Abstract
Den intestinale lymfesystemet spiller centrale roller i flydende transport, lipid absorption og immunforsvar. Lymfeknuder flyder direkte fra tyndtarmen via en række lymfekar og knuder, der konvergerer på den overlegne mesenterielymfeknuderne kanal. Kanylering af mesenteriske lymfeknuder kanal muliggør således samling af mesenteriske lymfeknuder strømmer fra tarmen. Mesenteriske lymfeknuder består af en cellulær fraktion af immunceller (99% lymfocytter), vandige fraktion (væske, peptider og proteiner, såsom cytokiner og gut hormoner) og lipoprotein fraktion (lipider, lipofile molekyler og apo-proteiner). Den mesenteriske lymfeknuder kanal kanylering model kan derfor anvendes til at måle koncentration og transport af en række faktorer fra tarmen via lymfesystemet. Ændringer af disse faktorer i respons på forskellige udfordringer (f.eks kost, antigener, lægemidler) og sygdom (f.eks, inflammatorisk tarmsygdom, HIV, diabetes) kan også be bestemmes. Et område for at udvide interesse er den rolle, lymfatisk transport i absorptionen af oralt administrerede lipofile lægemidler og prodrugs som associerer med tarm lipid absorptionsveje. Her beskriver vi, i detaljer, en mesenterial lymfe kanal kanylerede rotte model, som gør det muligt vurdering af hastigheden og omfanget af lipid og lægemiddel transport via lymfesystemet i flere timer efter intestinal levering. Fremgangsmåden er let at tilpasse til måling af andre parametre i lymfeknuder. Vi giver detaljerede beskrivelser af de vanskeligheder, der kan opstå ved etablering dette komplekse kirurgisk metode, samt repræsentative data fra fejlslagne og succesfulde eksperimenter til at give instruktion om, hvordan at bekræfte eksperimentel succes og fortolke de opnåede data.
Introduction
Lymfeknuder flyder fra tyndtarmen via en ensrettet proces, der stammer fra en enkelt lacteals der er indeholdt i hver tyndtarmens villi 1. Lacteals er relativt gennemtrængelig for væske, makromolekyler og celler og lymfeknuder dannelse dermed begynder med indførelsen af disse faktorer i lacteals. Den oprindelige lymfeknuder i lacteals efterfølgende flyder fra tarmen via et netværk af lymfatisk mikrokar, indsamling (afferent) lymfekar, en række mesenteriallymfeknuder og i sidste ende de post-nodal (efferente) lymfekar. Inden for de knuder, lymfeknuder passerer gennem en række medullære bihuler hvor udveksling opstår med node hjemmehørende immunceller samt materiale ind i knuden fra blodet. Alle lymfeknuder flyder fra tyndtarmen til sidst konvergerer ind i efferente overlegen mesenterielymfeknuderne kanal og efterfølgende cisterna chyli. Cisterna chyli indsamler også lymfe dræning de caudale perifere væv, intestINAL hepatiske og lumbal regioner og slutter thoraxlymfen kanalen sammen med lymfeknuder fra mediastinum og craniale dele af kroppen. Thoraxlymfen kanal tømmer lymfe direkte ind i venøse system ved krydset af den venstre interne jugularis og subclavia vener. Den her beskrevne protokol, som muliggør indsamling af lymfe direkte fra den øvre mesenteriske lymfeknuder kanal, letter således analyse af forskellige faktorer transit direkte fra tarmen til det systemiske (generelt) omsætning via den intestinale lymfesystemet.
De vigtigste fysiologiske funktioner tildelt tarmens lymfesystemet er at opretholde væskebalancen, for at lette lipid og lipofile molekyle absorption, og for at muliggøre passende immunrespons 1. Tumorceller og vira også forplanter via tarmens lymfevejene 2-4 og centrale ændringer optræder inden for de lymfevejene i flere inflammatoriske og metaboliske sygdomme 5-7. Cannulation af mesenteriske lymfeknuder kanal til at indsamle lymfeknuder i mesenteriet muliggør en analyse af bulk-fluidstrøm via intestinale lymfekar samt kvantificering af koncentrationen og transport på forskellige celler og molekyler. Ændringer i fusionen eller transit af disse faktorer som reaktion på forskellige udfordringer (fx kost, antigener, lægemidler) samt i sygdomsmodeller (f.eks, colitis, hiv, diabetes) kan også vurderes. Selv om det er umuligt at udstrakt beskrive hver lymfeknuder komponent, som kan analyseres og sammenlignes her, mesenterisk lymfeknuder består forenklet af vandig, lipid og cellulære faser. Komponenter af interesse i den vandige fase omfatter peptider og proteiner, såsom antigener eller tolerogens 8 immune messengers, såsom cytokiner og mast cellemediatorer 9 og metaboliske mediatorer, såsom inkretiner 10. Den cellulære del af den post-nodal mesenterielymfeknuderne består næsten udelukkende (over 99%) af lymphocytes 11. Forskellige immunceller (dendritiske celler, mastceller, etc.) Indtast pre-nodal mesenteriske lymfekar men forbliver inden knudepunktet 12. Hvis cellerne inden afferent lymfeknuder er af interesse, er det muligt at indsamle disse celler via fjernelse af mesenteriallymfeknuder flere dage før kanylering af mesenteriske lymfeknuder kanalen 12. På denne måde afferente og efferente lymfebanerne er direkte forbundet og lymfeceller i afferente lymfe passere direkte ind i mesenteriske lymfeknuder kanalen. Transit og fænotype af forskellige immunceller, der passerer gennem tarmen lymfevejene kan således undersøges. Måske er den mest almindelige årsag citeret for indsamling mesenteriske lymfeknuder til dato er imidlertid, at studere intestinal behandling, absorption og transport af kosten lipider og lipofile molekyler 10.
Efter indtagelse er kosten lipider fordøjet (for eksempel fra triglycerid til fedtsyrer og monoglycerid phospholipid til fedtsyrer og lysophospholipid og cholesterol ester til fedtsyre og cholesterol, etc.) og dispergeret i det intestinale lumen i små micelle og vesikulære strukturer via tilsætning af amfifiler fra galde (phospholipider, cholesterol og galdesalte) og virkningen af pankreasenzymer 10,13. Herfra de optages i enterocytter. En del af de absorberede komponenter re-esterificeret til dannelse af triglycerider, phospholipider og cholesterolestere i de absorberende celler (enterocytter). Disse re-esterificerede lipider samles fra en kombination af eksogent indtaget lipidbestanddele og endogene lipidbestanddele fra det udskilte galde, mucosale lipid pools eller intestinal blodtilførsel 13. Herfra esterificerede lipider er enten gemt i enterocytter eller samlet i tarm lipoprotein (chylomikroner, meget lav density lipoprotein (VLDL)) sammen med diverse apoproteiner og andre lipofile molekyler (
Indsamlingen af mesenteriske lymfeknuder muliggør således vurderingen af transport af lipoproteiner og tilhørende komponenter (lipider, lipofile molekyler, Apo-proteiner) fra tarmen. De lipoproteiner kan kvantificeres og karakteriseres med den fordel, at mesenteriske lymfeknuder lipoproteiner, generelt er i en nascent tilstand, da de ikke er blevet grundigt ændret af systemiske enzymer såsom lipoproteinlipase 15. Mens mesenteriske lymfeknuder kanyle rotte model er måske historisk blevet meget omfattende beskrevet for analysen af lipid / lipoprotein transport fra tarmen, et område med voksende interesse er den rolle, lymfevejene i transport af lipofile lægemidler, prodrugs og andre miljøfremmede stoffer 13,16 der er fokus for den model, der er beskrevet her. Lipofile lægemidler (generelt dem med log P> 5 og opløselighed i langkædet triglycerid> 50 mg / g, selv om undtagelser er tilsyneladende) 17,18, prolægemidler 19 og andre xenobiotika 13,16 kan få adgang til de intestinale lymfekar enten passivt eller ved aktivt at integrere i tarm lipoprotein transportveje 19.
Rotten mesenteriske lymfeknuder kanylering teknik har således mange applikationer. Bollman et al. Først beskrevet en Technique til kanyle den mesenteriske lymfeknuder kanal hos rotter i 1948 20. Da er blevet beskrevet så en række variationer af modellen. For eksempel kan samling forekomme, når rotten bedøvet med forskellige anæstetika 21,22, eller i den bevidste tilstand mens behersket 15 eller frit bevægelige 23,24. Rotter kan indgives forskellige rehydrering løsninger og andre stoffer, såsom lipider og lægemiddelformer på forskellige satser i mave, tarm eller parenteralt (typisk 0-5 ml / time) 25. I nogle studier thoraxlymfen kanalen snarere end mesenteriske lymfeknuder kanalen kanyle at estimere transport fra tarmen via lymfevejene selvom dette kan overvurdere transit fra tyndtarmen, afhængigt af faktor af interesse, som thoraxlymfen kanalen modtager også lymfeknuder fra andre regioner 22,26. Lymfeknuder kanylering modeller er også blevet beskrevet i flere andre arter, herunder mus 15,27, mini-piGS 12, får 28,29, svin 30 og hunde 31. Imidlertid rottemodellen er det mest og konsekvent nævnt. Detaljerede protokoller for kanylering af den mesenteriske lymfeknuder kanalen efterfulgt af opsamling af lymfeknuder i bevidst 25 eller bedøvet 22 rotter og mus 15,27 er blevet offentliggjort tidligere, og den interesserede læser er rettet mod disse protokoller. Denne protokol er den første til at demonstrere teknikken i en visualiseret format.
Den lymfeknuder kanyle rotte model har fordele i forhold til større dyremodeller med hensyn til omkostninger, den lethed, kirurgi og etiske overvejelser. Sammenlignet med musemodel, mesenteriske lymfeknuder kanylering kirurgi er også lettere i rotten, selv om musemodel muliggør mere detaljerede undersøgelser i transgene dyr 27. Ikke desto mindre er der nogle begrænsninger rottemodellen, især dem der er forbundet med forskelle i fysiologi, denne grænse extrapolation til andre prækliniske og kliniske situationer. For eksempel i rottegalde flow er konstant og uafhængig af fødeindtagelse mens højere arter fødevarer eller lipider stimulere galde flow 32. Dette skaber udfordringer for at opnå repræsentative præ- og postprandiale miljøer i rotter, der afspejler, hvad der er set i større arter og mennesker. For drug delivery studier kan større arter også foretrækkes ved vurderingen lymfe transport efter administration af realistiske menneskelige dosis danner 25. I en nylig undersøgelse blev lipid transportpriser i mesenteriske lymfeknuder viser sig at være sammenlignelige på tværs af arter (mus, rotter, hunde) efter administration af en tilsvarende masse og typen af lipid, som giver en vis tillid i lipid transport data ekstrapolere på tværs af arter 27. Men transporten af en model lipofilt lægemiddel, halofantrin, rangeret i størrelsesordenen dyrets størrelse (dvs. hund> rotte> mus). En skaleringsfaktor kan således være forpligtet til extrapolate lymfe stof transport af data fra rotte til andre arter.
En begrænsning af lymfeknuder kanylering modeller i almindelighed, er, at passiv lymfe samling direkte fra en lymfe kanal kan ændre lymfe flow og transport, da lymfekar modarbejde en trykgradient, der er ændret, når fartøjet er kanyle 33. Den lymfeknuder kanylering modellen kan også være vanskeligt at fastslå, i laboratorier, som er bekendt med teknikken. Der er således blevet beskrevet Alternative modeller. For eksempel transit faktorer via intestinal lymfesystemet, såsom lipoproteiner og lipofile molekyler, er blevet indirekte undersøgt via opsamling af blod. En sådan model indebærer sammenligning blodkoncentrationer af lipider og / eller lægemidler efter oral administration i nærvær og fravær af hæmmere (f.eks, colchicin, Pluronic L81, cycloheximid) af intestinal lipoprotein produktion, der blokerer lymfatisk transport 34. En fordelaf modeller, der kvantificerer lymfatisk transport indirekte via indsamling af blodprøver er, at det muliggør en evaluering af lymfatisk transport i mennesker invasiv kirurgi ikke kræves 35. Men inhibitorer af lymfatisk transport er ikke specifikke og faktorer, der transporteres via lymfevejene fortyndes og ændres i det systemiske kredsløb, der komplicerer sådanne vurderinger. Er også blevet beskrevet In vitro alternativer. For eksempel har Caco-2 celler eller isoleret enterocytterne kulturer blevet anvendt til at undersøge mere detaljeret intestinal sekretion af molekyler, der indføres lymfekar 36-38. En avanceret in vitro model, der er mere repræsentativ for den menneskelige tarm mikromiljø blev også for nylig beskrevet 39. I denne model en lymfatisk endothelcelle lag er co-dyrket med Caco-2 celler, som muliggør en mere detaljeret analyse af overførslen af stoffer fra tarmen ind lymfevejene. Men i vi troo cellesystemer mangler udveksling flow og overføre dvs. sammenkobling med en tarm lumen og underliggende blod og lymfe vaskulær forsyning. I en alternativ tilgang, Kassis et al. Etableret en dual-kanal (high-speed lyse-felt video og fluorescens) in situ imaging system, som gør det muligt for kvantitative sammenligninger mellem fartøj sammentrækning, lymfe flow og fluorescerende lipidkoncentrationer i mesenteriske lymfekar 33. En fordel ved denne model over den ovennævnte in vitro-systemer er, at det muliggør nøjagtig sporing af passagen af immunceller gennem lymfevejene. Absolutte målinger af masse lipid (eller narkotika) transport er dog endnu ikke etableret ved hjælp af billeddiagnostiske metoder. In vitro og in silico tilgange til specifikt forudsige omfanget af lipofile transport lægemiddel via tarm lymfevejene er også blevet offentliggjort 40-42. For eksempel ex vivo affinitet flere Compounds for plasma chylomicroner viste sig at korrelere rimeligt godt med deres lymfatisk transport in vivo 41. Efterfølgende samme gruppe etableret en in silico model til at forudsige narkotika affinitet for chylomicroner baseret på flere fysisk-kemiske egenskaber 40. Holm et al. Også etableret en forholdsvis kompliceret in silico model til direkte forudsige lymfatiske transport af lipofile forbindelser på grundlag af molekylære deskriptorer 42. Disse modeller kan tilvejebringe en nyttig fremgangsmåde til at forudsige graden af lymfatiske transport af ukendte lægemidler. Validering af modellerne med en bred vifte af lægemidler og på tværs af forskellige laboratorier vil dog være forpligtet til at bekræfte deres nøjagtighed og reproducerbarhed.
Kanylering af mesenteriske lymfeknuder kanalen er således fortsat det eneste middel til direkte at undersøge indholdet af lymfeknuder dræning tyndtarmen og transit på den komplekse række af faktorer (celler, proteiner,peptider, lipider, lægemidler) i lymfeknuder i en in vivo situationen. Heri beskrives en protokol for kanylering af den mesenteriske lymfeknuder kanalen og halspulsåren, der muliggør indsamling af mesenteriske lymfeknuder og systemisk blod fra bedøvede rotter. Repræsentative data viser, hvorledes modellen kan anvendes til at undersøge lipid- og lægemiddel transport fra tarmen via mesenteriske lymfesystemet. Dette efterfølges af en diskussion af problemer, der kan opstå i om modellen og fejlfinding. Når de er etableret modellen er et kraftfuldt værktøj til at undersøge intestinal lymfatisk transport.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Beskrevet i dette manuskript undersøgelser blev godkendt af den lokale dyreetik udvalg og blev gennemført i overensstemmelse med den australske og New Zealand Rådet for pasning af dyr til forskning og undervisningsvejledning. Inden der påbegyndes dyr procedure, skal du sikre, at de relevante tilladelser er opnået gennem den lokale institution / organisation. Som med alle animalske operationer, sørge for, at operationen er udført af behørigt uddannede operatører, under aseptiske betingelser, og at anæstetika, analgetika og antibiotika administreres når det er nødvendigt for at sikre en etisk og vellykket resultat.
1. Forberedelser dagen før det kirurgiske indgreb
- Fast rotter aftenen før kirurgi, hvis det kræves. Sørg for, at rotten har fri adgang til vand.
- Forbered løsninger, der skal administreres til rotten.
- Forbered en rehydreringsopløsning såsom sterilt saltvand eller Ringers opløsning.
- Forbered enæstetiske løsninger efter behov. Den bedøvende anvendt i forsøgene beskrevet her bestod af "Cocktail 1" fremstillet ved at kombinere 1,9 ml ketamin 100 mg / ml, 0,5 ml xylazin 100 mg / ml, 0,2 ml acepromazin 10 mg / ml og 2,5 ml saltvand og " Cocktail 2 "består af 1 ml ketamin 100 mg / ml og 0,1 ml acepromazin 10 mg / ml. BEMÆRK: Inhaleret isofluran eller sevofluran kan foretrækkes, da det kan tilvejebringe en kirurgisk plan anæstesi i en længere periode.
- Eventuelt fremstilling af en formulering indeholdende lægemidlet i for eksempel en lipidemulsion. Udfør passende stabilitetsundersøgelser at sikre den stabilitet af formuleringen i den periode, opbevaring og administration.
BEMÆRK: Den nøjagtige karakter af formuleringen og lægemiddel, der skal administreres, vil variere med hver undersøgelse som formål lymfatiske lægemiddel transportundersøgelser er oftest at vurdere effektiviteten af lymfatisk transport lægemiddel som en funktion af formuleringen og lægemiddel administrerede.- Den anvendes i de repræsentative eksperimenter i figur 4 og 5 her formulering fremstilles som tidligere beskrevet 43. Kort fortalt inkorporere 14 C oliesyre (2-5 uCi) og halofantrin (200 ug) i 40 mg oliesyre før dispersion i 5,6 ml af en vandig fase bestående af 5 mM natriumtaurocholat i phosphatbufret saltvand (pH 6,9).
- For formuleringer indeholdende 2-monoolein, tilsættes 7,1 mg 2-monoolein sammen med andre komponenter, til den vandige fase på samme tid som oliesyre fase indeholdende halofantrin. Forbered formuleringerne indeholdende 2-monoolein umiddelbart før administration til rotter som 2-monoolein er relativt ustabil og isomerises 1-monoolein.
- Efterfølgende emulgere formuleringerne ved ultralydbehandling i 2 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Som beskrevet tidligere 43, overvåge stabiliteten af formuleringerne ved i) Besigtigelse af emuleringonen under polariseret lys for at sikre, at emulsionen ikke er fase adskilt, ii) partikelstørrelsesanalyse umiddelbart efter fremstilling og efter dosering hjælp dynamisk lysspredning for at give en indikation af eventuelle fase ændringer og / eller separation, og iii) analyse af halofantrin koncentrationer hjælp en valideret HPLC-assay.
- Forbered antikoagulerende opløsning indeholdende 10 mg / ml EDTA i sterilt vand eller 10 IU / ml heparin i saltvand for at skylle lymfeknuder kanyle. Også forberede antikoagulerende opløsning indeholdende 2,5 til 10 IU / ml heparin i saltvand for at skylle halspulsåren kanyle.
- Forbered polyethylen kanyler til indføring i mesenteriske lymfeknuder kanal (0,8 mm OD, 0,5 mm ID), halspulsåren (0,96 mm OD, 0,58 mm ID eller 0,8 mm OD, 0,5 mm ID) og duodenum (0,96 mm OD, 0,58 mm ID )
- Skær kanyler i den ønskede længde (typisk 25-30 cm for halspulsåren og duodenal kanyle og 10 - 15 cm til lymfeknuder Cannula) og placere en affasning på spidsen af kanylerne anvendelse af en steril kirurgisk kniv (se figur 1).
BEMÆRK: Dette øger den lethed kanyleindføringsdel og reducerer forekomsten af kanylen blokering post-insertion. - Placer en J form ankerpunkt i intraduodenal kanyle ved looping en lille del af kanylen tilbage på sig selv, opvarmning med en lighter eller varmeplade og derefter tilskære (se figur 1).
- Skær kanyler i den ønskede længde (typisk 25-30 cm for halspulsåren og duodenal kanyle og 10 - 15 cm til lymfeknuder Cannula) og placere en affasning på spidsen af kanylerne anvendelse af en steril kirurgisk kniv (se figur 1).
- Fastgør lymfeknuder kanyle til en 25 G nål og sprøjte indeholdende et anti-koagulerende opløsning (fremstillet i trin 1.3). Fyld lymfeknuder kanyle med anti-koagulerende opløsning og lade opløsningen i kanylen O / N at reducere forekomsten af koageldannelse i lymfeknuder kanyle under lymfeknuder samling.
- Forbered rør til lymfeknuder og blodprøve samling. Pre-veje lymfeknuder opsamlingsrør, label rør til lymfeknuder og blodprøvetagning og tilføj antikoagulerende opløsning. Tilføj tilstrækkelig antikoagulerende solution for at opnå en slutkoncentration på 1 mg / ml EDTA i sterilt vand eller 10 - 20 IE / ml heparin i indsamlede lymfe eller blod.
2. Præparater Umiddelbart før Begyndende den kirurgiske procedure
- Kontroller alle kanyler ved skylning med sterilt saltvand eller antikoagulerende løsning for at sikre, at de er patent.
- Forbered rotten for den kirurgiske procedure.
BEMÆRK: mesenterielymfeknuderne kanalen er mere synlige i rotter, der har spist eller er blevet administreret en dosis af olie som den mesenteriske lymfeknuder bliver mælkeagtig og uigennemsigtig med højere lipid belastning. Nogle operatører, navnlig de nye til operationen, derfor har lettere ved at kanyle den mesenteriske lymfeknuder kanalen når rotter er præ-doseret med en olie (omkring 0,1-1 ml) såsom olivenolie eller sojaolie 0,5-2 timer før påbegyndelse af operation . Men præ-dosering olie påvirker lymfatiske transport af lipider, lipofile lægemidler og andre faktorer i lymfeknuder, således at det ikke kan være ideel til at pre-dosis olieafhængigt af formålet med eksperimentet.- Bedøver rotten hele kirurgi og prøveindsamling periode.
- For eksempel indlede anæstesi via subkutan injektion af 1,5 ml / kg af Cocktail I (fra trin 1.2.2) i en hudfold på bagsiden af rotter hals ved hjælp af en 1 ml sprøjte fastgjort til en 25 G nål. Oprethold anæstesi via intraperitoneal injektion af 0,44 ml / kg Cocktail 2 (fra trin 1.2.2) omtrent hver time efter behov, ved hjælp af en 1 ml sprøjte fastgjort til en 25 G nål.
- Forud for påbegyndelse af operationen sikrer, at dybden af bedøvelse er tilstrækkelig ved at observere respirationsfrekvens, whisker bevægelse, muskeltonus og reaktioner på stimuli, såsom klemning af foden. Administrer yderligere anæstesi efter behov.
- Barber pelsen fra de kirurgiske områder, herunder i højre side af maven til lymfeknuder og duodenum kanylering, og hals og venstre kravebenet region for halspulsåren kanyletion.
- Rengør kirurgiske områder aseptisk ved hjælp povidin-jodopløsning eller klorhexidin-opløsning og en 70% ethanol krat. Gentag dette 3 gange for hver region, afsluttende med en endelig rengøring med 70% ethanol.
- Bedøver rotten hele kirurgi og prøveindsamling periode.
- Placer dyret i dorsale recumbence på et nyt stykke over en opvarmet kirurgisk pad (37 ° C).
3. Kanylering af mesenterielymfeknuderne Duct
- Placer dyret med sin højre side vender mod brugeren. Udføre operationen med eller uden hjælp af et kirurgisk mikroskop efter behov.
- Åbn det øverste lag af den abdominale muskel væg med en lige 4 cm indsnit strækker sig fra midterlinjen (Xyphoid proces) til højre flanke ca. 2 cm under brystkassen (ribbenskurvaturen) under anvendelse af en steril skalpel (se figur 2B).
- Åbn de resterende lag af den abdominale muskel væg 4-5 mm lateralt for midterlinien til højre flanke med en lille parkirurgiske sakse (se figur 2B).
- Træk tyndtarmen under venstre mavemuskel væg og holde det på plads ved hjælp af 2 - 3 stykker steril gaze mættet med normalt saltvand.
- Bridge rotter over en 10 ml plastsprøjte placeret vandret under rottens tilbage på niveauet af højre nyre at lette visualiseringen af mesenteriske lymfeknuder kanalen.
- Find den øvre mesenteriske lymfeknuder kanal: et fartøj ca. 0,5 mm - 1 mm i diameter, som er vinkelret på den højre nyre og umiddelbart rostralt og parallelt med mesenteriske arterie (en pulserende mørkerød blodkar, se figur 2C).
BEMÆRK: I ikke-fastende eller olie pre-doserede rotter fartøjet er hvide, uigennemsigtige og nemmere at visualisere end hos fastende rotter, hvor det er helt gennemsigtig. - Undersøg området umiddelbart caudale til den store øvre mesenteriske lymfeknuder kanal og mesenterialarterie at afgøre, om en anden, mindre tilbehør lymfeknuder kanalen erstede. Hvis foreliggende, blokere for strømmen af lymfeknuder gennem kanalen ved overskæring af kanalen og tilstoppe med superlim eller binde en sutur omkring kanalen, for at sikre, at hele mængden af lymfeknuder, der strømmer fra tarmen er indsamlet fra den øvre mesenteriske lymfeknuder kanalen.
- Pass et par lige pincet gennem peri-renal fedt bed ved den nedre kant af højre nyre og gennem bindevæv lag umiddelbart under vena cava, i en retning parallelt med den øvre mesenteriske lymfeknuder kanalen.
- Med spidsen af tangen tage fat i lymfeknuder kanyle og trække det gennem peri-nyrefedtet seng med den ene ende umiddelbart støder op til mesenteriske lymfeknuder kanalen, og den anden exteriorised fra dyret på niveau med den højre nyre.
- Isoler mesenteriske lymfeknuder kanalen fra overliggende lag af binde- og fedtvæv ved stump dissektion. Pas på ikke at punkteres eller beskadige lymfe kanal.
- Efter isolering af lymfeknuder kanal, lave en lille hole i lymfen kanal med enten mikro-saks, den skarpe spids af guldsmedens tang eller en 25 G nål. Pas på ikke at helt skille skibet.
- Sørg for at lymfeknuder kanylen er helt fyldt med antikoagulerende opløsning (ved hjælp af en sprøjte og 25 G nål) uden luftspalter. Sæt lymfeknuder kanyle ca 2 - 4 mm inden den mesenteriske lymfeknuder kanalen via det lille hul ved hjælp af en lille pincet.
- Overhold lymfeknuder kanyle i et par minutter. Observere en gradvis strøm af intestinal lymfeknuder fra den frie indsamling ende af kanylen, hvis kanylering er vellykket. Hvis kanylering ikke lykkes, skal du gentage trin 3,8-3,12.
- Hvis kanylering lykkes, fastgøre kanylen ved at placere en lille dråbe veterinær klæbemiddel over indgangen hul i lymfeknuder kanalen. Pas på ikke at okkludere skibet via anvendelsen af overskydende veterinære lim.
- Samtidig venter den veterinære lim til at indstille, observe strømmen af lymfeknuder i flere minutter for at sikre, at kanylering procedure var vellykket. Når visse af succes kanylering, fjerne gaze stykker, der var placeret i bughulen omhyggeligt og placere tyndtarmen på sin oprindelige plads.
- Placer en lymfe opsamlingsrør indeholdende anti-koagulationsmiddel (se trin 1.6) ved den ende af kanylen til at indsamle de fritflydende lymfe.
- Dernæst kanyle duodenum til infusion af rehydrering løsninger og / eller formuleringer.
4. Kanylering af duodenum
- Fastgør duodenum kanyle til en sprøjte (f.eks 10 ml) fyldt med rehydreringsopløsning.
- Identificer duodenum som den lyserøde (med flere blodkar) afsnit af tyndtarmen, der ved blid nedadgående trække afslører maven.
- Lav et lille punktering hul i duodenum ca. 2 cm under krydset i maven og duodenum (pylorus) ved hjælp afen steril 23 G nål.
- Sæt J formede hooked ende af den duodenale kanyle gennem punktering hul. Sikker på plads med en dråbe cyanoacrylatlim.
- Begynd hydratisering af rotte ved at fastgøre kanylen til rehydrering sprøjte fyldt i en infusionspumpe. Ifølge litteraturen rehydrering satser spænder fra 0,5 til 3 ml / time 15,25.
- Efter afslutning af lymfeknuder og duodenum kanylering lukke snit i den abdominale muskel væg med suturer. Derefter lukkes huden indsnit ved at anvende et par dråber væv klæbemiddel (cyanoacrylat) langs siden af snittet og klemme huden på begge sider af snittet sammen.
5. Kanylering af halspulsåren
Halspulsåren kanylering kan udføres før eller efter kanylering af mesenteriske lymfeknuder kanalen. Nogle operatører foretrækker at kanyle halspulsåren før kanylering lymfeknuder kanalen for således at reducere potentielt dislodging lymfeknuder kanylen, når du flytter dyret.
- Et mærke på halspulsåren kanyle 2,5 cm fra den koniske spids for at identificere den del af slangen til at indsætte ind i arterien. Forbind den anden ende af kanylen (dvs. uden facet) til en 23 eller 25 G nål fastgjort til en sprøjte fyldt med anti-koagulerende opløsning og fyld kanylen med antikoagulerende opløsning at sikre ingen luftspalter er til stede.
- For at lette kanylering, placere den bedøvede rotte liggende på ryggen med halsen strakt og hoved peger mod brugeren. Bemærk, at nogle operatører foretrækker at udføre denne teknik med rottens hale peger mod operatøren.
- Placer en 1 - 1,5 cm længdesnit gennem huden lag over venstre for luftrøret i sagittalplanet.
- Dissekere det subkutane bindevæv hjælp stump spids pincet til at afsløre de underliggende parrede nakkemusklerne.
- Træk nakkemusklerne to afsløre venstre carotidarterie (placeret ~ 1 cm under hudoverfladen og pulserende). Rengør overliggende bindevæv fra arterien ved stump dissektion.
- Isoler en ~ 1 cm sektion af arterien forsigtigt med stumpe væv pincet, pas på ikke at beskadige tilstødende vagusnerven spor. Udfør dette ved at åbne og lukke stump spids pincet lodret langs begge sider af arterien for at frigøre det fra det omgivende væv og vagus nerve.
- Brug fin spids pincet, tråd to silkesuturer under halspulsåren og placere dem i hver ende af den isolerede arterie sektion. Bind off suturen tættest på operatøren og længst fra rat hjerte og kravebenet (figur 3A).
- Okkludere blodstrømmen gennem arterien ved at placere et par lige fin spids pincet under arterien (figur 3B).
- Brug af fine spids iris saks, placere et lille snit på den øverste overflade af arterien (ca. 1/3 afvejen ned fra toppen af det isolerede område). Skyl spildt blod på overfladen af arterien med hepariniseret saltvand og tør forsigtigt ved hjælp af bomuld tips.
- Sæt spidsen af kanylen ind i arterien med et par af buede spids pincet. Når indsat, fjernes lige fin spids tang okkludere blodstrømmen og fremme kanylen 2,5 cm ind i arterien under anvendelse af to par tænger, en til at holde kanylen inde i arterien for at forhindre blod i at lække tilbage, og den anden for at indsætte kanylen.
- Brug en lille arterie klemme til at holde kanylen inde i arterien og fjern de lige fin spids pincet, der var placeret under arterien i trin 5.8 for at okkludere blodstrømmen.
- Bekræft åbenheden af kanylen ved at injicere anti-koagulerende opløsning i kanylen og trække tilbage en lille mængde blod (figur 3C). Derefter skylle kanylen med antikoagulerende opløsning og forsegle enden ved hjælp af flammen fra en lighter eller en kanyle stik.
- Bind the kanyle på plads med de to suturer placeret under arterien i trin 5.8.
- Fjern arterie klemme og sikre en tredje sutur omkring arterien og kanyle. Luk halsen viklet med suturer.
6. Post-kirurgisk Periode og formulering Infusion
- Fortsæt med at opretholde rotte under anæstesi og på den opvarmede pad.
- Rehydrere rotte via infusion af rehydreringsopløsning i duodenum mindst 0,5 timer efter afslutningen af de kanyleringerne. Overhold lymfeknuder flow fald (~ 0,1-0,5 ml / time) i den indledende periode efter kanylering og snart stige til en stabil baseline (0,4-2,5 ml / time afhængig af rehydrering sats).
- Efter tilbagebetalingsperioden, indgyde formuleringen af interesse (indeholdende lipider, narkotika mv) ind i duodenum via kanyle. Eventuelt bruge en infusionspumpe til at regulere strømningshastigheden af formuleringen. BEMÆRK: I protokollen beskrevet her dyrene forbliver anaesthetised hele operationen og lymfe indsamling periode og aflivet under bedøvelse, således at yderligere analgesi ikke er påkrævet. Hvis protokollen ændres, og dyrene får mulighed for at genvinde bevidstheden så passende analgesi og postoperativ pleje vil være påkrævet.
- Ved afslutningen af formuleringen infusion fortsat rehydrere rotte med en hastighed på 1,5-3 ml / time med normalt saltvand i duodenum for at forhindre dehydrering.
- Fortsæt med at holde rotten på 37˚C opvarmede kirurgiske pad til at opretholde temperaturen (som pr trin 2.3), udtrykkelig urin fra blæren via blide nedadgående tryk på den nederste del af maven efter behov og genanvende oftalmologiske salve hver time (som pr trin 2.2. 3). Regelmæssige kropsstilling ændringer anbefales, hvis dyret er at genvinde bevidstheden efter indgrebet.
7. Indsamling af lymfeknuder og blodprøver for at vurdere Lipid and Drug Absorption
- Saml lymfeknuder kontinuerligt indrør indeholdende anti-koagulant. Skift rør på de krævede tidsintervaller (fx hver time).
- Saml blodprøver på indstillede tidspunkter.
- Okkludere blodstrømmen gennem kanylen ved at bøje kanylen tilbage ca. 2 cm fra den forseglede ende. Bryde forseglingen kanylen ved at afskære den forseglede ende eller fjerne kanylen stik.
- Ved hjælp af en tom sprøjte, trække hepariniseret saltvand fra kanylen, indtil blodet fylder hele kanyle.
- Ved hjælp af en ny tom sprøjte, trække den ønskede mængde blod og sted i et rør indeholdende antikoagulerende.
- Brug den første sprøjte, udskifte blodet taget før prøvetagning for at reducere unødvendige blodtab. Før injektion, svirp sprøjten, mens du holder den opret at sikre, at ingen luftbobler ind på kanylen.
- Ved hjælp af en sprøjte, erstatte blodvolumen fjernet fra rotte med anti-koagulerende opløsning. Sørg for, at der ikke overskydende blod er synlig i kanylen som eventuelt resterende kan størkneog blokere kanylen.
- Bøj kanylen ca. 2 cm fra den uforseglede ende at blokere blodstrømmen og fjern sprøjten. Ved hjælp af flammen fra en lighter eller en kanyle stik, forsegl kanylen.
- Ved afslutningen af blod og lymfe samling fra rotte, aflive rotten via intraperitoneal administration af> 100 mg / kg natriumpentobarbiton.
- Bestem lymfe strømningshastighed ved at måle massen af lymfeknuder indsamlet under hver tidsperiode.
- Måle koncentrationen af lægemiddel og lipid i lymfe og blod ved hjælp af for eksempel HPLC, HPLC-MS, eller under anvendelse af kommercielle kits til at vurdere lipid og lægemiddelabsorption effektivitet.
- Beregn massetransport af lægemiddel og lipider i lymfeknuder fra produktet af de målte koncentrationer og volumen af lymfeknuder indsamlede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne af et repræsentativt eksperiment for at kvantificere den kumulative omfanget og hastigheden af lipid og lægemiddel transport via lymfesystemet efter intestinal levering ved hjælp af mesenteriske lymfeknuder kanylering model er vist i figur 4 og figur 5. I dette eksperiment, 200 ug af model lipofile lægemiddel halofantrin blev administreret i duodenum hos rotter i løbet af 2 timer i en formulering indeholdende 40 mg oliesyre (herunder 2-5 uCi 14C-oliesyre) og 7,1 mg 2-monoolein dispergeret i 5,6 ml 5 mM natriumtaurocholat i phosphatbufret saltvand pH 6,9. Efter formulering administration blev rotterne rehydratiseres ved en hastighed på 2,8 ml / time med normalt saltvand infunderet i duodenum. Lymfeknuder blev opsamlet kontinuerligt i rør ændres hver time i 10 timer. Formuleringen blev fremstillet, og forsøget udføres ifølge en protokol beskrevet tidligere for en formulering indeholdende alle de samme komponenter såsoments undtagen det ikke omfatter 2-monoolein 43.
Som vist i figur 4, i disse eksperimentelle betingelser gennemsnitlige lymfe strømningshastighed held kanylerede rotter var mellem 0,4 til 1,3 ml / time. I nogle rotter lymfeknuder flow var lidt lavere i den første 1 - 3 ud HR efter kanylering og steg derefter. Dette er almindeligvis ses efter lymfeknuder kanyle. Også vist i figur 4 er lymfeknuder strømningshastighed et mislykket forsøg. I dette tilfælde strømningshastigheden forblev væsentligt lavere end den, der ses i de vellykkede forsøg i indsamlingsperioden. Tilsvarende kumulative lymfatiske transport af triglycerid og halofantrin var væsentligt lavere i den tabende eksperiment (figur 5A og B). Den gennemsnitlige kumulative halofantrin transport i den vellykkede gruppe var 15,1% af dosis, transport kumulative triglycerid var 61 mg over 10 timer, og den andel af den indgivne radiolabelled exogen lipid dosis transporteres i lymfeknuder var 54% (figur 5C). Disse værdier er ikke signifikant anderledes end set tidligere for en lignende formulering, der indeholdt de samme komponenter bortset fra fraværet af 2-monoolein 43 (tabel 1). Dette antyder, at formuleringer indeholdende fedtsyrer i mangel af en kilde til monoglycerid kan understøtte lignende lipid og narkotika transport i lymfeknuder til dem, der gør indeholde monoglycerid. Dette resultat er yderligere beskrevet i diskussionen sektion.
Figur 5D viser repræsentative data for antallet af halofantrin og triglycerid transport i lymfeknuder over tid efter administration. Transporten på både triglycerid og lægemiddel i lymfeknuder toppe et par timer efter lipid and Drug Administration og vender derefter tilbage til baseline niveau. Som det er typisk i tarm lymfe lipid og narkotika transport eksperimenter, satsen for narkotika transport i lymfeknuder under hver tidsperiode spejle, der er set for triglycerid transport som lægemiddel transporteres i lymfeknuder i forbindelse med de triglycerid-rige lipoproteiner.
Figur 1. Skematisk repræsentation af formen af den affasede spids af en halspulsåre eller lymfe kanyle, og J-formede affaset spids af en duodenal kanyle.
Figur 2. Fotografier af (A) maven barberet som forberedelse til kanyle lymfeknuder kanalen, (B) den mavemuskel væg åbnes med en lige 4 cm snit strækker sig fra midterlinjen til højre flanke for at få adgang lymfeknuder kanalen, og (C ) den overlegne mesenterielymfeknuderne kanal (i gul cirkel) vinkelret på højre nyre. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Fotografier af (A) halspulsåren isoleret med to silkesuturer med den tættest på operatøren hæftes, (B) halspulsåren isoleret og blodgennemstrømningen okkluderet med et par lige fin spids pincet placeret under arterien, og (C) en halspulsåre med kanyle på plads, og den åbenhed, der kontrolleres ved at trække tilbage en lille mængde blod. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4 "src =" / files / ftp_upload / 52389 / 52389fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Repræsentative data for mesenteriske lymfeknuder strømningshastighed (pl / hr) over tid. Rotter blev administreret en formulering indeholdende 200 ug halofantrin, 40 mg oliesyre (med 2 uCi 14C-oliesyre) og 7,1 mg 2-monoolein i 5,6 ml 5 mM natriumtaurocholat i phosphatbufret saltvand (pH 6,9) 0-2 timer. De viste data er gennemsnittet ± SEM for n = 3 vellykkede eksperimenter (lukkede cirkler, ●) og n = 1 mislykket udfald (åbne trekanter, Δ).
Figur 5. Repræsentative data for lipid og narkotika transport ind mesenterisk lymfeknuder. Kumulativ transport af (A) den model, drug halofantrin (Hf,% dosis), (B) triglycerid (TG, mg) og (C) exogen fedtsyre (% dose), og hastigheden for transport af (D) TG (mg / time) og Hf (% dosis / time) ind i mesenteriske lymfeknuder over tid efter administration af en formulering indeholdende 200 ug halofantrin, 40 mg oliesyre (med 2 uCi 14 C-oleinsyre) og 7,1 mg 2-monoolein i 5,6 ml 5 mM natriumtaurocholat i phosphatbufret saltvand (pH 6,9) 0-2 timer. De viste data er gennemsnittet ± SEM for n = 4 vellykkede eksperimenter (lukkede cirkler, ●) og n = 1 mislykket udfald (åbne trekanter, Δ). Exogenous fedtsyre transport blev ikke målt i den tabende eksperiment, men er typisk lavt mislykkede eksperimenter. Data for den tabende eksperiment udelades fra Panel D for klarhed. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Uden monoolein | Med 2-monolein | |||
| Mean | SEM | Mean | SEM | |
| Halofantrin (% dosis) | 15.1 | 0,8 | 15 | 1.6 |
| Triglycerid (mg) | 67 | 4 | 61 | 6 |
| Total fedtsyre (pmol) | 261 | 16 | 248 | 23 |
| Eksogene oliesyre (pmol) | 82 | 5 | 65 | 6 |
| Endogen fedtsyre (pmol) | 180 | 17 | 183 | 28 |
Tabel 1. Sammenligning af kumulative lymfatisk transport data over 10 timer efter administration af 200 ug halofantrin at mesenterielymfeknuderne kanal cannulated rotter i formuleringer, der indeholder 40 mg oliesyre (containing 1 uCi 14C-oliesyre) emulgeret i 5 mM natriumtaurocholat i phosphatbufret saltvand (pH 6,9) med og uden 7,1 mg 2-monoolein. Dataene repræsenterer middelværdi ± SEM for n = 4 rotter. Ingen statistisk ses signifikante forskelle mellem de 2 grupper.
a I gruppen doseret med 2-monoolein dette ikke er et nøjagtigt mål for endogen fedtsyre transport som oliesyre bundet til 2-monoolein rygrad ikke medregnes i den målte exogene oliesyre transport i lymfeknuder.
b Data for halofantrin og total fedtsyre transport i gruppen doseret uden 2-monoolein er tidligere blevet udgivet i figur 5 i henvisning 43 og er gengivet her i tabel format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rotten mesenterielymfeknuderne kanylering model muliggør direkte kvantificering af koncentration og transport af forskellige celler og molekyler (såsom lipider og lægemidler) fra tarmen ind i lymfeknuder og ændringer heri, der opstår som reaktion på udfordringen med forskellige stoffer (kost antigen, narkotika, formuleringer, etc.) 10,27 og sygdom (cancer, virus, colitis, insulinresistens, etc.) 5-7. Komponenterne, der indsamles i lymfeknuder kan også blive yderligere anvendes i yderligere forsøg. For eksempel kan celler dyrkes 44, lipoproteiner fraktioneres og lymfe eller dets komponenter, såsom lipoproteiner eller celler, lastet med markører, herunder lægemidler, radioaktive og fluorescerende prober. Disse kan så igen infunderes i recipientdyr til mere direkte at evaluere deres funktion, stofskifte, clearance og / eller væv disposition mønstre 45-47. Rotten lymfeknuder kanylering model har flere fordele i forhold til othis in vitro, in situ, in silico, og in vivo-modeller, der blev beskrevet i indledningen. Vigtigst kanylering er den eneste metode, der giver direkte adgang til hele mængden af komponenter i lymfe væske. Når der udføres i hænderne på en erfaren operatør modellen er robust, reproducerbare og eksperimentelle succesrater på> 80% kan opnås. Imidlertid kan den kirurgiske teknik være vanskeligt at oprindeligt mestre, især i et laboratorium, der ikke er bekendt med teknikken.
Flere trin er afgørende for succes i mesenteriske lymfeknuder kanylering model. Den første er det korrekte valg af kirurgiske instrumenter og kanylen type og forberedelse. Vores lab bruger PE kanyler med dimensioner OD 0,8 x ID 0,5 mm. Imidlertid har andre laboratorier haft succes med PVC kanyler af samme dimension 15. Affasning af spidsen af kanylen og iblødsætning det i en antikoagulerende hjælper også til at forhindreokklusion af, og dannelsen af blodpropper i kanylen efter indføring (trin 3.13). Det første trin i den kirurgiske procedure, at nogle operatører finde særlig kritisk tager sig til at rense de lag af binde- og fedtvæv over lymfeknuder kanal (trin 3.10). Dette hjælper til at undgå indføring af kanylen mellem væv og lymfe kanal i stedet for til lymfeknuder kanalen. Imidlertid er denne rengøring trin vanskeligt som lymfeknuder kanalen er skrøbelig og let at skade. For nogle er dette skridt, og indsættelsen af kanylen mest gennemført ved hjælp af en kirurgisk mikroskop, mens andre finder et mikroskop er ikke nødvendig. Ved indsættelse af kanylen ind i kanalen retningen og dybden af indføring i forhold til den affasede spids kræver nogle overvejelser for at forhindre kanylen bliver okkluderet af karvæggen (trin 3.12). Hver operatør har tendens til at finde deres egen individuelle præferencer. Også vigtigt, er at undgå luftboble dannelse inden for cannula under indføring som luftspalter gælder modtryk for den frie strøm af lymfeknuder (trin 3.12). Endelig bør anvendelsen af veterinære klæbemiddel til at fastgøre kanylen i stedet være under punktet for indsættelse i kanalen som klæbemiddel placeret direkte på toppen af kanalen kan forårsage fartøjet til at kollapse og okkludere kanylespidsen (trin 3.14).
Den nemmeste indledende guide, om en operation er vellykket, er strømningshastigheden af lymfe. Når kanylen er på plads lymfeknuder generelt begynder at strømme langsomt i de første 30 minutter og derefter øges. Typisk strømningshastigheder for vellykkede kanyleringerne i rotter> 250 g er> 0,1 ml / time i den første time og derefter stige til> 0,4 ml / time ved steady state som vist i figur 4. Selv om naturligvis kan variere afhængigt af den . forsøgsbetingelse Med hensyn til fejlfinding, hvis der ikke lymfeknuder strømmer gennem kanylen eller strømningshastigheden er lav kan det skyldes:
- kanylen blev ikke sat korrekt ind i kanalen
- kanylen er i kanalen, men okkluderet ved siden af karvæggen
- kanylen er i kanalen, men okkluderet af klæbemiddel påført i forkert position
- kanylen er i kanalen og en luftboble i kanylen er aftagende strømmen
- et koagel er dannet inden i kanylen
Omhyggelig inspektion normalt afslører den underliggende faktor. Hvis operatøren mener kanylen ikke placeret korrekt i første omgang (dvs. lymfeknuder aldrig flyder) derefter igen tilføjelse nødvendig. Hvis kanylen synes at være i det rigtige sted, så den første faktor for at kontrollere, om en luftboble eller størkne til stede. Luftbobler vil generelt passere gennem kanylen som lymfeknuder strømme og midlertidigt langsom flow. Det er undertiden muligt at fjerne luftbobler eller blodpropper ved at trække tilbage på kanylen ved hjælp af en 25 G nål fastgjort til for eksempel en 1 ml sprøjte. Hvis der ikke er luftbobler eller blodprop kan det være nyttigt at prøve at placere rotte og / eller dreje eller trække lidt kanylen. Dette kan nogle gange justere kanylen, således at det ikke er blokeret mod karvæggen. Lejlighedsvis fjerne klæbemidlet med eller uden lille bevægelse af kanylen muliggør lymfen til at flyde igen også. Hvis alt andet mislykkes kanylen skal dog genindsættes. I vores erfaring eksperimenter er mindre vellykket, når kanylen ikke er sat korrekt på det første forsøg. Men kirurgisk redning er mulig. En anden komplikation, der kan opstå, er vanskeligheden ved kanylering grund anatomiske varians mellem rotter. For eksempel mesenteriske lymfeknuder kanalen lejlighedsvis passerer i en akavet retning, eller der er et tilbehør lymfeknuder kanal på den modsatte side af mesenteriske arterie til den større øvre mesenteriske lymfeknuder kanalen. I eksperimenter, der kræver samling af hele mængden af lymfeknuder, der strømmer fra tyndtarmen (som det er tilfældetved vurderingen total lipid og lægemiddel transport fra tarmen via lymfevejene), skal okkluderes, således at al lymfeknuder er rettet mod den overlegne lymfeknuder kanalen tilbehøret lymfeknuder kanalen. Dette er vanskeligt at opnå, men kan forsøges ved at binde en sutur omkring tilbehøret kanal eller overskæring tilbehøret kanal og okkluderer det med veterinær klæbemiddel (trin 3.6). Tilstedeværelsen af et tilbehør lymfeknuder kanalen er en af de vigtigste faktorer, der resulterer i eksperimentel fejl i lymfe lægemiddeltransport eksperimenter. Hvis tilbehøret fartøj ikke er helt okkluderet, lymfe flow og lipid og narkotika transport er væsentligt lavere end forventet.
I den protokol, der præsenteres her dyret forbliver bedøvet hele lymfeknuder opsamlingsperiode. Den bedøvede rotte model (snarere end bevidste modeller beskrevet nedenfor) øger eksperimentelle gennemløb kirurgi og eksperimentet kan udføres over en snarere end flere dage, og det kirurgiske succes rspiste er større, som det er lettere at fastholde kanylen åbenhed i immobiliserede dyr. Anæstesi kan teoretisk reducere ventrikeltømning, intestinal lipid forarbejdning og lymfe flow og transport. Det er vores erfaring, dog lymfe lipid og narkotika transport er ens i bedøvede rotter administreret lægemidlet direkte ind i tolvfingertarmen (til bypass mave tømning) efter forud fordøjet og præ-spredte køretøjer (f.eks, fedtsyre og monoglycerid micellare systemer spredt med overfladeaktive stoffer ) sammenlignet med rotter ved bevidsthed administreret lægemidlet via oral gavage i maven i et tilsvarende triglycerid 21,23,27. Faktisk har de fleste af intestinale lymfatiske lægemiddel transport eksperimenter i vores laboratorium i de sidste 10 år blevet udført i bedøvede model på grund af den højere kapacitet, der kan opnås. I disse forsøg har vi oftest administrerede lægemidler i formuleringer indeholdende fedtsyre (fx oliesyre) og overfladeaktivt 43.Fedtsyrer syntetiseres i triglycerider før inkorporering i intestinale lymfeknuder lipoproteiner og dette kræver en kilde til komponenter til dannelse af glycerol rygraden i triglycerid (dvs. 2-monoglycerid eller glycerol-3-phosphat). Dette antyder, at administration af fedtsyrer i mangel af en glycerol kilde kan føre til reduceret lymfatisk transport. Administration af fedtsyre, gør det imidlertid direkte beregning af bidraget fra den exogene administreret fedtsyre og endogene lipider til lymfe lipid og narkotika transport 43. Derudover 2-monoglycerid er dyrt og generelt ustabile, som det let isomerises 1-monoglycerid som fordøjes til glycerol i tarmens lumen. I de undersøgelser rapporteret her vi yderligere vise, at lymfe lipid og lægemiddel transport svarer efter administration af modellen lægemiddel halofantrin med en fedtsyre (fx oliesyre) og overfladeaktivt middel (galdesalt) formulering i enten PResence eller fraværet af glycerol kilde 2-monoolein (tabel 1). Endogene kilder af glycerol synes således tilstrækkelig til at understøtte tilsvarende lymfe flow og lipid og transport lægemiddel efter administration af denne model lægemiddel med fedtsyrer (f.eks oliesyre) i fravær af en glycerol kilde. Dette giver tillid til, at repræsentative lymfe transport data kan opnås med enkle fedtsyre formuleringer.
Den bedøvede model let udvides til en bevidst model, når det kræves. I den bevidste modeller formuleringer kan tvangsfodret direkte ind i maven eller infunderes i duodenum eller intravenøst, kan direkte sammenligninger foretages farmakokinetiske undersøgelser i ikke-lymfeknuder kanyleret bevidste dyr og resultaterne kan betragtes som mere fysiologisk relevant. Jo længere tid frist ved bevidsthed dyr har også den fordel, at indsamlingen af mere komplette farmakokinetiske profiler til drug koncentrationer i blodet, mens det i bedøvede eksperimenter, blod profiler ofte ufuldstændige, specielt for lange halveringstid lægemidler. Som beskrevet ovenfor, dog succesraten for bevidste lymfeknuder kanyleret undersøgelser er lavere og eksperimenter tager længere tid at fuldføre. Der er to typer af bevidste lymfeknuder kanylering modeller er beskrevet i litteraturen. I bevidste behersket modeller 15, efter lymfeknuder kanylering kirurgi er dyr simpelthen vendt på sin forreste og anbringes i en passende begrænsning for den resterende del af forsøget med lymfeknuder kanylen eksternaliseret og indsat i et opsamlingsrør. Dyret får derefter lov til at genvinde bevidstheden og komme sig efter den kirurgiske procedure O / N. Succesraten med denne model er meget godt i hænderne på erfarne operatører, men det kan være vanskeligt at opnå etik clearance at begrænse dyr for længere tid er nødvendig for lymfeknuder samling. En alternativ model er hvor lymfeknuder opsamlesfra bevidste og frit bevægelige rotter. Denne model er blevet beskrevet tidligere 25. I denne model lange kanyler indsættes i mesenteriske lymfeknuder kanalen, duodenum og halspulsåren. Kanylerne derefter tunneleres under huden, blotlagt ved bagsiden af halsen og anbringes gennem en drejelig system. Rotten er placeret i en sele knyttet til dreje og fik lov til at genvinde bevidstheden og at komme sig efter den kirurgiske procedure O / N. Dyret har kan afhentes fri bevægelighed inden en metabolisk bur og lymfeknuder og blodprøver fra kanyler eksternaliserede udenfor buret.
Mesenterielymfeknuderne kanylering er det eneste værktøj, der gør det muligt direkte vurdering af lymfeknuder komponenter i deres spirende tilstand. Lymfeknuder kanylering er oftest beskrevet i rotter som operationen er mindre kompleks end mindre og store dyr, modellen billigere end store dyr og resultater vises rimeligt sammenlignelige på tværs af arter 27. Rotten tilstandJeg kan modificeres efter eksperimentel behov og succesraten er høj i hænderne på erfarne operatører. Modellen kan også kobles med andre in vitro eller in vivo-forsøg for at undersøge, i detaljer, stofskiftet eller funktionen af tarm lymfeknuder komponenter. Når etableret mesenteriske lymfeknuder kanyleret rottemodel er således et kraftfuldt værktøj til at vurdere koncentrationen, transport, funktion og metabolisme af forskellige parametre, der passerer direkte fra tarmen til lymfesystemet (og i mange tilfælde strømmer til sidst til den systemiske cirkulation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile saline | Baxter healthcare | AHB 1307 | Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50 |
| 70 % ethanol in water | Any | Any brand can be used | |
| Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) | Livingstone International | JJ60243L | Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L |
| Betadine solution | Livingstone International | BU0510 | Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510 |
| Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) | PROVET VICTORIA | KETA I 1 | http://www.provet.com.au/ |
| Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) | PROVET VICTORIA | TRO-3828 | http://www.provet.com.au/ |
| ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) | PROVET VICTORIA | VTG-DACP010020 | http://www.provet.com.au/ |
| Sodium pentobarbitone | PROVET VICTORIA | 24529 | Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au |
| Heparin (35000I.U. in 35 mL) | Sigma Pharmaceuticals | 337220 | http://sigmaco.com.au/ |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E1644 | Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. |
| Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm | Microtube extensions | PE8050 | Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m |
| Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm | Microtube extensions | PE9658 | Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m |
| Ruler | Any | Any brand can be used | |
| Markers | Any | Any brand can be used | |
| Cigarette lighter | Any | Any brand can be used | |
| Veterinary adhesive | Any | Any brand can be used | |
| 23 gauge needles | Livingstone International | DN23GX0.75LV | Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6&search=DN23GX0.75LV |
| 25 gauge needles | Livingstone International | DN25GX1.0LV | Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV |
| 1 ml syringe | Livingstone International | T3SS01TA | Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA |
| 10 ml syringe | Livingstone International | T3SS10SA | Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA |
| Gauze swabs | Livingstone International | GSC075 | Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075 |
| Cotton buds | Livingstone International | CTAST075DP | Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP |
| Heating pad | Ratek | WT1 | Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray. |
| Surgical light | Harvard Apparatus | 72-0215 with 72-0267 | Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail and http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___ |
| Surgical microscope | Zeiss | 495005-0014-000 | Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143 |
| Silk suture | Livingstone International | DTSK163019F4 | Any brand can be used. Example here is 3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4 |
| Scalpel blades | Fine Science Tools (FST) | 10020-00 | Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191 |
| Scalpel handle | Fine Science Tools (FST) | 10004-13 | Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51 |
| 1 x Small surgical scissors | Fine Science Tools (FST) | 14060-09 | Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17 |
| 2 x Forceps with serrated curved tip | Fine Science Tools (FST) | 11001-13 | Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32 |
| 1 x Iridectomy scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-08 | Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 |
| 1 x Forceps with straight serated tip | Fine Science Tools (FST) | 11650-10 | Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32 |
| 1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip | Fine Science Tools (FST) | 11251-10 | Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29 |
| 1 x Forceps with smooth fine curved forceps | Fine Science Tools (FST) | 11063-07 | Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360 |
| 2 x Hemostats | Fine Science Tools (FST) | 13010-12 | Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33 |
| 1 x Suture needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12001-13 | Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70 |
| 1 x Artery clamp | Fine Science Tools (FST) | 18050-28 | Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82 |
| Oleic acid | Sigma Aldrich | O1008 | When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en®ion=AU |
| 14C-oleic acid | Perkin | NEC317050UC | Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC |
| Sodium taurocholate | Sigma Aldrich | T4009 | Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en®ion=AU |
| Halofantrine | Glaxo Smith Kline | Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71507 | Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en®ion=AU |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | 71643 | Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en®ion=AU |
References
- Barrowman, J. A., Tso, P. Gastrointestinal lymphatics. Comprehensive Physiology. , 1733-1777 (2010).
- Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
- Mossel, E. C., Ramig, R. F. A lymphatic mechanism of rotavirus extraintestinal spread in the neonatal mouse. J Virol. 77 (22), 12352-12356 (2003).
- Pantaleo, G., et al. Hiv-Infection Is Active and Progressive in Lymphoid-Tissue during the Clinically Latent Stage of Disease. Nature. 362 (6418), 355-358 (1993).
- Chakraborty, S., Zawieja, S., Wang, W., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, R94-R102 (2010).
- Dixon, J. B. Lymphatic lipid transport: sewer or subway. Trends Endocrinol Metab. 21 (8), 480-487 (2010).
- Weid, P. -Y., Rehal, S., Ferraz, J. G. Role of the lymphatic system in the pathogenesis of Crohn's disease. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (4), 335-341 (2011).
- Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PloS one. 4 (12), e8442 (2009).
- Ji, Y., et al. Activation of rat intestinal mucosal mast cells by fat absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1292-G1300 (2012).
- Kohan, A., Yoder, S., Tso, P. Lymphatics in intestinal transport of nutrients and gastrointestinal hormones. Ann N Y Acad Sci. 1207, Suppl 1. E44-E51 (2010).
- Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Targeted drug delivery to lymphocytes: a route to site-specific immunomodulation. Mol Pharm. 7 (6), 2297-2309 (2010).
- Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin Exp Immunol. 92 (2), 317-322 (1993).
- Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update. Adv Drug Deliv Rev. 60 (6), 702-716 (2008).
- Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. Am J Physiol. 261 (3 Pt 1), G530-G538 (1991).
- Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
- Porter, C. J., Trevaskis, N. L., Charman, W. N. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nat Rev Drug Discov. 6 (3), 231-248 (2007).
- Trevaskis, N. L., et al. The role of the intestinal lymphatics in the absorption of two highly lipophilic cholesterol ester transfer protein inhibitors (CP524,515 and CP532,623). Pharm Res. 27 (5), 878-893 (2010).
- Choo, E. F., et al. The Role of Lymphatic Transport on the. Systemic Bioavailability of the Bcl-2 Protein Family Inhibitors Navitoclax (ABT-263) and ABT-199. Drug Metabolism and Disposition. 42 (2), 207-212 (2014).
- Han, S., et al. Targeted delivery of a model immunomodulator to the lymphatic system: comparison of alkyl ester versus triglyceride mimetic lipid prodrug strategies. J Control Release. 177, 1-10 (2014).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. J Lab Clin Med. 33 (10), 1349-1352 (1948).
- Porter, C. J., Charman, S. A., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the triple-cannulated anesthetized rat model: effect of lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85 (4), 351-356 (1996).
- Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (2), 115-120 (2004).
- Porter, C. J., Charman, S. A., Humberstone, A. J., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the conscious rat when administered as either the free base or the hydrochloride salt: effect of lipid class and lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85 (4), 357-361 (1996).
- Caliph, S. M., Charman, W. N., Porter, C. J. Effect of short-, medium-, and long-chain fatty acid-based vehicles on the absolute oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of halofantrine and assessment of mass balance in lymph-cannulated and non-cannulated rats. J Pharm Sci. 89 (8), 1073-1084 (2000).
- Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Adv Drug Deliv Rev. 50 (1-2), 45-60 (2001).
- Noguchi, T., Charman, W. N. A., Stella, V. J. Lymphatic Appearance of Ddt in Thoracic or Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rats. International Journal of Pharmaceutics. 24 (2-3), 185-192 (1985).
- Trevaskis, N. L., et al. A mouse model to evaluate the impact of species, sex, and lipid load on lymphatic drug transport. Pharm Res. 30 (12), 3254-3270 (2013).
- Kota, J., et al. Lymphatic absorption of subcutaneously administered proteins: influence of different injection sites on the absorption of darbepoetin alfa using a sheep model. Drug Metab Dispos. 35 (12), 2211-2217 (2007).
- McHale, N. G., Adair, T. H. Reflex modulation of lymphatic pumping in sheep. Circ Res. 64 (6), 1165-1171 (1989).
- White, D. G., Story, M. J., Barnwell, S. G. An Experimental Animal-Model for Studying the Effects of a Novel Lymphatic Drug Delivery System for Propranolol. International Journal of Pharmaceutics. 69 (2), 169-174 (1991).
- Khoo, S. M., Edwards, G. A., Porter, C. J., Charman, W. N. A conscious dog model for assessing the absorption, enterocyte-based metabolism, and intestinal lymphatic transport of halofantrine. J Pharm Sci. 90 (10), 1599-1607 (2001).
- Kararli, T. T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals. Biopharm Drug Dispos. 16 (5), 351-380 (1995).
- Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. J Biomed Opt. 17 (8), 086005 (2012).
- Dahan, A., Hoffman, A. Evaluation of a chylomicron flow blocking approach to investigate the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs. Eur J Pharm Sci. 24 (4), 381-388 (2005).
- Xiao, C., Lewis, G. F. Regulation of chylomicron production in humans. Biochim Biophys Acta. 1821 (5), 736-746 (2012).
- Seeballuck, F., Ashford, M., O'Driscoll, C. The Effects of Pluronic® Block Copolymers and Cremophor EL on Intestinal Lipoprotein Processing and the Potential Link with P-Glycoprotein in Caco-2 Cells. Pharmaceutical Research. 20 (7), 1085-1092 (2003).
- Levy, E., Mehran, M., Seidman, E. Caco-2 cells as a model for intestinal lipoprotein synthesis and secretion. The FASEB Journal. 9 (8), 626-635 (1995).
- Cartwright, I. J., Higgins, J. A. Isolated rabbit enterocytes as a model cell system for investigations of chylomicron assembly and secretion. Journal of Lipid Research. 40 (7), 1357-1365 (1999).
- Dixon, J. B., Raghunathan, S., Swartz, M. A. A Tissue-Engineered Model of the Intestinal Lacteal for Evaluating Lipid Transport by Lymphatics. Biotechnology and Bioengineering. 103 (6), 1224-1235 (2009).
- Gershkovich, P., et al. The role of molecular physicochemical properties and apolipoproteins in association of drugs with triglyceride-rich lipoproteins: in-silico prediction of uptake by chylomicrons. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 61 (1), 31-39 (2009).
- Gershkovich, P., Hoffman, A. Uptake of lipophilic drugs by plasma derived isolated chylomicrons: Linear correlation with intestinal lymphatic bioavailability. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 26 (5), 394-404 (2005).
- Holm, R., Hoest, J. Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer. International Journal of Pharmaceutics. 272 (1-2), 189-193 (2004).
- Trevaskis, N. L., Porter, C. J., Charman, W. N. Bile increases intestinal lymphatic drug transport in the fasted rat. Pharm Res. 22 (11), 1863-1870 (2005).
- Miura, S., et al. Increased proliferative response of lymphocytes from intestinal lymph during long chain fatty acid absorption. Immunology. 78 (1), 142-146 (1993).
- Caliph, S. M., et al. The impact of lymphatic transport on the systemic disposition of lipophilic drugs. J Pharm Sci. 102 (7), 2395-2408 (2013).
- Caliph, S. M., Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Intravenous dosing conditions may affect systemic clearance for highly lipophilic drugs: implications for lymphatic transport and absolute bioavailability studies. J Pharm Sci. 101 (9), 3540-3546 (2012).
- Trevaskis, N. L., et al. Tissue uptake of DDT is independent of chylomicron metabolism. Arch Toxicol. 80 (4), 196-200 (2006).
