen is indirect onderzocht door bloedafname. Een dergelijk model vergelijkt men bloedconcentraties van lipiden en / of geneesmiddelen na orale toediening in aanwezigheid en afwezigheid van remmers (bijvoorbeeld colchicine, Pluronic L81, cycloheximide) van intestinale lipoproteïne productie die lymfatisch transport 34 blokkeren. Een voordeelvan modellen die lymfatische transport kwantificeren indirect via de bloedafname is dat het in staat stelt een aantal evaluatie van lymfatische vervoer bij de mens als invasieve chirurgie niet nodig is 35. Echter, remmers van lymfatisch transport niet specifiek en factoren die via de lymfevaten getransporteerd worden verdund en gewijzigd in de systemische circulatie met dergelijke beoordelingen compliceert. In vitro alternatieven zijn ook beschreven. Bijvoorbeeld zijn Caco-2 cellen of geïsoleerde enterocyten culturen gebruikt bestuderen in meer detail de intestinale secretie van moleculen die de lymfevaten 36-38 voeren. Een geavanceerde in vitro model dat meer representatief voor de humane intestinale micro werd recent beschreven 39. In dit model een lymfatische endotheliale cellaag samen gekweekt met Caco-2-cellen die meer gedetailleerde analyse van de overdracht van stoffen uit de darm naar de lymfevaten mogelijk maakt. In vitro cel systemen ontbreekt uitwisseling flow en overdragen dwz interconnectie met een intestinale lumen en de onderliggende bloed en lymfatische vasculaire aanbod. In een alternatieve benadering, Kassis et al. Werd een dual-channel (high-speed bright-field video en fluorescentie) in situ imaging systeem dat kwantitatieve vergelijkingen tussen vaartuig contractie, lymfestroom en fluorescerende lipide concentraties in mesenteriale lymfevaten 33 mogelijk maakt. Een voordeel van dit model op de bovengenoemde in vitro systemen is dat daardoor nauwkeurig volgen van de doorgang van immuuncellen door de lymfevaten. Absolute metingen van massa lipide (of drugs) vervoer zijn echter nog niet vastgesteld met behulp van beeldvormende technieken. In vitro en in silico benaderingen om specifiek te voorspellen de mate van lipofiele vervoer geneesmiddel via de intestinale lymfevaten zijn ook gepubliceerd 40-42. Bijvoorbeeld, de ex vivo affiniteit van verschillende compounds voor plasma chylomicronen bleek redelijk goed te correleren met hun lymfatische transport in vivo 41. Vervolgens dezelfde groep opgericht een in silico model om drug affiniteit voorspellen voor chylomicronen op basis van meerdere fysisch-chemische eigenschappen 40. Holm et al. Stelde ook relatief complex in silico model regelrechte voorspellen lymfatisch transport van lipofiele verbindingen op basis van moleculaire descriptoren 42. Deze modellen kunnen een nuttige benadering voor de omvang van lymfatisch transport van onbekende geneesmiddelen voorspellen verschaffen. Validatie van de modellen met een breed scala van drugs en over verschillende labo's zullen echter worden verplicht hun nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te bevestigen.
Canulering van de mesenterische lymfklieren kanaal blijft dus de enige manier om de inhoud van lymfe aftappen van de dunne darm en de doorvoer snelheid van de complexe reeks factoren (cellen, eiwitten direct onderzoekenpeptiden, lipiden, drugs) in lymfe in een in vivo situatie. Hierin beschrijven we een protocol voor canulatie van de mesenteriale lymfe duct en halsslagader dat het verzamelen van mesenteriale lymfe en systemische bloed van verdoofd ratten maakt. Representatieve gegevens tonen hoe het model kan worden gebruikt om lipide en geneesmiddel transport van de darm te onderzoeken via de mesenteriale lymfestelsel. Dit wordt gevolgd door een bespreking van problemen die kunnen worden ondervonden bij het vaststellen van het model en een gids voor probleemoplossing. Eenmaal gevestigd het model is een krachtig hulpmiddel om intestinale lymfatische vervoer te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De in dit manuscript beschreven studies werden goedgekeurd door de lokale dier ethische commissie en werden uitgevoerd in overeenstemming met de Australische en Nieuw-Zeelandse Raad voor de verzorging van dieren in onderzoek en onderwijs richtlijnen. Voorafgaand aan het begin van elk dier procedure, zorgen dat de juiste toestemming is verkregen via de lokale instelling / organisatie. Zoals met alle dierlijke operaties, ervoor te zorgen dat de operatie wordt uitgevoerd door daarvoor opgeleide operators, onder aseptische omstandigheden en dat anesthetica, analgetica en antibiotica worden toegediend wanneer dat nodig is om een ethische en succesvol resultaat te garanderen.
1. Voorbereidingen De dag voor de chirurgische ingreep
- Snel de rat de nacht voor de operatie indien nodig. Zorg ervoor dat de rat heeft vrije toegang tot water.
- Bereid de oplossingen voor toediening aan de rat.
- Bereid een rehydratatie oplossing zoals steriele zoutoplossing of Ringers oplossing.
- Bereid eenesthetische oplossingen nodig. De verdoving die in de hier beschreven experimenten bestonden uit "Cocktail 1" bereid door 1,9 ml ketamine 100 mg / ml, 0,5 ml xylazine 100 mg / ml, 0,2 ml acepromazine 10 mg / ml en 2,5 ml zoutoplossing en " Cocktail 2 "bestaande uit 1 ml ketamine 100 mg / ml en 0,1 ml acepromazine 10 mg / ml. OPMERKING: inhalatie isofluraan of sevofluraan de voorkeur omdat het een chirurgische vlak van anesthesie in een langere periode.
- Eventueel stelt een formulering die het geneesmiddel in bijvoorbeeld een lipide emulsie. Voeren die nodig zijn stabiliteit studies om de stabiliteit van de formulering te verzekeren gedurende de periode van opslag en administratie.
OPMERKING: De exacte aard van de formulering en toe te dienen geneesmiddel zal variëren met elk onderzoek als doel lymfatisch drug transport studies is meestal de efficiëntie van lymfatisch transport geneesmiddel te evalueren als een functie van de formulering en drug Adminifeerd.- De formulering gebruikt in de representatieve experimenten in Figuur 4 en 5 hier wordt bereid, zoals eerder 43 beschreven. Kort samengevat omvatten 14C oliezuur (2,5 uCi) en halofantrine (200 ug) in 40 mg oliezuur voorafgaand aan dispersie in 5,6 ml van een waterfase bestaande uit 5 mM natrium taurocholaat in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 6,9).
- Voor formuleringen die 2-monooleïne, voeg 7,1 mg van 2-oleïne samen met andere componenten, om de waterfase op hetzelfde moment als het oliezuur fase die halofantrine. Bereid de preparaten die 2-oleïne onmiddellijk voor toediening aan ratten als 2-oleïne relatief onstabiel en isomeriseert 1-oleïne.
- Vervolgens emulgeren de formuleringen door ultrasone trillingen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: zoals eerder beschreven 43 toezicht op de stabiliteit van de formuleringen door i) visueel onderzoek van de emulsie onder gepolariseerd licht aan dat de emulsie niet wordt afgescheiden, ii) de deeltjesgrootte analyse zorgen onmiddellijk na bereiding en na het doseren met behulp van dynamische lichtverstrooiing om een indicatie van welke fase veranderingen en / of scheiding te bieden, en iii) analyse van halofantrine concentraties met behulp een gevalideerde HPLC-bepaling.
- Bereid anti-coagulant oplossing bevattende 10 mg / ml EDTA in steriel water of 10 IU / ml heparine in zoutoplossing om de lymfe canule spoelen. Bereid ook anti-coagulant oplossing die 2,5-10 IU / ml heparine in zoutoplossing om de halsslagader canule spoelen.
- Bereid de polyethyleen canules voor het inbrengen in de mesenteriale lymfe kanaal (0,8 mm OD, 0,5 mm ID), halsslagader (0,96 mm OD, 0,58 mm ID of 0,8 mm OD, 0,5 mm ID) en de twaalfvingerige darm (0,96 mm OD, 0,58 mm ID )
- Snijd de canules op lengte (typisch 25 - 30 cm voor de halsslagader en duodenale canule en 10-15 cm voor de lymfe cannUla) en plaats een afschuining aan het uiteinde van de canule met een steriele chirurgisch mes (zie figuur 1).
Opmerking: Dit verhoogt het gemak van canule inbrengen en vermindert de incidentie van verstopping canule post-insertie. - Plaats een J vorm ankerpunt in de intraduodenale canule door lus een klein deel van de canule op zichzelf terug, verwarmen met een aansteker of een hete plaat en daarna op maat snijden (zie figuur 1).
- Snijd de canules op lengte (typisch 25 - 30 cm voor de halsslagader en duodenale canule en 10-15 cm voor de lymfe cannUla) en plaats een afschuining aan het uiteinde van de canule met een steriele chirurgisch mes (zie figuur 1).
- Bevestig de lymfe canule een 25 G naald en spuit met een anti-coagulant oplossing (bereid in stap 1.3). Vul het lymfe canule met de anti-coagulant oplossing en laat de oplossing in de canule O / N om het voorkomen van stolselvorming in de lymfe canule verminderen tijdens lymfe collectie.
- Bereid buizen voor lymfe en bloed monstername. Pre-wegen lymfe collectie buizen, label buizen voor lymfe en bloed monstername en voeg anti-stollingsmiddel oplossing. Voeg voldoende anti-stollingsmiddel solut20 IE / ml heparine in de opgevangen lymfe of bloed - ion tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml EDTA in steriel water of 10 bereiken.
2. Voorbereidingen Onmiddellijk voorafgaand aan de start van de chirurgische ingreep
- Bekijk alle canules door spoelen met steriele zoutoplossing of anti-coagulant oplossing zodat zij octrooi.
- Bereid de rat voor de chirurgische ingreep.
OPMERKING: De mesenteriale lymfe kanaal is meer zichtbaar in ratten die hebben gegeten of toegediend met een dosis van olie als de mesenteriale lymfe wordt melkachtig en ondoorzichtig met hogere lipide laden. Sommige operators, vooral die nieuw aan de operatie, dus gemakkelijker om de mesenterische lymfklieren kanaal canule bij ratten voorgedoseerde met een olie (ongeveer 0,1-1 ml) zoals olijfolie of sojaolie 0,5-2 uur voor aanvang operatie . Echter, pre-dosering olie beïnvloedt het lymfatisch transport van lipiden, lipofiele geneesmiddelen en andere factoren lymfe zodat het niet ideaal om vooraf dosis olijfolie,Afhankelijk van het doel van het experiment.- Verdoven van de rat gedurende de operatie en monstername periode.
- Zo leiden de anesthesie via subcutane injectie van 1,5 ml / kg cocktail I (uit stap 1.2.2) in een huidplooi aan de achterkant van de nek ratten met een 1 ml spuit verbonden met een 25 G naald. Handhaaf de anesthesie via intraperitoneale injectie van 0,44 ml / kg Cocktail 2 (uit stap 1.2.2) ongeveer elk uur naar behoefte met een 1 ml spuit verbonden met een 25 G naald.
- Vóór het begin van de operatie ervoor dat de diepte van de anesthesie voldoende door het observeren ademhaling, snorhaar beweging, spierspanning en reacties op stimuli zoals knijpen van de voet. Dien extra verdoving, zoals vereist.
- Scheer de vacht van de chirurgische gebieden, welke de rechterzijde van de buik van lymfe en duodenum cannulatie omvatten, en de nek en linker sleutelbeen regio halsslagader canuletie.
- Reinig de chirurgische regio aseptisch behulp povidine jodium-oplossing of chloorhexidine oplossing en een 70% ethanol scrub. Herhaal dit 3 keer voor elke regio, afwerken met een definitieve reiniging met 70% ethanol.
- Verdoven van de rat gedurende de operatie en monstername periode.
- Plaats het dier dorsale recumbence op de nul boven een verwarmde chirurgische pad (37 ° C).
3. Canulatie van het mesenterium Duct
- Leg het dier met zijn goede kant naar de richting van de operator. Voer de chirurgie met of zonder hulp van een chirurgische microscoop nodig.
- Open de bovenste laag van de abdominale spierwand met een rechte 4 cm incisie uitstrekt vanaf de middellijn (xyphoid proces) aan de rechterflank ongeveer 2 cm onder de ribbenkast (ribbenboog) met een steriele scalpel (zie figuur 2B).
- Open de overige lagen van de abdominale spierwand 4-5 mm lateraal van de middellijn naar de rechter flank met een klein paarchirurgische schaar (zie figuur 2B).
- Trek de dunne darm onder de linker buikspier muur en houden het op zijn plaats met 2-3 stuks steriel gaasje verzadigd met een fysiologische zoutoplossing.
- Brug de rat op een 10 ml plastic spuit horizontaal onder de rug van de rat op het niveau van de rechter nier visualisatie van de mesenterische lymfklieren kanaal verlichten geplaatst.
- Zoek de superieure mesenterische lymfklieren duct: een schip ongeveer 0,5-1 mm in diameter die loodrecht op de rechter nier en onmiddellijk rostraal en evenwijdig aan de mesenteriale slagader (pulserend donkerrood bloedvat; zie figuur 2C).
Opmerking: In niet-gevaste of olie vooraf gedoseerde ratten het schip is wit, ondoorzichtig en gemakkelijker te visualiseren dan bij nuchtere ratten waarin vrij doorschijnend. - Inspecteer het gebied direct caudaal van de grote superieure mesenteriale lymfe duct en de mesenterica om te bepalen of een tweede, kleinere accessoire lymfe kanaal isaanwezig. Indien aanwezig, blokkeert de stroming van lymfe door het kanaal door doorsnijden van de buis en afsluitorgaan met seconden, of binden van een hechting rond de buis, zodat het gehele volume van lymfe stroomt uit de darm wordt uit de superieure mesenterische lymfklieren duct.
- Laat een paar rechte tang door het peri-renale vet bed het onderste gedeelte van de rechter nier, en door het bindweefsel lagen direct onder de vena cava, in een richting evenwijdig met de superieure mesenterische lymfklieren duct.
- De tip van de forceps pak de lymfe canule en haal deze door de peri-renale vet bed met één uiteinde grenst aan het mesenterium kanaal en de andere veruiterlijkte van het dier op het niveau van de rechter nier.
- Isoleer de mesenteriale lymfe duct van bovenliggende lagen van bindweefsel en vetweefsel door stompe dissectie. Zorg dat u niet doorboren of schade aan de lymfe kanaal.
- Na het isoleren van de lymfe duct, een kleine hole in de lymfe kanaal met ofwel micro-schaar, de scherpe punt van de tang juwelier of een 25 G naald. Zorg ervoor dat u volledig verbreken van het schip.
- Zorg ervoor dat de lymfe canule volledig is gevuld met anti-stollingsmiddel oplossing (met behulp van een injectiespuit en 25 G naald) zonder luchtspleten. Plaats de lymfe canule ongeveer 2-4 mm in het mesenterium kanaal via de kleine opening met behulp van een kleine pincet.
- Let op de lymfe canule voor een paar minuten. Neem een geleidelijke stroming van intestinale lymfe van het vrije verzamelen uiteinde van de canule, indien de canule succesvol is. Als de canule niet succesvol is, herhaal dan de stappen 3,8-3,12.
- Als de canulatie succesvol is, zet de canule door het plaatsen van een kleine daling van de veterinaire lijm boven de ingang gat in de lymfe kanaal. Verzorgen het schip niet aan af te sluiten via de toepassing van overtollige veterinaire lijm.
- In afwachting van de veterinaire lijm stellen, opmer-ve de stroom van lymfe gedurende enkele minuten zodat de canule procedure succesvol was. Zodra bepaalde het succes van de canule, verwijder het gaas stukken die in de buikholte geplaatst zorgvuldig en plaats de dunne darm in zijn oorspronkelijke positie.
- Plaats een lymfe verzamelbuis die anti-coagulant (zie stap 1.6) aan het einde van de canule aan de vrij stromende lymfe verzamelen.
- Vervolgens canule het duodenum infusie van rehydratatie oplossingen en / of formuleringen.
4. Canulatie van de twaalfvingerige darm
- Bevestig het duodenum canule een injectiespuit (bijvoorbeeld 10 ml) gevuld met de rehydratatie oplossing.
- Identificeer het duodenum als de roze (meer bloedvaten) deel van de dunne darm, die bij zachte neerwaartse trekken onthult de maag.
- Maak een klein gaatje in het duodenum ongeveer 2 cm onder de kruising van de maag en twaalfvingerige darm (de pylorus) meteen steriele 23 G naald.
- Plaats de J vormige verslaafd einde van de twaalfvingerige canule door het gaatje. Vast te zetten met een druppel cyanoacrylaat lijm.
- Begin hydratatie van de rat door het bevestigen van de canule aan de rehydratatie spuit in een infusiepomp geladen. Volgens de literatuur rehydratatie percentages variëren 0,5-3 ml / uur 15,25.
- Na voltooiing van de lymfe en duodenum cannulatie, sluit de incisie in de abdominale spierwand met hechtingen. Sluit het huidincisie door een paar druppels weefselhechtmiddel (cyanoacrylaat) langs de kant van de insnijding en knijpen de huid aan beide zijden van de incisie bij elkaar.
5. Canulatie van de halsslagader
De halsslagader infusen kunnen worden uitgevoerd voor of na de canulatie van de mesenterische lymfklieren kanaal. Sommige operators liever de halsslagader canule voor cannuleren de lymfe kanaal teneinde po verminderententieel loskomen van de lymfe canule bij het verplaatsen van het dier.
- Plaats een markering op de halsslagader canule 2,5 cm van de schuine punt om het gedeelte van de buis identificeren voegen in de slagader. Sluit het andere uiteinde van de canule (dwz zonder afschuining) een 23 of 25 G naald bevestigd aan een injectiespuit gevuld met anti-coagulant oplossing en vul de canule met de anti-coagulant oplossing waardoor er geen luchtspleet aanwezig zijn.
- Om canulatie vergemakkelijken, plaats de verdoofde rat in de rug gelegd met de nek uitgerekt en het hoofd wijzend naar de operator. Merk op dat sommige exploitanten de voorkeur aan deze techniek uit te voeren met de staart van de rat de richting van de operator.
- Plaats een 1-1,5 cm longitudinale incisie door de huid laag boven links van de trachea in het sagittale vlak.
- Ontleden het onderhuidse bindweefsel met behulp van stompe punt tang om de onderliggende gepaarde nekspieren bloot.
- Trek de nekspieren to onthullen de linker halsslagader (gelegen ~ 1 cm onder het huidoppervlak en pulserend). Reinig de bovenliggende bindweefsel van de slagader door stompe dissectie.
- Isoleren van een ~ 1 cm doorsnede van de slagader voorzichtig met stompe weefsel tang, het verzorgen van de aangrenzende nervus vagus spoor niet te beschadigen. Voer deze door het openen en sluiten van de stompe punt tang verticaal langs weerszijden van de slagader te bevrijden van het omringende weefsel en nervus vagus.
- Met behulp van fijne punt tang, draad twee zijden hechtingen onder de halsslagader en plaats ze aan elk uiteinde van de geïsoleerde slagader sectie. Bind de hechting dichtst bij de bediener en het verst van de rat hart en de clavicula (figuur 3A).
- Afsluiten bloedstroom door de slagader door een paar rechte fijne punt tang onder de slagader (figuur 3B).
- De fijne punt irisschaar, plaats een kleine insnijding op het bovenoppervlak van de slagader (ongeveer 1/3 van denaar beneden vanaf de bovenzijde van de afgelegen). Spoel gemorste bloed op het oppervlak van de slagader met heparine zoutoplossing en veeg voorzichtig met behulp van katoen tips.
- Steek de punt van de canule in de slagader met een paar gebogen tip pincet. Eenmaal geplaatst, verwijdert u de rechte fijne punt tang afsluiten van de bloedstroom en vooraf de canule 2,5 cm in de slagader met behulp van twee paar tang, een om de canule in de slagader te houden om bloed te stoppen met lekken rug en de andere aan de canule in te voegen.
- Gebruik een kleine slagader klem om de canule in de slagader te houden en verwijder de rechte fijne punt tang dat in stap 5.8 de slagader geplaatst om de bloedstroom af te sluiten.
- Controleer de doorgankelijkheid van de canule door het injecteren van anti-coagulant oplossing in de canule en terugtrekken van een kleine hoeveelheid bloed (figuur 3C). Spoel vervolgens de canule met anti-stollingsmiddel en verzegelen het einde met de vlam van een aansteker of een canule stekker.
- Bind the canule op zijn plaats met de twee hechtingen in stap 5.8 onder de slagader geplaatst.
- Verwijder de arterieklem en veilig een derde hechtdraad rond de slagader en de canule. Sluit de nek wond met hechtingen.
6. Post-operatieve periode en Formulering Infusion
- Blijf de rat onder verdoving en op het verwarmde pad te houden.
- Hydrateren de rat door infusie van rehydratatie oplossing in het duodenum minstens 0,5 uur na voltooiing van de canuleringen. Let op de lymfe debiet afname (~ 0,1-0,5 ml / uur) tijdens de eerste periode na infusen en snel te verhogen tot een vlakke basislijn (0,4-2,5 ml / uur, afhankelijk van rehydratatie tarief).
- Na de herstelperiode, bezielen de formulering van belang (met lipiden, drugs, enz.) In de twaalfvingerige darm via de canule. Eventueel gebruik een infusiepomp met het debiet formulering regelen. OPMERKING: In de hier beschreven het protocol de dieren blijven ANAESthetised de hele operatie en lymfe collectie periode en worden geëuthanaseerd onder narcose, zodat aanvullende analgesie niet nodig is. Als het protocol wordt gewijzigd en de dieren in staat worden gesteld om het bewustzijn te herwinnen vervolgens passende pijnstilling en post-operatieve zorg nodig zal zijn.
- Bij de voltooiing van de infusie formulering blijft de rat rehydrateren met een snelheid van 1,5-3 ml / uur met een normale zoutoplossing in het duodenum om uitdroging te voorkomen.
- Blijf de rat op 37 ° C verwarmde chirurgische pad op de onderbuik houden temperatuur te handhaven (zoals in stap 2.3), express urine uit de blaas via zachte neerwaartse druk zoals vereist en herhaal oogzalf per uur (volgens stap 2.2. 3). Regelmatige lichaamshouding veranderingen worden aanbevolen als het dier is om het bewustzijn te herwinnen na de procedure.
7. Het verzamelen van lymfe en bloedmonsters te Lipid and Drug Absorption Beoordelen
- Verzamel lymfe continu inbuizen met anti-coagulant. Verandering buizen op de gewenste tijdsintervallen (bijvoorbeeld elk uur).
- Verzamel bloedmonsters op vaste tijdstippen.
- Afsluiten bloedstroom door de canule door het buigen van de canule terug 2 cm van het afgedichte. Unseal de canule door het afsnijden van de verzegelde einde of het verwijderen van de canule stekker.
- Met behulp van een lege injectiespuit, trekken heparine zoutoplossing uit de canule tot bloed vult de gehele canule.
- Met behulp van een nieuwe lege spuit, trekken het gewenste volume van het bloed en in een buisje met anti-stollingsmiddel.
- Met behulp van de eerste spuit, vervang het bloed genomen vóór de bemonstering om onnodig bloedverlies te verminderen. Vóór de injectie, flick de spuit terwijl het rechtop om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in te voeren van de canule.
- Met een injectiespuit Vervang de hoeveelheid bloed uit de rat anti-coagulant oplossing. Zorg dat er geen resterende bloed zichtbaar is in de canule als alle resterende kan stollenen blokkeren de canule.
- Buig de canule op ongeveer 2 cm van de onverharde einde te blokkeren bloedstroom en verwijder de spuit. Met behulp van de vlam van een aansteker of een canule stekker bedek de canule.
- Bij de voltooiing van bloed en lymfe collectie van de rat, euthanize de rat via intraperitoneale toediening van> 100 mg / kg natriumpentobarbiton.
- Bepaal lymfe debiet door het meten van de massa van lymfe tijdens elke periode verzameld.
- Meet de concentratie geneesmiddel en lipide in lymfe en bloed middels bijvoorbeeld HPLC, HPLC-MS of met commerciële kits, lipiden en absorptie efficiency beoordelen.
- Bereken massatransport geneesmiddel en lipiden in lymfe uit het product van de gemeten concentraties en hoeveelheden van lymfe verzameld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten van een representatief experiment kwantificeerbaar de cumulatieve mate en snelheid van lipide en geneesmiddel transport via het lymfestelsel volgende intestinale aflevering met behulp van de mesenterische lymfklieren canule model worden in figuur 4 en figuur 5. In dit experiment, 200 ug van het model lipofiele en 7,1 mg 2-monooleïne gedispergeerd in 5,6 ml van 5 mM natrium taurocholaat in fosfaatgebufferde - drug halofantrine is in een formulering die 40 mg oliezuur (5 uCi 14C-oliezuur 2 jaar) toegediend in de twaalfvingerige darm van ratten in 2 uur zoutoplossing pH 6,9. Na formulering toediening werden de ratten gerehydrateerd met een snelheid van 2,8 ml / uur met een normale zoutoplossing toegediend in het duodenum. Lymfe werd continu verzameld in buisjes veranderd elk uur gedurende 10 uur. De formulering werd bereid, en het experiment uitgevoerd volgens een protocol eerder beschreven voor een formulering die alle dezelfde compoenten behalve dat het geen rekening gehouden met 2-monooleine 43.
Zoals getoond in figuur 4, in deze experimentele omstandigheden de gemiddelde lymfe stromingssnelheid succesvol canule ratten tussen 0,4-1,3 ml / uur. In sommige ratten was de lymfe debiet iets lager in de eerste 1-3 uur na infusen en vervolgens verhoogd. Dit wordt vaak gezien na lymfe infusen. Ook getoond in figuur 4 is de lymfestroom tarief voor een mislukte experiment. In dit geval bleef het debiet aanzienlijk lager dan die bij de succesvolle experimenten in de hele collectie periode. Ook de cumulatieve lymfatische transport van triglyceride en halofantrine was aanzienlijk lager in de mislukte experiment (figuur 5A en B). De gemiddelde cumulatieve halofantrine transport in de succesvolle groep was 15,1% van de dosis, het cumulatieve triglyceride transport was 61 mg gedurende 10 uur en het percentage van de toegediende radiolabelled exogene lipide dosis in lymfe getransporteerd was 54% (figuur 5C). Deze waarden zijn niet significant verschillend van die eerder gezien een soortgelijke formulering die dezelfde componenten behalve de afwezigheid van 2-oleïne 43 (Tabel 1) bevatte. Dit suggereert dat formuleringen die vetzuren in afwezigheid van een bron van monoglyceride soortgelijke lipide en geneesmiddel transport kan ondersteunen lymfe die welke bevatten monoglyceride. Dit resultaat wordt verder beschreven in het hoofdstuk besproken.
Figuur 5D toont representatieve gegevens voor het tarief van halofantrine en triglyceride vervoer in de lymfe in de tijd na toediening. Het transport tarief van zowel triglyceriden en drugs in lymfe pieken een paar uur na lipide and Drug Administration en keert dan terug naar de uitgangswaarden. Zoals typisch is in intestinale lymfatische lipide en drugs transport experimenten, de snelheid van de drug transport in lymfe gedurende elke tijdsperiode spiegels gezien triglyceride transport als geneesmiddel samen met de triglyceride-rijke lipoproteïnen in lymfe getransporteerd.
Figuur 1. Schematische weergave van de vorm van het afgeschuinde uiteinde van een halsslagader of lymfe canule en de J-vormige afgeschuinde punt van dvenadtsatiperstnoi canule.
Figuur 2. Foto van (A) de buik geschoren in voorbereiding op de lymfe buis canule, (B) de abdominale spierwand geopend met een rechte 4 cm incisie uitstrekt vanaf de middellijn naar rechts doorbreken om de lymfe kanaal, en (C ) de superieure mesenteriale lymfe kanaal (in gele cirkel) loodrecht op de rechter nier. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Foto's van (A) de halsslagader geïsoleerd met twee zijden hechtdraden met de dichtst bij de bediener afgebonden, (B) de halsslagader geïsoleerd en bloedstroom afgesloten met een paar rechte fijne punt tang geplaatst onder de slagader, en (C) een halsslagader met canule op zijn plaats en de doorgankelijkheid wordt gecontroleerd door het tekenen weer een kleine hoeveelheid bloed. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 "src =" / files / ftp_upload / 52389 / 52389fig4highres.jpg "/>
Figuur 4. Representatieve gegevens voor mesenteriale lymfe debiet (pl / uur) in de tijd. De ratten werden toegediend in een bereiding met 200 ug halofantrine, 40 mg oliezuur (met 2 uCi 14 C-oliezuur) en 7,1 mg 2-monooleïne in 5.6 ml van 5 mM natrium taurocholaat in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 6,9) 0-2 uur. De getoonde gegevens zijn het gemiddelde ± SEM voor n = 3 succesvolle experimenten (gesloten cirkels, ●) en n = 1 gebrek aan resultaat (open driehoeken, Δ).
Figuur 5. Representatieve gegevens voor lipiden en drugs vervoer naar mesenteriale lymfeklieren. Cumulatieve transport van (A) het model drug halofantrine (HF,% dosis), (B) triglyceride (TG, mg) en (C) exogeen vetzuur (% dose), en de snelheid van het vervoer van (D) TG (mg / uur) en HF (% dosis / uur) in mesenteriale lymfeklieren in de tijd na toediening van een formulering die 200 ug halofantrine, 40 mg oliezuur (met 2 uCi 14 C-oliezuur) en 7,1 mg 2-monooleïne in 5,6 ml van 5 mM natrium taurocholaat in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 6,9) 0-2 uur. De getoonde gegevens zijn het gemiddelde ± SEM voor n = 4 succesvolle experimenten (gesloten cirkels, ●) en n = 1 gebrek aan resultaat (open driehoeken, Δ). Exogene vetzuur vervoer werd niet gemeten in het ongelijk gestelde experiment, maar is meestal laag in mislukte experimenten. Gegevens voor de mislukte experiment wordt weggelaten uit Paneel D voor de duidelijkheid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Zonder monoolein | Met 2-monolein | |||
| Betekenen | SEM | Betekenen | SEM | |
| Halofantrine (% dosis) | 15.1 | 0.8 | 15 | 1.6 |
| Triglyceride (mg) | 67 | 4 | 61 | 6 |
| Totaal vetzuur (umol) | 261 | 16 | 248 | 23 |
| Exogene oliezuur (umol) | 82 | 5 | 65 | 6 |
| Endogene vetzuur (umol) | 180 | 17 | 183 | 28 |
Tabel 1. Vergelijking van cumulatieve lymfatische vervoer gegevens van meer dan 10 uur na toediening van 200 ug halofantrine om lymfe duct gecannuleerd ratten in formuleringen die 40 mg oliezuur mesenterische (met daG 1 uCi 14C-oliezuur) geëmulgeerd in 5 mM natriumtaurocholaat in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 6,9) met of zonder 7.1 mg 2-oleïne. De gegevens geven het gemiddelde ± SEM voor n = 4 ratten. Geen statistisch significante verschillen waargenomen tussen de 2 groepen.
a In de groep gedoseerd met 2-monooleine dit is niet een nauwkeurige maatstaf van endogene vetzuur transport als de oliezuur verbonden aan de 2-monooleine ruggengraat niet wordt verantwoord in de gemeten exogene oliezuur vervoer naar lymfe.
b de gegevens halofantrine en totale vetzuur transport in de groep gedoseerd zonder 2-oleïne werd eerder gepubliceerd in figuur 5 van referentie 43, en wordt hier weergegeven in tabelvorm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De rat mesenteriale lymfe canulatie model maakt directe kwantificering van de concentratie en de snelheid van het vervoer van verschillende cellen en moleculen (zoals lipiden en drugs) uit de darm naar de lymfe en de aanpassingen aan deze die optreden in reactie op uitdagen van verschillende stoffen (dieet antigeen, drugs, formuleringen etc.) 10,27 en ziekten (kanker, virussen, colitis, insulineresistentie, etc.) 5-7. De in lymfe verzameld componenten kunnen ook verder worden gebruikt in de aanvullende experimenten. Bijvoorbeeld kunnen cellen worden gekweekt 44, lipoproteïnen gefractioneerd en lymfe of zijn componenten zoals lipoproteïnen of cellen, geladen met markers zoals drugs, radioactieve merkers en fluorescerende probes. Deze kunnen vervolgens worden teruggeplaatst in ontvangende dieren directer hun functie, metabolisme, klaring en / of weefsel plaatsing patronen 45-47 evalueren. De rat lymfe canulatie model heeft een aantal voordelen ten opzichte van de OTHer in vitro, in situ, in silico en in vivo modellen die zijn beschreven in de inleiding. Belangrijker nog, canulatie is de enige methode die directe toegang tot het gehele volume van de componenten in lymfevocht mogelijk maakt. Wanneer uitgevoerd in de handen van een ervaren operator het model robuust, reproduceerbaar en experimentele succespercentages van> 80% worden bereikt. Echter, de chirurgische techniek moeilijk om aanvankelijk beheersen, vooral in een laboratorium is niet bekend met de techniek.
Verschillende stappen zijn cruciaal voor het succes van de mesenteriale lymfeklieren canulatie model. De eerste is de juiste keuze van chirurgische instrumenten en het type canule en voorbereiding. Ons laboratorium maakt gebruik van PE canules met afmetingen OD 0,8 x ID 0,5 mm. Er zijn echter andere labs succes met PVC canules van dezelfde dimensie 15 ervaren. Afschuining het uiteinde van de canule en voorweekkanaal in een anti-coagulant helpt ook te voorkomenocclusie van, en de vorming van stolsels in de canule na inbrengen (stap 3.13). De eerste stap van de chirurgische procedure die sommige operators bijzonder kritisch verzorgt de lagen van bindweefsel en vetweefsel boven de lymfe kanaal (stap 3.10) te reinigen. Dit helpt bij het inbrengen van de canule tussen het weefsel en lymfe duct plaats van in de lymfe kanaal voorkomen. Echter, deze reinigingsstap is moeilijk omdat de lymfe kanaal is kwetsbaar en gemakkelijk te beschadigen. Voor sommigen zijn deze stap en het inbrengen van de canule meest succes met behulp van een chirurgische microscoop hoewel anderen een microscoop is niet noodzakelijk. Bij het inbrengen van de canule in het kanaal richting en insteekdiepte opzichte van het afgeschuinde uiteinde vereist enige aandacht om de canule wordt afgesloten door de vaatwand (stap 3.12) te voorkomen. Elke operator heeft de neiging om hun eigen individuele voorkeur te vinden. Ook belangrijk is het vermijden van de vorming luchtbel in de cannula tijdens het inbrengen als luchtspleten gelden terug te druk om de vrije stroom van lymfe (stap 3.12). Tenslotte moet de toepassing van de veterinaire lijm aan de canule vast te zetten onder het invoegpunt in het kanaal als kleefstof direct op de buis geplaatst kan het vaartuig vouwen en afsluiten de cannule tip (stap 3.14) veroorzaken.
De eenvoudigste eerste gids over de vraag of een operatie succesvol is is het debiet van lymfe. Als de canule op zijn plaats lymfe algemeen begint langzaam vloeien in de eerste 30 min en daarna toeneemt. Typisch stroomsnelheden voor een succesvolle canuleringen bij ratten> 250 g zijn> 0,1 ml / uur in het eerste uur en daarna verhogen tot> 0,4 ml / uur bij stationaire toestand zoals getoond in figuur 4. Hoewel natuurlijk kan deze variëren naargelang de . experimentele conditie In termen van het oplossen van problemen, als er geen lymfe stroomt door de canule of het debiet laag is kan dit zijn omdat:
- de canule werd niet goed in het kanaal geplaatst
- de canule in het kanaal, maar afgesloten door de kant van de vaatwand
- de canule in het kanaal, maar afgesloten door lijm aangebracht in de verkeerde positie
- de canule het kanaal als een luchtbel in de canule vertraagt de stroming
- een stolsel heeft binnen de canule gevormd
Zorgvuldige inspectie blijkt meestal de onderliggende factor. Indien de operator de canule gelooft niet correct in de eerste plaats gebracht (dwz lymfe nooit stromende) vervolgens opnieuw inbrengen noodzakelijk. Als de canule lijkt te zijn op de juiste plaats dan de eerste factor om te controleren is of een luchtbel of stolsel aanwezig is. Luchtbellen in het algemeen passeren de canule als lymfe stromen en tijdelijk langzame stroming. Soms is het mogelijk om luchtbellen of stolsels verwijderen door terugtrekken op de canule met een 25 G naald bevestigd aan bijvoorbeeld een 1 ml injectiespuit. Als er geen bel of stolsel kan het nuttig zijn om te proberen herpositionering de rat en / of wentelen of licht trekken de canule. Dit kan soms lijnt de canule zodanig dat het niet tegen de vaatwand wordt geblokkeerd. Soms verwijderen van de lijm met of zonder kleine beweging van de canule kan de lymfe ook weer stromen. Echter, als al het andere faalt de canule moet worden teruggeplaatst. In onze ervaring experimenten zijn minder succesvol wanneer de canule niet correct is geplaatst op de eerste poging. Echter, chirurgische redding mogelijk is. Een andere complicatie die kan optreden is moeilijk canule door anatomische variatie tussen ratten. Bijvoorbeeld, het mesenterium kanaal af gaat in een lastige richting of er een accessoire lymfe kanaal aan de tegenoverliggende zijde van de arteria mesenterica superior de grotere mesenterische lymfklieren duct. In experimenten die collectie van het gehele volume van lymfe stroomt uit de dunne darm vereist (zoals het gevalbij de beoordeling totaal lipide en geneesmiddel transport van de darm via de lymfevaten), de accessoire lymfe kanaal moet worden geoccludeerd zodat alle lymfe wordt naar de superieure lymfe kanaal. Dit is moeilijk te bereiken, maar kan worden geprobeerd door binden een hechting rond de accessoire kanaal of versnijden het accessoire kanaal en afsluitorgaan met veterinaire lijm (stap 3.6). De aanwezigheid van een accessoire lymfe kanaal is een van de belangrijkste factoren die resulteert in experimentele fout in lymfatisch drug transport experimenten. Als het accessoire vaartuig is niet volledig afgesloten, lymfestroom en lipide en drugs vervoer zijn aanzienlijk lager dan verwacht.
In het protocol hier gepresenteerde blijft het dier onder narcose gedurende de lymfe collectie periode. De verdoofde rat-model (in plaats van bewuste modellen hieronder beschreven) verhoogt experimentele doorvoersnelheid als de operatie en experiment kan worden uitgevoerd over één in plaats van enkele dagen en de chirurgische succes rat groter omdat het gemakkelijker canule doorgankelijkheid handhaven geïmmobiliseerde dieren. Verdoving kan theoretisch verminderen maaglediging, intestinale lipide verwerking en lymfestroom en transport. Onze ervaring is echter lymfatische lipide en geneesmiddel transport vergelijkbaar verdoofde ratten waaraan het geneesmiddel rechtstreeks in het duodenum (te omzeilen maaglediging) binnen vooraf gedigereerd en pre-gedispergeerde voertuigen (bijvoorbeeld vetzuren en monoglyceride micellaire systemen gedispergeerd oppervlakteactieve ) vergeleken met bewuste ratten op gelijkwaardige triglyceride 21,23,27 toegediend het geneesmiddel via orale gavage in de maag. Inderdaad, de meerderheid van intestinale lymfatisch geneesmiddeltransport experimenten in ons lab in de afgelopen 10 jaar uitgevoerd onder anesthesie ontstaan, vanwege de hogere doorvoer kan worden bereikt. In deze experimenten hebben we meestal toegediende geneesmiddelen in formuleringen die vetzuur (bijvoorbeeld oliezuur) en surfactant 43.Vetzuren worden gesynthetiseerd in triglyceriden vóór opname in intestinale lymfe lipoproteïnen en dit vereist de bron van componenten aan de glycerol hoofdketen van de triglyceriden (bijvoorbeeld 2-monoglyceride of glycerol-3-fosfaat) te vormen. Dit suggereert dat toediening van vetzuren in afwezigheid van een glycerol bron kan leiden tot verminderde lymfatisch transport. Toediening van vetzuren echter maakt de directe berekening van de bijdrage van de exogeen toegediende vetzuur en endogene lipiden lymfatische lipide en geneesmiddeltransport 43. Bovendien, 2-monoglyceride is duur en vaak instabiel het gemakkelijk isomeriseert 1-monoglyceride dat gedigereerd glycerol in het darmlumen. In de hier vermelde onderzoeken we verder aan te tonen dat lymfatische lipide en geneesmiddel transport gelijk na toediening van het modelgeneesmiddel halofantrine met een vetzuur (bijvoorbeeld oliezuur) en surfactant (galzout) formulering ofwel de presence of afwezigheid van de glycerol bron 2-monooleïne (Tabel 1). Endogene bronnen glycerol aldus voldoende om equivalente lymfestroom en lipide en geneesmiddeltransport na toediening van dit model geneesmiddel met vetzuren (bijvoorbeeld oliezuur) bij afwezigheid van een glycerol bron ondersteunen. Dit geeft vertrouwen dat representatieve lymfatisch datatransport kan worden verkregen met eenvoudige vetzuur formuleringen.
De verdoofde model wordt gemakkelijk uitgebreid een bewuste model indien nodig. In de bewuste modellen formuleringen direct in de maag kan worden gavaged of toegediend in de twaalfvingerige darm of intraveneus, kan directe vergelijkingen worden gemaakt om farmacokinetische studies uitgevoerd bij niet-lymfe gecannuleerd bewuste dieren en de resultaten kunnen meer fysiologisch relevant worden beschouwd. De langere tijdsperiode toegestaan dieren bij bewustzijn heeft ook het voordeel dat de verzameling vollediger farmacokinetische profielen voor Dr.ug concentraties in het bloed, terwijl in verdoofde experimenten, bloed profielen zijn vaak onvolledig, vooral voor lange halfwaardetijd drugs. Zoals hierboven beschreven, echter, het slagingspercentage van bewuste lymfe canule studies lager en experimenten langer duren om te voltooien. Er zijn twee typen bewuste lymfe cannulatie modellen in de literatuur beschreven. In de bewuste ingetogen modellen 15, naar aanleiding van de lymfe canulatie operatie wordt het dier gewoon draaide op zijn voorkant en geplaatst in een passende terughoudendheid voor de rest van het experiment met de lymfe canule uitbesteed en ingebracht in een verzameling buis. Het dier wordt dan toegestaan om bewustzijn herwinnen en te herstellen van de operatie O / N. Het slagingspercentage met dit model is zeer goed in de handen van ervaren operators, maar het kan moeilijk zijn om de ethiek verklaring te verkrijgen om dieren te beperken voor de langere tijd die nodig is voor lymfe collectie. Een alternatieve model is waar lymfe wordt verzameldvan bewust en vrij bewegende ratten. Dit model is eerder 25 beschreven. In dit model lange canules ingebracht in de mesenterische lymfklieren kanaal, duodenum en halsslagader. De canules worden dan getunneld onder de huid naar buiten gebracht bij de achterkant van de nek en geplaatst via een draaibaar systeem. De rat wordt in een harnas bevestigd aan de wartel en liet bewustzijn herwinnen en te herstellen van de operatie O / N. Het dier heeft het vrije verkeer binnen een metabole kooi en lymfe en bloed monsters kunnen worden verzameld uit de canules uitbesteed buiten de kooi.
Mesenteriale lymfe canulatie blijft de enige tool die de directe evaluatie van lymfe componenten maakt in hun ontluikende staat. Lymfe canule wordt meestal beschreven in ratten de operatie minder complex dan kleinere en grote dieren, het model goedkoper dan grote dieren en resultaten lijken redelijk vergelijkbaar tussen soorten 27. De modus ratl kan worden aangepast aan de experimentele behoefte en het slagingspercentage is hoog in de handen van ervaren operators. Het model kan ook worden gecombineerd met andere in vitro of in vivo te onderzoeken, in detail, het metabolisme of de functie van intestinale lymfe componenten. Eenmaal gevestigd de mesenterische lymfklieren model canule rat is dus een krachtig instrument voor de concentratie, transport, functie en opname van diverse parameters die direct overgaan van de darm naar het lymfesysteem (en vaak vloeien uiteindelijk de systemische circulatie) evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile saline | Baxter healthcare | AHB 1307 | Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50 |
| 70 % ethanol in water | Any | Any brand can be used | |
| Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) | Livingstone International | JJ60243L | Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L |
| Betadine solution | Livingstone International | BU0510 | Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510 |
| Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) | PROVET VICTORIA | KETA I 1 | http://www.provet.com.au/ |
| Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) | PROVET VICTORIA | TRO-3828 | http://www.provet.com.au/ |
| ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) | PROVET VICTORIA | VTG-DACP010020 | http://www.provet.com.au/ |
| Sodium pentobarbitone | PROVET VICTORIA | 24529 | Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au |
| Heparin (35000I.U. in 35 mL) | Sigma Pharmaceuticals | 337220 | http://sigmaco.com.au/ |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E1644 | Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. |
| Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm | Microtube extensions | PE8050 | Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m |
| Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm | Microtube extensions | PE9658 | Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m |
| Ruler | Any | Any brand can be used | |
| Markers | Any | Any brand can be used | |
| Cigarette lighter | Any | Any brand can be used | |
| Veterinary adhesive | Any | Any brand can be used | |
| 23 gauge needles | Livingstone International | DN23GX0.75LV | Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6&search=DN23GX0.75LV |
| 25 gauge needles | Livingstone International | DN25GX1.0LV | Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV |
| 1 ml syringe | Livingstone International | T3SS01TA | Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA |
| 10 ml syringe | Livingstone International | T3SS10SA | Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA |
| Gauze swabs | Livingstone International | GSC075 | Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075 |
| Cotton buds | Livingstone International | CTAST075DP | Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP |
| Heating pad | Ratek | WT1 | Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray. |
| Surgical light | Harvard Apparatus | 72-0215 with 72-0267 | Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail and http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___ |
| Surgical microscope | Zeiss | 495005-0014-000 | Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143 |
| Silk suture | Livingstone International | DTSK163019F4 | Any brand can be used. Example here is 3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4 |
| Scalpel blades | Fine Science Tools (FST) | 10020-00 | Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191 |
| Scalpel handle | Fine Science Tools (FST) | 10004-13 | Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51 |
| 1 x Small surgical scissors | Fine Science Tools (FST) | 14060-09 | Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17 |
| 2 x Forceps with serrated curved tip | Fine Science Tools (FST) | 11001-13 | Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32 |
| 1 x Iridectomy scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-08 | Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 |
| 1 x Forceps with straight serated tip | Fine Science Tools (FST) | 11650-10 | Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32 |
| 1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip | Fine Science Tools (FST) | 11251-10 | Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29 |
| 1 x Forceps with smooth fine curved forceps | Fine Science Tools (FST) | 11063-07 | Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360 |
| 2 x Hemostats | Fine Science Tools (FST) | 13010-12 | Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33 |
| 1 x Suture needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12001-13 | Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70 |
| 1 x Artery clamp | Fine Science Tools (FST) | 18050-28 | Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82 |
| Oleic acid | Sigma Aldrich | O1008 | When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en®ion=AU |
| 14C-oleic acid | Perkin | NEC317050UC | Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC |
| Sodium taurocholate | Sigma Aldrich | T4009 | Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en®ion=AU |
| Halofantrine | Glaxo Smith Kline | Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71507 | Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en®ion=AU |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | 71643 | Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en®ion=AU |
References
- Barrowman, J. A., Tso, P.
- Karaman, S., Detmar, M.
- Mossel, E. C., Ramig, R. F. A lymphatic mechanism of rotavirus extraintestinal spread in the neonatal mouse. J Virol. 77 (22), 12352-12356 (2003).
- Pantaleo, G., et al. Hiv-Infection Is Active and Progressive in Lymphoid-Tissue during the Clinically Latent Stage of Disease. Nature. 362 (6418), 355-358 (1993).
- Chakraborty, S., Zawieja, S., Wang, W., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, R94-R102 (2010).
- Dixon, J. B. Lymphatic lipid transport: sewer or subway. Trends Endocrinol Metab. 21 (8), 480-487 (2010).
- Weid, P. -Y., Rehal, S., Ferraz, J. G. Role of the lymphatic system in the pathogenesis of Crohn's disease. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (4), 335-341 (2011).
- Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PloS one. 4 (12), e8442 (2009).
- Ji, Y., et al. Activation of rat intestinal mucosal mast cells by fat absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1292-G1300 (2012).
- Kohan, A., Yoder, S., Tso, P. Lymphatics in intestinal transport of nutrients and gastrointestinal hormones. Ann N Y Acad Sci. 1207, Suppl 1. E44-E51 (2010).
- Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Targeted drug delivery to lymphocytes: a route to site-specific immunomodulation. Mol Pharm. 7 (6), 2297-2309 (2010).
- Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin Exp Immunol. 92 (2), 317-322 (1993).
- Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update. Adv Drug Deliv Rev. 60 (6), 702-716 (2008).
- Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. Am J Physiol. 261 (3 Pt 1), G530-G538 (1991).
- Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
- Porter, C. J., Trevaskis, N. L., Charman, W. N. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nat Rev Drug Discov. 6 (3), 231-248 (2007).
- Trevaskis, N. L., et al. The role of the intestinal lymphatics in the absorption of two highly lipophilic cholesterol ester transfer protein inhibitors (CP524,515 and CP532,623). Pharm Res. 27 (5), 878-893 (2010).
- Choo, E. F., et al. The Role of Lymphatic Transport on the. Systemic Bioavailability of the Bcl-2 Protein Family Inhibitors Navitoclax (ABT-263) and ABT-199. Drug Metabolism and Disposition. 42 (2), 207-212 (2014).
- Han, S., et al. Targeted delivery of a model immunomodulator to the lymphatic system: comparison of alkyl ester versus triglyceride mimetic lipid prodrug strategies. J Control Release. 177, 1-10 (2014).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. J Lab Clin Med. 33 (10), 1349-1352 (1948).
- Porter, C. J., Charman, S. A., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the triple-cannulated anesthetized rat model: effect of lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85 (4), 351-356 (1996).
- Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (2), 115-120 (2004).
- Porter, C. J., Charman, S. A., Humberstone, A. J., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the conscious rat when administered as either the free base or the hydrochloride salt: effect of lipid class and lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85 (4), 357-361 (1996).
- Caliph, S. M., Charman, W. N., Porter, C. J. Effect of short-, medium-, and long-chain fatty acid-based vehicles on the absolute oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of halofantrine and assessment of mass balance in lymph-cannulated and non-cannulated rats. J Pharm Sci. 89 (8), 1073-1084 (2000).
- Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Adv Drug Deliv Rev. 50 (1-2), 45-60 (2001).
- Noguchi, T., Charman, W. N. A., Stella, V. J. Lymphatic Appearance of Ddt in Thoracic or Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rats. International Journal of Pharmaceutics. 24 (2-3), 185-192 (1985).
- Trevaskis, N. L., et al. A mouse model to evaluate the impact of species, sex, and lipid load on lymphatic drug transport. Pharm Res. 30 (12), 3254-3270 (2013).
- Kota, J., et al. Lymphatic absorption of subcutaneously administered proteins: influence of different injection sites on the absorption of darbepoetin alfa using a sheep model. Drug Metab Dispos. 35 (12), 2211-2217 (2007).
- McHale, N. G., Adair, T. H. Reflex modulation of lymphatic pumping in sheep. Circ Res. 64 (6), 1165-1171 (1989).
- White, D. G., Story, M. J., Barnwell, S. G. An Experimental Animal-Model for Studying the Effects of a Novel Lymphatic Drug Delivery System for Propranolol. International Journal of Pharmaceutics. 69 (2), 169-174 (1991).
- Khoo, S. M., Edwards, G. A., Porter, C. J., Charman, W. N. A conscious dog model for assessing the absorption, enterocyte-based metabolism, and intestinal lymphatic transport of halofantrine. J Pharm Sci. 90 (10), 1599-1607 (2001).
- Kararli, T. T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals. Biopharm Drug Dispos. 16 (5), 351-380 (1995).
- Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. J Biomed Opt. 17 (8), 086005 (2012).
- Dahan, A., Hoffman, A. Evaluation of a chylomicron flow blocking approach to investigate the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs. Eur J Pharm Sci. 24 (4), 381-388 (2005).
- Xiao, C., Lewis, G. F.
- Seeballuck, F., Ashford, M., O'Driscoll, C. The Effects of Pluronic® Block Copolymers and Cremophor EL on Intestinal Lipoprotein Processing and the Potential Link with P-Glycoprotein in Caco-2 Cells. Pharmaceutical Research. 20 (7), 1085-1092 (2003).
- Levy, E., Mehran, M., Seidman, E. Caco-2 cells as a model for intestinal lipoprotein synthesis and secretion. The FASEB Journal. 9 (8), 626-635 (1995).
- Cartwright, I. J., Higgins, J. A. Isolated rabbit enterocytes as a model cell system for investigations of chylomicron assembly and secretion. Journal of Lipid Research. 40 (7), 1357-1365 (1999).
- Dixon, J. B., Raghunathan, S., Swartz, M. A. A Tissue-Engineered Model of the Intestinal Lacteal for Evaluating Lipid Transport by Lymphatics. Biotechnology and Bioengineering. 103 (6), 1224-1235 (2009).
- Gershkovich, P., et al. The role of molecular physicochemical properties and apolipoproteins in association of drugs with triglyceride-rich lipoproteins: in-silico prediction of uptake by chylomicrons. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 61 (1), 31-39 (2009).
- Gershkovich, P., Hoffman, A. Uptake of lipophilic drugs by plasma derived isolated chylomicrons: Linear correlation with intestinal lymphatic bioavailability. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 26 (5), 394-404 (2005).
- Holm, R., Hoest, J. Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer. International Journal of Pharmaceutics. 272 (1-2), 189-193 (2004).
- Trevaskis, N. L., Porter, C. J., Charman, W. N. Bile increases intestinal lymphatic drug transport in the fasted rat. Pharm Res. 22 (11), 1863-1870 (2005).
- Miura, S., et al. Increased proliferative response of lymphocytes from intestinal lymph during long chain fatty acid absorption. Immunology. 78 (1), 142-146 (1993).
- Caliph, S. M., et al. The impact of lymphatic transport on the systemic disposition of lipophilic drugs. J Pharm Sci. 102 (7), 2395-2408 (2013).
- Caliph, S. M., Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Intravenous dosing conditions may affect systemic clearance for highly lipophilic drugs: implications for lymphatic transport and absolute bioavailability studies. J Pharm Sci. 101 (9), 3540-3546 (2012).
- Trevaskis, N. L., et al. Tissue uptake of DDT is independent of chylomicron metabolism. Arch Toxicol. 80 (4), 196-200 (2006).
