Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

المساريقي الليمفاوية القناة مقنى نموذج الفأر: بالتطبيق على تقييم المعوية اللمفاوي النقل المخدرات

Published: March 6, 2015 doi: 10.3791/52389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Drug Delivery, Disposition, and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University (Parkville Campus)

Abstract

الجهاز اللمفاوي الأمعاء تلعب دورا رئيسيا في نقل السوائل، وامتصاص الدهون وظيفة المناعة. الليمفاوية تدفقات مباشرة من الأمعاء الدقيقة عن طريق سلسلة من السفن والعقد اللمفاوية التي تلتقي في أعلى القناة الليمفاوية المساريقي. القسطرة من القناة الليمفاوية المساريقي بالتالي يمكن جمع الليمفاوية المساريقي المتدفقة من الأمعاء. يتكون الليمفاوية المساريقي من جزء الخلوي للخلايا المناعة (الخلايا الليمفاوية 99٪)، جزء مائي (سائل، والببتيدات والبروتينات مثل السيتوكينات والهرمونات القناة الهضمية)، وجزء البروتين الدهني (الدهون، وجزيئات محبة للدهون و APO-البروتينات). وبالتالي، يمكن للالمساريقي القناة الليمفاوية نموذج القسطرة أن تستخدم لقياس تركيز ومعدل نقل مجموعة من العوامل من الأمعاء عن طريق الجهاز اللمفاوي. تغييرات على هذه العوامل في استجابة للتحديات المختلفة (على سبيل المثال، والوجبات الغذائية، مستضدات، والمخدرات) ومرض (مثل مرض التهاب الأمعاء، فيروس نقص المناعة البشرية ومرض السكري) ويمكن أيضا بالبريد تحديدها. مساحة توسيع الاهتمام هو دور النقل اللمفاوي في امتصاص الأدوية وطلائع الأدوية محبة للدهون عن طريق الفم التي تربط مع المعوية مسارات امتصاص الدهون. نحن هنا وصف بالتفصيل، وهو المساريقي القناة الليمفاوية نموذج الفئران مقنى التي تمكن تقييم معدل ومدى الدهون ونقل المخدرات عبر الجهاز اللمفاوي لعدة ساعات بعد الولادة الأمعاء. هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة لقياس غيرها من المعالم في الليمفاوية. ونحن نقدم وصفا تفصيليا للصعوبات التي يمكن مواجهتها عند إنشاء هذه الطريقة الجراحية المعقدة، فضلا عن بيانات تمثيلية من التجارب الفاشلة والناجحة لتوفير تعليمات عن كيفية التأكد من نجاح التجربة وتفسير البيانات التي تم الحصول عليها.

Introduction

تدفق الليمفاوية من الأمعاء الدقيقة عن طريق عملية أحادي الاتجاه الذي ينشأ في المرابض واحدة المضمنة داخل كل الزغابات المعوية صغير 1. المرابض هي قابلة للاختراق نسبيا إلى السوائل، والجزيئات والخلايا وتشكيل الليمفاوية وبالتالي يبدأ مع دخول هذه العوامل في المرابض. الليمفاوية الأولي في المرابض يتدفق في وقت لاحق من الأمعاء عن طريق شبكة من microvessels اللمفاوية، وجمع (وارد) الأوعية اللمفاوية، سلسلة من الغدد الليمفاوية المساريقي وفي نهاية المطاف بعد العقدي (ناقل) الأوعية الليمفاوية. ضمن العقد، ويمر الليمفاوية من خلال سلسلة من الجيوب النخاعية التي يحدث فيها تبادل مع الخلايا المناعية عقدة المقيمين وكذلك المواد التي تدخل العقدة من الدم. جميع الليمفاوية التي تتدفق من الأمعاء الدقيقة تتقارب في نهاية المطاف إلى ناقل قناة متفوقة المساريقي الليمفاوية وبعد ذلك الكيلوس صهريج. والكيلوس صهريج أيضا بجمع الليمفاوية تجفيف الأنسجة الطرفية الذيلية، intestإينال والمناطق والكبد وأسفل الظهر تنضم القناة اللمفاوية الصدرية جنبا إلى جنب مع الليمفاوية من المنصف وأجزاء الجمجمة من الجسم. القناة اللمفاوية الصدرية الليمفاوية يصب مباشرة في الجهاز الوريدي عند تقاطع عروق الوريد تحت الترقوة والداخلية اليسرى. بروتوكول الموصوفة هنا، والتي تمكن من جمع الليمفاوية مباشرة من أعلى قناة المساريقي الليمفاوية، وبالتالي يسهل تحليل العوامل المختلفة التي تمر مباشرة من الأمعاء إلى الجهازي (العام) التداول عبر الجهاز اللمفاوي المعوي.

الوظائف الفسيولوجية الرئيسية المسندة إلى الجهاز الليمفاوي الأمعاء هي للحفاظ على توازن السوائل، لتسهيل امتصاص الدهون ومحبة للدهون جزيء، وتمكين الاستجابات المناعية المناسبة 1. الخلايا السرطانية والفيروسات تنتشر أيضا عن طريق الأوعية اللمفاوية المعوية تحدث 2-4 والرئيسية تغييرات داخل الأوعية اللمفاوية في العديد من الأمراض الالتهابية والتمثيل الغذائي 5-7. علبةnulation من القناة الليمفاوية المساريقي لجمع الليمفاوية داخل مساريق يتيح تحليل تدفق السوائل السائبة عبر الأوعية اللمفاوية المعوية وكذلك الكمي للمعدل التركيز ونقل مختلف الخلايا والجزيئات. تغييرات على تركيز أو العبور من هذه العوامل في استجابة للتحديات المختلفة (على سبيل المثال، والوجبات الغذائية، مستضدات، والمخدرات) وفي نماذج المرض (على سبيل المثال، التهاب القولون، وفيروس نقص المناعة البشرية ومرض السكري) ويمكن أيضا أن يتم تقييم. في حين أنه من المستحيل أن يصف كل مكون على نطاق واسع الليمفاوية التي يمكن تحليلها ومقارنة هنا، الليمفاوية المساريقي يتكون مبسط من مائي، الدهون ومراحل الخلوية. وتشمل مكونات مصلحة في المرحلة المائية الببتيدات والبروتينات مثل المستضدات أو tolerogens 8، رسل المناعة مثل السيتوكينات وسطاء الخلايا البدينة 9، والوسطاء الأيضية مثل incretins 10. جزء الخلوي للالمساريقي الليمفاوية بعد العقدي يتكون بشكل كامل تقريبا (أكثر من 99٪) من lymphocytوفاق 11. خلايا مناعية مختلفة (الخلايا الجذعية، الخلايا البدينة، الخ) تدخل الأوعية اللمفاوية المساريقي قبل العقدي ولكن تبقى ضمن العقدة 12. إذا كانت الخلايا في وارد الليمفاوية هي التي تهم، فمن الممكن لجمع هذه الخلايا عن طريق إزالة الليمفاوية المساريقي الليمفاوية عدة أيام قبل القسطرة من القناة الليمفاوية المساريقي 12. وبهذه الطريقة يتم توصيل مباشرة وارد وصادر القنوات الليمفاوية والخلايا الليمفاوية في وارد الليمفاوية يمر مباشرة في القناة الليمفاوية المساريقي. وهكذا يمكن فحص العبور والنمط الظاهري من الخلايا المناعية المختلفة التي تمر عبر الأوعية اللمفاوية المعوية. ولعل السبب الأكثر شيوعا التي ذكرت لجمع الليمفاوية المساريقي حتى الآن، ومع ذلك، هو دراسة الأمعاء المعالجة، وامتصاص ونقل الدهون الغذائية والجزيئات محبة للدهون 10.

بعد تناولها، يتم هضمها الدهون الغذائية (على سبيل المثال، من الدهون الثلاثية إلى الأحماض الدهنية وأحادي الغليسريد، phospholipid للأحماض الدهنية وlysophospholipid، والكوليسترول استر إلى الأحماض الدهنية والكوليسترول، وغيرها) وتفرقوا داخل تجويف الأمعاء إلى مذيلة الصغيرة والهياكل حويصلي عبر إضافة amphiphiles من الصفراوية (الدهون الفوسفاتية والكوليسترول والأملاح الصفراوية) وعمل أنزيمات البنكرياس 10،13. من هنا يتم امتصاصها إلى المعوية. يتم إعادة أسترته-A نسبة من المكونات استيعابها لتشكيل الدهون الثلاثية، الدهون الفوسفاتية والكوليسترول استرات داخل خلايا الاستيعابية (المعوية). ويتم تجميع هذه أسترته إعادة الدهون من مزيج من خارجيا تناولها مكونات الدهون ومكونات الدهون الذاتية من الصفراء تفرز، وحمامات الدهون المخاطية أو إمدادات الدم المعوي 13. من هنا يتم تخزين الدهون أسترته سواء داخل المعوية أو تجميعها في البروتينات الدهنية المعوية (كيلومكرونات، البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة جدا (VLDL)) جنبا إلى جنب مع مختلف apoproteins وجزيئات محبة للدهون أخرى ( 10،13. بعد الخروج المعوية، ويتم نقل البروتينات الدهنية على وجه التحديد من الأمعاء إلى الدورة الدموية عن طريق الجهاز اللمفاوي المساريقي كما المرابض المعوية هي أكثر نفاذية لدخولهم من الشعيرات الدموية المعوية. يتم نقل نسبة من مكونات الدهون تمتص أيضا من الأمعاء إلى الدورة الدموية عن طريق الشعيرات الدموية والوريد البابي كما واحد، وعدم البروتين الدهني المرتبط، والجزيئات 14. بشكل عام، ومع ذلك، خط النقل الوريد البابي هو فقط لاعبا مهما في امتصاص الدهون قصيرة ومتوسطة طول السلسلة.

جمع الليمفاوية المساريقي مما يتيح تقييم نقل البروتينات الدهنية والمكونات المرتبطة بها (الدهون، وجزيئات محبة للدهون، بروتينات APO) من الأمعاء. والبروتينات الدهنية يمكن quantitated وتتميز مع ميزة أن البروتينات الدهنية الليمفاوية المساريقي، بشكل عام، هي في nascenر الدولة لأنها لم يتم تعديلها على نطاق واسع من قبل الإنزيمات جهازية مثل البروتين الدهني الليباز 15. في حين أن الليمفاوية المساريقي نموذج الفئران مقنى وربما تاريخيا وصفت الأكثر على نطاق واسع لتحليل النقل الدهون / البروتين الدهني من الأمعاء، وتبلغ مساحتها توسيع الاهتمام هو دور مفاوية في نقل المخدرات محبة للدهون، طلائع الأدوية والاكسيوبيوتك أخرى 13،16 الذي هو محور للنموذج موضح هنا. المخدرات محبة للدهون (عموما ذوي سجل P> 5 والذوبان في سلسلة طويلة من الدهون الثلاثية> 50 ملغ / غ على الرغم من استثناءات واضحة) 17،18، 19 وطلائع الأدوية الاكسيوبيوتك أخرى 13،16 يمكن الوصول إلى الأوعية اللمفاوية المعوية سواء بشكل سلبي أو عن طريق دمج بنشاط في البروتين الدهني الأمعاء مسارات النقل 19.

وبالتالي فإن الفئران الليمفاوية المساريقي تقنية القسطرة العديد من التطبيقات. بولمان وآخرون وصفت لأول مرة TECHNIQرق ليقني؛ يدخل القنية القناة الليمفاوية المساريقي في الفئران في عام 1948 (20). ومنذ ذلك الحين تم وصف عدد من الاختلافات على النموذج. على سبيل المثال، يمكن أن تحدث عندما يتم جمع مخدرة الفئران مع مختلف التخدير 21،22، أو في حالة واعية في حين قيدت 15 أو بحرية التحرك 23،24. الفئران يمكن أن تدار حلول الإماهة مختلفة ومواد أخرى مثل الدهون والتركيبات الدوائية بمعدلات مختلفة في المعدة والأمعاء أو بالحقن (عادة 0-5 مل / ساعة) 25. في بعض الدراسات ومقنى القناة اللمفاوية الصدرية بدلا من المساريقي القناة الليمفاوية لتقدير النقل من الأمعاء عن طريق الأوعية اللمفاوية الرغم من أن هذا قد نبالغ العبور من الأمعاء الدقيقة، وهذا يتوقف على عامل الفائدة، حيث أن القناة اللمفاوية الصدرية أيضا يتلقى الليمفاوية من الآخر المناطق 22،26. كما تم وصفها نماذج القسطرة الليمفاوية في العديد من الأنواع الأخرى بما في ذلك الفئران 15،27، ميني بيع 12، 28،29 الأغنام والخنازير والكلاب 30 31. ومع ذلك، فإن نموذج الفئران هو الأكثر انتشارا وباستمرار المذكورة. وقد نشرت البروتوكولات مفصلة لالقسطرة من القناة الليمفاوية المساريقي تليها مجموعة من الليمفاوية في اعيا 25 أو 22 مخدرة الفئران والجرذان 15،27 سابقا ويتم توجيه القارئ المهتم إلى هذه البروتوكولات. هذا البروتوكول هو أول من شرح هذه التقنية في شكل تصور.

الليمفاوية مقنى نموذج الفئران لديها مزايا أكثر من النماذج الحيوانية أكبر من حيث حساب، وسهولة عملية جراحية والاعتبارات الأخلاقية. بالمقارنة مع نموذج الفأر، المساريقي الليمفاوية جراحة القسطرة هي أيضا أسهل في الفئران على الرغم من أن نموذج الفأر تمكن دراسات أكثر تفصيلا في الحيوانات المعدلة وراثيا 27. ومع ذلك، هناك بعض أوجه القصور في نموذج الفئران، وخاصة تلك المرتبطة الاختلافات في علم وظائف الأعضاء، هذا الحد extrapolatأيون لحالات ما قبل السريرية والسريرية الأخرى. على سبيل المثال، في تدفق الصفراء الفئران هو ثابت ومستقل عن تناول الطعام في حين أنه في الغذاء الأنواع العالي أو الدهون تحفز تدفق الصفراء 32. وهذا يخلق تحديات الحصول على بيئات قبل وبعد prandial تمثيلية في الفئران التي تعكس ما وينظر في الأنواع والبشر أكبر. للدراسات تسليم المخدرات، ويمكن أيضا أن يفضل الأنواع الكبيرة عند تقييم النقل اللمفاوي بعد إدارة جرعة الإنسان واقعية تشكل 25. في دراسة حديثة، تم العثور على أسعار النقل الدهون في الليمفاوية المساريقي أن تكون قابلة للمقارنة بين الأنواع (الماوس، الجرذان، والكلب) بعد إعطاء كتلة تعادل ونوع من الدهون التي توفر بعض الثقة في استقراء البيانات نقل الدهون عبر الأنواع 27. ومع ذلك، فإن نقل نموذج محبة للدهون المخدرات، halofantrine، في المرتبة في ترتيب حجم الحيوان (أي كلب> الفئران> الماوس). وبالتالي قد تكون هناك حاجة لعامل التحجيم لالسابقtrapolate البيانات نقل المخدرات اللمفاوية من الفئران إلى الأنواع الأخرى.

وجود قيود على نماذج الليمفاوية القسطرة، بشكل عام، هو أن جمع الليمفاوية السلبي مباشرة من القناة اللمفية قد تعدل تدفق الليمفاوية والنقل منذ الأوعية الليمفاوية تعمل ضد التدرج الضغط الذي يتم تبديل بمجرد مقنى السفينة 33. يمكن للنموذج الليمفاوية القسطرة يكون من الصعب أيضا إقامة في المختبرات التي هي غير مألوفة مع هذه التقنية. وهكذا وصفت نماذج بديلة. على سبيل المثال، عبور من العوامل عن طريق الجهاز اللمفاوي الأمعاء، مثل البروتينات الدهنية وجزيئات محبة للدهون، وقد درست بشكل غير مباشر عن طريق جمع الدم. واحدة من هذه نموذج ينطوي مقارنة تركيزات الدم من الدهون و / أو الأدوية التالية تناوله عن طريق الفم في وجود وعدم وجود مثبطات (على سبيل المثال، الكولشيسين، Pluronic L81، سيكلوهيكسيميد) من إنتاج البروتين الدهني الأمعاء التي تعمل على منع النقل اللمفاوي 34. ميزةمن النماذج التي قياس النقل اللمفاوي غير مباشر عن طريق جمع عينات الدم هو أنه تمكن بعض التقييم النقل اللمفاوي في البشر وجراحة غير مطلوب 35. ومع ذلك، مثبطات النقل اللمفاوي ليست محددة، وتضعف العوامل التي يتم نقلها عبر الأوعية اللمفاوية وتعديلها في الدورة الدموية مما يعقد هذه التقييمات. كما تم وصفها في المختبر البدائل. على سبيل المثال، استخدمت كربونات الكالسيوم-2 خلية خلية معوية أو معزولة الثقافات لدراسة بمزيد من التفصيل إفراز الأمعاء من الجزيئات التي تدخل الأوعية اللمفاوية 36-38. نموذج متقدم في المختبر الذي هو أكثر تمثيلا للالمكروية المعوية الإنسان وأيضا وصفت مؤخرا 39. في هذا النموذج على طبقة الخلايا البطانية اللمفاوية هي شارك في تربيتها مع كاتشو-2 الخلايا التي تمكن من تحليل أكثر تفصيلا لنقل المواد من الأمعاء في الأوعية اللمفاوية. ومع ذلك، في vitrس نظم خلايا تفتقر تدفق تبادل ونقل أي الربط مع معة الأمعاء والدم الأساسي والعرض الأوعية الدموية اللمفية. في نهج بديل، قسيس وآخرون إنشاء قناة المزدوجة (فيديو عالي السرعة مشرق الميدان ومضان) في الموقع نظام التصوير التي تمكن المقارنات الكمية بين انكماش الأوعية، وتدفق الليمفاوية وتركيزات الدهون الفلورسنت في الأوعية اللمفاوية المساريقي 33. ميزة هذا النموذج على ما سبق ذكره في أنظمة المختبر هو أنه يتيح تتبع دقيق للمرور الخلايا المناعية من خلال الأوعية اللمفاوية. و، ومع ذلك، لم تضع القياسات المطلقة من الدهون الشامل (أو المخدرات) النقل بعد باستخدام أساليب التصوير. وفي التجارب المختبرية وسيليكون والنهج على التنبؤ على وجه التحديد مدى نقل المخدرات عبر محبة للدهون كما تم نشره 40-42 مفاوية المعوية. على سبيل المثال، تقارب خارج الحي من عدة جتم العثور على ompounds لكيلومكرونات البلازما لربط بشكل معقول مع وسائل النقل اللمفاوي في الجسم الحي 41. وفي وقت لاحق، أنشأت المجموعة نفسها لفي نموذج سيليكون والتنبؤ تقارب المخدرات لكيلومكرونات على أساس الخصائص الفيزيائية متعددة 40. هولم وآخرون أيضا إنشاء مجمع نسبيا في نموذج سيليكون والتنبؤ صريح النقل اللمفاوي من المركبات محبة للدهون على أساس اصفات الجزيئية 42. قد توفر هذه النماذج نهجا مفيدا للتنبؤ بمدى النقل اللمفاوي من الأدوية غير معروفة. و، ومع ذلك، هناك حاجة المصادقة على النماذج مع مجموعة واسعة من الأدوية وعبر مختبرات مختلفة لتأكيد دقتها والتكاثر.

القسطرة من القناة الليمفاوية المساريقي بالتالي يبقى الوسيلة الوحيدة لدراسة مباشرة محتوى الليمفاوية استنزاف الأمعاء الدقيقة ومعدل عبور للمجموعة معقدة من العوامل (الخلايا والبروتينات،الببتيدات، والدهون، والمخدرات) في الليمفاوية في الوضع في الجسم الحي. هنا نحن تصف بروتوكول للالقسطرة من المساريقي القناة الليمفاوية والشريان السباتي التي تمكن من جمع الليمفاوية المساريقي والدم النظامية من الفئران مخدرة. وتظهر بيانات تمثيلية كيف يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الدهون ونقل المخدرات من الأمعاء عن طريق الجهاز اللمفاوي المساريقي. ويعقب ذلك مناقشة الصعوبات التي يمكن أن يواجهها في تأسيس نموذج ودليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها. وبمجرد إنشاء هذا النموذج هو أداة قوية لتحقيق النقل اللمفاوي المعوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتمت الموافقة على الدراسات وصفها في هذه المخطوطة من قبل لجنة الأخلاق الحيوانية المحلية، أو جرت وفقا للمجلس الأسترالي والنيوزيلندي لرعاية الحيوانات في البحث والتدريس المبادئ التوجيهية. قبل بدء تنفيذ أي إجراء الحيوانية، وضمان أن يتم الحصول على الإذن المناسب من خلال المحلية المؤسسة / المنظمة. كما هو الحال مع جميع العمليات الجراحية الحيوانية، وضمان أن الجراحة تتم من قبل المشغلين مدربين تدريبا مناسبا، تحت ظروف معقمة والتي تدار التخدير والمسكنات والمضادات الحيوية عند الحاجة لضمان النتيجة الأخلاقية وناجحة.

1. الاستعدادات قبل يوم من إجراء العمليات الجراحية

  1. صيام الفئران في الليلة السابقة لعملية جراحية إذا لزم الأمر. ضمان الفئران لديها حرية الوصول إلى المياه.
  2. إعداد الحلول لأن تدار على الفئران.
    1. يعد حل الإماهة مثل ملحي معقم أو محلول قارعو الأجراس.
    2. إعدادحلول جمالية على النحو المطلوب. التخدير المستخدمة في وصف التجارب هنا يتألف من "كوكتيل 1" أعدت من خلال الجمع بين 1.9 مل من الكيتامين 100 ملغ / مل، 0.5 مل من زيلازين 100 ملغ / مل، 0.2 مل من آسيبرومازين 10 ملغ / مل و 2.5 مل من المياه المالحة و" كوكتيل 2 "التي تتكون من 1 مل من الكيتامين 100 ملغ / مل و 0.1 مل آسيبرومازين 10 ملغ / مل. ملاحظة: استنشاق الأيزوفلورين أو سيفوفلوران قد يكون من المفضل لأنها يمكن أن توفر طائرة الجراحية للتخدير لفترة أطول من الزمن.
    3. اختياريا إعداد صياغة تحتوي على المخدرات، على سبيل المثال، مستحلب الدهون. إجراء دراسات الاستقرار المناسبة لضمان استقرار صياغة مدى فترة التخزين والإدارة.
      ملاحظة: إن الطبيعة الدقيقة للصياغة والمخدرات إلى أن تدار سوف تختلف مع كل دراسة أن الهدف من دراسات النقل المخدرات اللمفاوية هي في معظم الأحيان لتقييم كفاءة النقل المخدرات اللمفاوي بوصفها وظيفة من صياغة والمخدرات ADMINIstered.
      1. ويتم إعداد صياغة المستخدمة في التجارب التمثيلية في الشكل 4 و 5 هنا، كما هو موضح سابقا 43. لفترة وجيزة، وإدماج 14 C حمض الأوليك (2-5 μCi) وhalofantrine (200 ميكروغرام) إلى 40 ملغ حمض الأوليك قبل التشتت في 5.6 مل من المرحلة المائية تتكون من 5 ملي توروكولات الصوديوم في الفوسفات مخزنة المالحة (درجة الحموضة 6.9).
      2. لتركيبات تحتوي على 2-monoolein، إضافة 7.1 ملغ من 2 monoolein جنبا إلى جنب مع المكونات الأخرى، إلى المرحلة المائية في نفس الوقت مرحلة تحتوي على حمض الأوليك halofantrine. إعداد الصياغات التي تحتوي على 2-monoolein مباشرة قبل الادارة لالفئران ك 2-monoolein غير مستقرة نسبيا وisomerises إلى 1-monoolein.
      3. وفي وقت لاحق يستحلب الصياغات التي كتبها ultrasonication لمدة 2 دقيقة في RT.
        ملاحظة: كما وصفت سابقا 43، مراقبة استقرار الصياغات التي كتبها i) الفحص البصري من مستحلبسيون تحت الضوء المستقطب للتأكد من أن مستحلب لا مرحلة فصل والثاني) تحليل حجم الجسيمات فور الانتهاء من تحضير وبعد الجرعات باستخدام تشتت الضوء الديناميكي لتوفير مؤشرا على أي تغيرات المرحلة و / أو الانفصال، والثالث) تحليل تركيزات halofantrine باستخدام مقايسة HPLC التحقق من صحتها.
  3. تحضير محلول مضاد للتخثر تحتوي على 10 ملغ / مل EDTA في الماء المعقم أو 10 وحدة دولية / مل الهيبارين في المياه المالحة لطرد قنية الليمفاوية. إعداد أيضا حل مكافحة تجلط الدم التي تحتوي على 2،5 حتي 10 وحدة دولية / مل الهيبارين في المياه المالحة لطرد قنية الشريان السباتي.
  4. إعداد قنية البولي ايثيلين لإدراجها في القناة الليمفاوية المساريقي (0.8 ملم OD، 0.5 مم ID)، الشريان السباتي (0.96 مم OD، 0.58 ملم ID أو 0.8 مم OD، 0.5 مم ID) والاثني عشر (0.96 مم OD، 0.58 ملم ID )
    1. قطع قنية إلى الطول المطلوب (عادة 25 - 30 سم للالشريان السباتي وقنية الاثني عشر و15 - 10 سم للالقنا الليمفاويةالعلا) ووضع شطبة في غيض من قنية باستخدام شفرة جراحية معقمة (انظر الشكل 1).
      ملاحظة: وهذا يزيد من سهولة قنية الإدراج ويقلل من حدوث انسداد قنية بعد الإدراج.
    2. ضع نقطة الربط شكل J في قنية داخل الإثناعشري بواسطة حلقات جزء صغير من قنية مرة أخرى على نفسه، والتدفئة مع لوحة أخف وزنا أو الساخنة وثم قطع لحجم (انظر الشكل 1).
  5. إرفاق قنية الليمفاوية إلى إبرة 25 G وحقنة تحتوي على محلول مضاد للتجلط الدم (المعد في الخطوة 1.3). ملء قنية الليمفاوية مع الحل المضادة للتخثر وترك الحل في O قنية / N للحد من وقوع تشكيل جلطة في قنية الليمفاوية خلال جمع الليمفاوية.
  6. إعداد أنابيب للالليمفاوية وجمع عينة من الدم. قبل تزن أنابيب جمع الليمفاوية، وأنابيب تسمية الليمفاوية وعينة من الدم جمع وإضافة محلول مضاد للتخثر. إضافة يكفي solut المضادة للتخثرأيون لتحقيق تركيز النهائي من 1 ملغ / مل EDTA في الماء المعقم أو 10-20 وحدة دولية / مل الهيبارين في الليمفاوية التي تم جمعها أو الدم.

2. الاستعدادات التي تسبق مباشرة ابتداء من إجراء العمليات الجراحية

  1. تحقق من كل قنية التي كتبها التنظيف بمحلول ملحي معقم أو محلول مضاد للتجلط الدم للتأكد من أنها هي براءات الاختراع.
  2. تحضير الفئران لإجراء العملية الجراحية.
    ملاحظة: القناة الليمفاوية المساريقي هو أكثر وضوحا في الفئران التي أكلت أو تم إعطاء جرعة من النفط كما يصبح الليمفاوية المساريقي حليبي وشفاف مع ارتفاع الدهون التحميل. بعض المشغلين، وخاصة أولئك جديدة لعملية جراحية، لذلك تجد أنه من الأسهل أن يقني؛ يدخل القنية القناة الليمفاوية المساريقي عندما تكون مداوي مسبقا مع زيت الفئران (حوالي 0،1-1 مل) مثل زيت الزيتون أو زيت فول الصويا 0،5-2 ساعة قبل الجراحة تبدأ . ومع ذلك، يؤثر ما قبل الجرعات للنفط في النقل اللمفاوي من الدهون، والمخدرات، محبة للدهون وعوامل أخرى في الليمفاوية مثل أنه قد لا تكون مثالية إلى ما قبل جرعة النفطاعتمادا على الهدف من التجربة.
    1. تخدير الفئران طوال فترة الجراحة وجمع العينة.
      1. على سبيل المثال، والشروع في التخدير عن طريق الحقن تحت الجلد من 1.5 مل / كغ من كوكتيل I (من الخطوة 1.2.2) في طية الجلد في الجزء الخلفي من الرقبة الفئران باستخدام حقنة 1 مل تعلق على إبرة 25 G. الحفاظ على التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق من 0.44 مل / كغ من كوكتيل 2 (من الخطوة 1.2.2) تقريبا كل ساعة كما هو مطلوب، وذلك باستخدام حقنة 1 مل تعلق على إبرة 25 G.
      2. قبل البدء في الجراحة ضمان أن عمق التخدير كافية من خلال مراقبة معدل التنفس، وحركة الطولي، لهجة العضلات والاستجابات للمثيرات مثل معسر القدم. إدارة التخدير إضافية على النحو المطلوب.
    2. حلق الفراء من المناطق الجراحية، والتي تشمل الجانب الأيمن من البطن لالليمفاوية والقسطرة الاثني عشر، والرقبة ومنطقة الترقوة الأيسر لالشريان السباتي قنيةنشوئها.
    3. تنظيف المناطق الجراحية جو معقم و مطهر باستخدام محلول أو الكلورهيكسيدين حل povidine اليود والايثانول 70٪ فرك. كرر هذا 3 مرات لكل منطقة، مع الانتهاء من التطهير النهائي مع الايثانول 70٪.
  3. وضع الحيوان في ظهري رقود على شباكه نظيفة فوق وسادة الجراحية ساخنة (37 ° C).

3. القسطرة من المساريقي الليمفاوية القناة

  1. وضع الحيوان مع جانبها الأيمن يواجه نحو المشغل. إجراء الجراحة مع أو دون مساعدة من الميكروسكوب الجراحي كما هو مطلوب.
  2. فتح الطبقة العليا من الجدار العضلي في البطن مع على التوالي 4 سم شق يمتد من خط الوسط (عملية سيفي الشكل) إلى الجهة اليمنى ما يقرب من 2 سم تحت القفص الصدري (الحافة الضلعية) باستخدام شفرة مشرط معقم (انظر الشكل 2B).
  3. فتح الطبقات المتبقية من الجدار العضلي في البطن 4-5 ملم الجانبية لخط الوسط إلى الجهة اليمنى مع زوج صغيرمن مقص جراحي (انظر الشكل 2B).
  4. التراجع الأمعاء الدقيقة تحت الجدار العضلي في البطن الأيسر وإبقائه في مكانه باستخدام 2 - 3 قطع من الشاش المعقم مشبعة المالحة العادية.
  5. سد الفئران أكثر من حقنة بلاستيكية 10 مل توضع أفقيا مرة في ظل الفأر على مستوى الكلية اليمنى لتخفيف التصور من القناة الليمفاوية المساريقي.
  6. تحديد موقع متميز المساريقي القناة الليمفاوية: سفينة حوالي 0،5-1 ملم في القطر الذي هو عمودي على الكلية اليمنى ومنقاري فورا وبالتوازي مع الشريان المساريقي (أ المظلمة الأوعية الدموية الأحمر النابض؛ انظر الشكل 2C).
    ملاحظة: في الفئران غير صام أو زيت ما قبل مداوي السفينة بيضاء، مبهمة وأسهل لتصور من في الفئران صام فيه غير شفافة تماما.
  7. تفقد المنطقة الذيلية فورا إلى كبير متفوقة القناة الليمفاوية المساريقي والشريان المساريقي لتحديد ما إذا كان الثاني، أصغر القناة الليمفاوية التبعي هوالحاضر. إذا كان موجودا، منع تدفق الليمفاوية من خلال القناة بقطع القناة وتسد مع superglue، أو ربط خياطة في جميع أنحاء لاصق، لضمان وحدة التخزين بالكامل من الليمفاوية التي تتدفق من الأمعاء يتم جمعها من أعلى القناة الليمفاوية المساريقي.
  8. تمرير زوج من ملقط على التوالي من خلال الفراش الدهون شبه الكلى على الهامش السفلي من الكلية اليمنى، وذلك من خلال طبقات النسيج الضام مباشرة أسفل الوريد الأجوف، في اتجاه مواز مع متفوقة القناة الليمفاوية المساريقي.
  9. باستخدام غيض من ملقط تترسخ من قنية الليمفاوية وتسحبه من خلال السرير الدهون شبه الكلوي مع نهاية واحدة المتاخمة مباشرة إلى القناة الليمفاوية المساريقي والآخر exteriorised من الحيوان على مستوى الكلية اليمنى.
  10. عزل القناة الليمفاوية المساريقي من المغطي طبقات من النسيج الضام والدهون من خلال تشريح حادة. والحرص على عدم اختراق أو تلف القناة الليمفاوية.
  11. بعد عزل القناة الليمفاوية، وجعل هو صغيرلو في القناة الليمفاوية مع أي مقص الدقيقة، وطرف حاد من ملقط صائغ أو إبرة 25 G. والحرص على عدم قطع تماما السفينة.
  12. تأكد من أن قنية الليمفاوية يتم تعبئة تماما مع الحل المضادة للتخثر (باستخدام حقنة و 25 G إبرة) مع أي ثغرات الهواء. إدراج قنية الليمفاوية حوالي 2-4 ملم داخل القناة الليمفاوية المساريقي عبر ثقب صغير مع المعونة من زوج صغير من الملقط.
  13. مراقبة قنية الليمفاوية لبضع دقائق. مراقبة تدفق تدريجي للالليمفاوية المعوية من نهاية جمع خالية من قنية إذا كان القسطرة بنجاح. إذا كان القسطرة غير ناجح، كرر الخطوات 3،8-3،12.
  14. إذا كان القسطرة ناجحا، تأمين قنية عن طريق وضع قطرة صغيرة من مادة لاصقة البيطري خلال ثقب مدخل في القناة الليمفاوية. والحرص على عدم انسداد السفينة عن طريق تطبيق لاصقة البيطري الزائد.
  15. بينما تنتظر لاصقة البيطري لضبط، obserلقد تدفق الليمفاوية لعدة دقائق للتأكد من أن إجراء القسطرة كانت ناجحة. مرة واحدة على يقين من نجاح القسطرة، وإزالة قطع الشاش التي تم وضعها في تجويف البطن بعناية ووضع الأمعاء الدقيقة في موقعها الأصلي.
  16. وضع أنبوب جمع الليمفاوية التي تحتوي على مضادة للتخثر (راجع الخطوة 1.6) في نهاية قنية لجمع الليمفاوية التدفق الحر.
  17. وبعد ذلك، يقني؛ يدخل القنية العفج للتسريب من حلول الإماهة و / أو التركيبات.

4. القسطرة من الاثني عشر

  1. إرفاق قنية العفج إلى حقنة (على سبيل المثال، 10 مل) مليئة حل الإماهة.
  2. تحديد الاثنى عشر كما وردي مشرق (مع المزيد من الأوعية الدموية) جزء من الأمعاء الدقيقة، التي يعتمد عليها لطيف أسفل سحب يكشف المعدة.
  3. جعل ثقب ثقب صغير في الاثنى عشر ما يقرب من 2 سم تحت تقاطع المعدة والاثني عشر (بوابة المعدة) باستخدامالعقيمة 23 G الإبرة.
  4. إدراج نهاية مدمن مخدرات J شكل من قنية الاثني عشر من خلال ثقب ثقب. تأمين في مكان مع قطرة من الغراء cyanoacrylate.
  5. يبدأ الماء من الفئران عن طريق ربط قنية إلى حقنة الإماهة تحميلها في مضخة التسريب. ووفقا للأدب وتتراوح معدلات الإماهة 0،5-3 مل / ساعة 15،25.
  6. بعد الانتهاء من الليمفاوية والقسطرة الاثني عشر، أغلق شق في الجدار العضلي في البطن مع الغرز. ثم إغلاق شق الجلد من خلال تطبيق بضع قطرات من مادة لاصقة الأنسجة (cyanoacrylate) على طول الجانب من شق ومعسر الجلد على جانبي الشق معا.

5. القسطرة من الشريان السباتي

الشريان السباتي القسطرة يمكن أداؤها قبل أو بعد القسطرة من القناة الليمفاوية المساريقي. بعض المشغلين يفضلون يقني؛ يدخل القنية الشريان السباتي قبل cannulating القناة الليمفاوية وذلك للحد صطرد كامنة قنية الليمفاوية عندما تتحرك الحيوانات.

  1. ضع علامة على الشريان السباتي قنية 2.5 سم من الحافة شطبة لتحديد جزء من الأنابيب لتضاف الى الشريان. قم بتوصيل الطرف الآخر من قنية (أي بدون شطبة) إلى 23 أو 25 G إبرة تعلق على حقنة مملوءة بمحلول مضاد للتخثر وملء قنية مع محلول مضاد للتخثر التأكد من عدم وجود ثغرات الهواء موجودة.
  2. لتسهيل القسطرة، ضع فأر تخدير في ظهري الاستلقاء مع الرقبة امتدت ورئيس لافتا نحو المشغل. لاحظ أن بعض المشغلين يفضلون أداء هذه التقنية مع ذيل فأر مشيرا تجاه المشغل.
  3. ضع 1 - 1.5 سم شق طولي من خلال طبقة الجلد فوق يسار القصبة الهوائية في المستوى السهمي.
  4. تشريح النسيج الضام تحت الجلد باستخدام ملقط غيض حادة لفضح عضلات الرقبة الأساسية المقترنة.
  5. التراجع عضلات الرقبة تيس تكشف الشريان السباتي الأيسر (الموجود ~ 1 سم تحت سطح الجلد وينبض). تنظيف النسيج الضام المغطي من الشريان عن طريق تشريح حادة.
  6. عزل وسم القسم ~ 1 من الشريان بعناية باستخدام ملقط الأنسجة حادة، مع الحرص على عدم الإضرار المجاور مسار العصب المبهم. تنفيذ هذا عن طريق فتح وإغلاق ملقط غيض حادة عموديا على طول جانبي الشريان لتحريرها من الأنسجة المحيطة بها، والعصب المبهم.
  7. باستخدام ملقط غيض غرامة، والخيط اثنين من خيوط الحرير تحت الشريان السباتي ووضعها في نهاية كل قسم الشريان معزولة. ربط قبالة خياطة الأقرب إلى المشغل والأبعد عن القلب والترقوة (الشكل 3A) في الفئران.
  8. انسداد تدفق الدم من خلال الشريان عن طريق وضع زوج من ملقط على التوالي طرف الجميلة تحت الشريان (الشكل 3B).
  9. باستخدام مقص طرف القزحية الجميلة، وضع شق صغير على السطح العلوي من الشريان (حوالي 1/3 منالطريق إلى أسفل من أعلى منطقة معزولة). طرد أي دم انسكب على سطح الشريان مع المياه المالحة heparinised ويمسح برفق باستخدام نصائح القطن.
  10. إدراج غيض من قنية في الشريان مع زوج من ملقط غيض المنحني. إدراج مرة واحدة، وإزالة التوالي ملقط غيض غرامة تسد تدفق الدم ودفع قنية 2.5 سم في الشريان باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، واحد لعقد قنية داخل الشريان لوقف الدم من التسرب إلى الوراء والأخرى إلى إدراج قنية.
  11. استخدام المشبك الشريان صغير لعقد قنية داخل الشريان وإزالة التوالي ملقط غيض الجميلة التي وضعت تحت الشريان في الخطوة 5.8 إلى انسداد تدفق الدم.
  12. تأكيد المباح للقنية عن طريق حقن محلول مضاد للتخثر في قنية وستسحب كمية صغيرة من الدم (الشكل 3C). ثم طرد قنية مع حل تخثر وختم نهاية باستخدام شعلة أخف وزنا أو المكونات قنية.
  13. ربط عشرالبريد قنية في مكان مع اثنين من الغرز وضعت تحت الشريان في الخطوة 5.8.
  14. إزالة المشبك الشريان وتأمين خياطة الثالثة حول الشريان وقنية. إغلاق الرقبة الجرح مع الغرز.

6. فترة ما بعد الجراحة وصياغة تسريب

  1. الاستمرار في الحفاظ على الفئران تحت التخدير وعلى لوحة ساخنة.
  2. ترطيب الفئران عن طريق ضخ محلول معالجة الجفاف في الاثني عشر للا يقل عن 0.5 ساعة بعد الانتهاء من cannulations. نلاحظ انخفاض معدل تدفق الليمفاوية (~ 0،1-0،5 مل / ساعة) خلال الفترة الأولى التالية القسطرة وزيادة قريبا إلى خط أساس ثابت (0،4-2،5 مل / ساعة اعتمادا على معدل الإماهة).
  3. وبعد فترة النقاهة، ولبث صياغة الفائدة (التي تحتوي على الدهون، والمخدرات، وغيرها) في الاثني عشر عبر قنية. اختياريا، واستخدام مضخة التسريب لتنظيم معدل تدفق الصياغة. ملاحظة: في وصف بروتوكول هنا تبقى الحيوانات anaesthetised طوال فترة الجراحة وجمع الليمفاوية ورصاصة الرحمة تحت التخدير بحيث لا يشترط تسكين إضافي. إذا تم تعديل البروتوكول ويتم تمكين الحيوانات ليستعيد وعيه بعد ذلك سوف تكون هناك حاجة تسكين المناسب والرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية.
  4. عند الانتهاء من صياغة ضخ الاستمرار في ترطيب الفئران بمعدل 1.5-3 مل / ساعة مع المياه المالحة الطبيعية إلى الاثني عشر لمنع الجفاف.
  5. مواصلة للحفاظ على الفئران على لوحة الجراحية ساخنة 37C للحفاظ على درجة حرارة (كما في الخطوة 2.3) والبول صريح من المثانة عن طريق الضغط النزولي لطيف على أسفل البطن كما هو مطلوب وتطبيق مرهم للعين كل ساعة (كما في الخطوة 2.2. 3). ينصح العادية تغير موقف الجسم إذا كان الحيوان هو يستعيد وعيه بعد العملية.

7. جمع عينات الدم الليمفاوية ولتقييم الدهون وامتصاص الدواء

  1. جمع الليمفاوية بشكل مستمر إلىأنابيب تحتوي على مضادة للتجلط الدم. تغيير أنابيب في فترات زمنية المطلوبة (على سبيل المثال، كل ساعة).
  2. جمع عينات الدم عند نقاط زمنية محددة.
    1. انسداد تدفق الدم من خلال قنية عن طريق الانحناء قنية إلى الوراء ما يقرب من 2 سم من نهاية مختومة. فضها قنية بقطع نهاية مختومة أو إزالة المكونات قنية.
    2. باستخدام حقنة فارغة، سحب المالحة heparinised من قنية حتى يملأ الدم قنية بأكملها.
    3. باستخدام حقنة فارغة جديدة، سحب حجم المطلوب من الدم ووضعه في أنبوب يحتوي على مضاد للتخثر.
    4. باستخدام حقنة الأولى، يحل محل الدم تؤخذ قبل أخذ العينات للحد من فقدان الدم لا لزوم لها. قبل الحقن، ونفض الغبار الحقنة في حين عقد بشكل عامودي لضمان عدم وجود فقاعات الهواء تدخل قنية.
    5. باستخدام حقنة، استبدال حجم الدم إزالتها من الفئران مع محلول مضاد للتخثر. ضمان عدم وجود الدم المتبقي مرئيا في قنية مثل أي المتبقية قد تجلطومنع قنية.
    6. بيند قنية ما يقرب من 2 سم من نهاية تفض إلى عرقلة تدفق الدم وإزالة المحقنة. باستخدام شعلة أخف وزنا أو المكونات قنية، ختم قنية.
  3. عند الانتهاء من جمع الدم واللمف من الفئران، الموت ببطء الفئران عن طريق إدارة داخل الصفاق من> 100 ملغ / كغ بنتوباربيتون الصوديوم.
  4. تحديد معدل تدفق الليمفاوية عن طريق قياس كتلة الليمفاوية التي جمعت خلال كل فترة زمنية.
  5. قياس تركيز المخدرات والدهون في الدم الليمفاوية ويستخدم، على سبيل المثال، HPLC، HPLC-MS أو باستخدام مجموعات تجارية، لتقييم الدهون وامتصاص الدواء الكفاءة.
  6. حساب النقل الجماعي من المخدرات والدهون في الليمفاوية من المنتج لتركيزات وحجم الليمفاوية قياس جمعها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نتائج تجربة تمثيلية ل quantitate مدى التراكمي ومعدل الدهون ونقل المخدرات عبر الجهاز اللمفاوي بعد الولادة الأمعاء باستخدام نموذج المساريقي الليمفاوية القسطرة يتم هو موضح في الشكل (4) والشكل (5). في هذه التجربة، 200 ميكروغرام من محبة للدهون نموذج كانت تدار halofantrine المخدرات في الاثنى عشر من الفئران أكثر من 2 ساعة في صياغة تحتوي على 40 ملغ حمض الأوليك (بما في ذلك 2-5 μCi 14-C الأوليك حامض) و 7.1 ملغ 2-monoolein فرقت في 5.6 مل من 5 ملي توروكولات الصوديوم في الفوسفات مخزنة المالحة الرقم الهيدروجيني 6.9. بعد إعطاء صياغة وممهى الفئران بمعدل 2.8 مل / ساعة مع المياه المالحة العادية التي غرست في الاثني عشر. وقد تم جمع الليمفاوية بشكل مستمر في أنابيب غيرت كل ساعة لمدة 10 ساعة. أعد صياغة، وتجربة أداء، وفقا لبروتوكول سبق وصفها لصياغة تحتوي على كل نفس componلم الوالدان إلا أنها لا تشمل 2-monoolein 43.

كما هو مبين في الشكل (4)، في هذه الظروف التجريبية كان متوسط ​​معدل تدفق الليمفاوية للفئران مقنى بنجاح بين 0،4-1،3 مل / ساعة. في بعض الفئران كان معدل تدفق الليمفاوية انخفاض طفيف في الأولى 1 - 3 ساعة التالية القسطرة ثم زاد. ويعتبر هذا عادة التالية الليمفاوية القسطرة. يظهر أيضا في الشكل 4 هو معدل تدفق الليمفاوية لتجربة ناجحة. في هذه الحالة ظل معدل تدفق أقل بكثير مما كان عليه في التجارب الناجحة طوال فترة جمع. وبالمثل، كان النقل اللمفاوي التراكمي من الدهون الثلاثية وhalofantrine أقل بكثير في التجربة غير ناجحة (5A الشكل وباء). وكان متوسط ​​النقل halofantrine التراكمي في المجموعة ناجحة 15.1٪ من الجرعة، وكان نقل الدهون الثلاثية التراكمي 61 ملغ أكثر من 10 ساعة ونسبة ص تداروكانت adiolabelled جرعة الدهون الخارجية تنقل في الليمفاوية 54٪ (الشكل 5C). هذه القيم ليست مختلفة كثيرا لتلك التي شوهدت في السابق لصيغة مشابهة التي تحتوي على نفس المكونات باستثناء غياب 2-monoolein 43 (الجدول 1). هذا يشير إلى أن التركيبات التي تحتوي على الأحماض الدهنية في حالة عدم وجود مصدر أحادي الغليسريد يمكن أن تدعم الدهون مماثل والنقل المخدرات في الليمفاوية لتلك التي لا تحتوي على أحادي الغليسريد. يرد وصف هذه النتيجة في قسم المناقشة.

الشكل 5D يظهر بيانات تمثيلية للمعدل halofantrine والنقل الدهون الثلاثية في الليمفاوية مع مرور الوقت بعد الإدارة. معدل النقل في كل من الدهون الثلاثية والمخدرات في الليمفاوية قمم بضع ساعات التالية الدهون والدواء ومن ثم يعود إلى مستويات خط الأساس. كما هو الحال في التجارب الدهون ونقل المخدرات الليمفاوية المعوية، ومعدل نقل القوارب والمخدراتويتم نقل تي في الليمفاوية خلال كل الوقت المرايا الفترة التي شهدت للنقل الدهون الثلاثية كما المخدرات في الليمفاوية بالتعاون مع البروتينات الدهنية-الدهون الثلاثية الغنية.

الشكل (1)
الشكل 1. تمثيل بياني للشكل غيض مشطوف من الشريان السباتي أو الليمفاوية قنية، وغيض مشطوف J-شكل من قنية الاثني عشر.

الشكل 2
الشكل 2. صور من (A) البطن حلق تمهيدا ليقني؛ يدخل القنية القناة الليمفاوية، (B) افتتح في الجدار العضلي في البطن مع على التوالي 4 سم شق يمتد من خط الوسط إلى الجهة اليمنى للوصول إلى القناة الليمفاوية، و (C ) متفوقة القناة الليمفاوية المساريقي (في دائرة صفراء) عمودي على الكلية اليمنى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. صور من (A) الشريان السباتي معزولة مع اثنين من خيوط الحرير مع واحد أقرب إلى المشغل تعادل خارج، (B) الشريان السباتي معزولة وتدفق الدم المغطي مع زوج من ملقط على التوالي طرف الجميلة وضعت تحت الشريان، و (C) في الشريان السباتي مع قنية في مكان والمباح يجري فحصها من قبل ستسحب كمية صغيرة من الدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52389 / 52389fig4highres.jpg "/>
كانت تدار الشكل 4. البيانات التمثيلية لمعدل تدفق الليمفاوية المساريقي (ميكرولتر / ساعة) مع مرور الوقت. الجرذان صيغة تحتوي على 200 ميكروغرام halofantrine، 40 ملغ حمض الأوليك (مع 2 حامض μCi 14 C-الأوليك) و 7.1 ملغ 2-monoolein في 5.6 مل من 5 ملي توروكولات الصوديوم في الفوسفات مخزنة المالحة (درجة الحموضة 6.9) 0-2 ساعة. البيانات المعروضة هي متوسط ​​± SEM ل n = 3 التجارب الناجحة (الدوائر المغلقة، ●) و n = 1 نتائج فاشلة (مثلثات مفتوحة، Δ).

الرقم 5
الشكل 5. بيانات تمثيلية للدهن والنقل المخدرات في الليمفاوية المساريقي. النقل التراكمي من (A) وhalofantrine نموذج المخدرات (ذات التردد العالي، جرعة٪)، (B) الدهون الثلاثية (TG، ملغ) و (C) الأحماض الدهنية الخارجية (٪ دوسه)، ومعدل نقل (D) TG (ملغ / ساعة) و HF (٪ الجرعة / ساعة) في الليمفاوية المساريقي مع مرور الوقت بعد إدارة صيغة تحتوي على 200 ميكروغرام halofantrine، 40 ملغ حمض الأوليك (مع 2 μCi 14 حمض الأوليك C-) و 7.1 ملغ 2-monoolein في 5.6 مل من 5 ملي توروكولات الصوديوم في الفوسفات مخزنة المالحة (درجة الحموضة 6.9) 0-2 ساعة. البيانات المعروضة هي متوسط ​​± SEM ل n = 4 التجارب الناجحة (الدوائر المغلقة، ●) و n = 1 نتائج فاشلة (مثلثات مفتوحة، Δ). كان لا يقاس النقل الأحماض الدهنية خارجي في التجربة فاشلة ولكن منخفض عادة في التجارب الفاشلة. تم حذف البيانات للتجربة فاشلة من لوحة D لوضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

بدون مonoolein مع 2-monolein
متوسط SEM متوسط SEM
Halofantrine (جرعة٪) 15.1 0.8 15 1.6
الدهون الثلاثية (ملغ) 67 4 61 6
مجموع الأحماض الدهنية (ميكرومول) 261 16 248 23
حمض الأوليك الخارجية (ميكرومول) 82 5 65 6
الأحماض الدهنية الذاتية (ميكرومول) 180 17 183 28

الجدول 1. مقارنة البيانات النقل اللمفاوية المتراكمة أكثر من 10 ساعة بعد إعطاء 200 ميكروغرام halofantrine لالمساريقي القناة الليمفاوية الفئران مقنى في التركيبات التي تحتوي على 40 ملغ حمض الأوليك (containinز 1 μCi حمض الأوليك C-14) مستحلب في 5 ملي توروكولات الصوديوم في الفوسفات مخزنة المالحة (درجة الحموضة 6.9) مع وبدون 7.1 ملغ 2-monoolein. البيانات تمثل يعني ± SEM ل n = 4 الفئران. لا إحصائيا وينظر إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات 2.

(أ) في المجموعة مداوي مع 2-monoolein هذا ليس مقياسا دقيقا للنقل الأحماض الدهنية الذاتية كما لم يتم احتساب حمض الأوليك تعلق على العمود الفقري 2-monoolein لفي دخيلة النقل حمض الأوليك قياس في الليمفاوية.

ب تم نشر البيانات لhalofantrine ومجموع النقل الأحماض الدهنية في المجموعة مداوي دون 2-monoolein سابقا في الشكل 5 مرجعية 43 ويرد هنا في شكل جدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نموذج الفئران المساريقي القسطرة الليمفاوية يتيح المباشر لكمية التركيز ومعدل نقل مختلف الخلايا والجزيئات (مثل الدهون والمخدرات) من الأمعاء إلى الليمفاوية والتغييرات التي تحدث في هذه استجابة لتحدي من مواد مختلفة (النظام الغذائي ، مستضد، والأدوية، والمستحضرات، وما إلى ذلك) 10،27 والمرض (السرطان والفيروسات والتهاب القولون، ومقاومة الأنسولين، الخ) 5-7. المكونات التي تم جمعها في الليمفاوية ويمكن أيضا أن تستخدم كذلك في تجارب إضافية. على سبيل المثال، يمكن للخلايا أن يكون مثقف 44، البروتينات الدهنية مجزأة والليمفاوية أو مكوناته مثل البروتينات الدهنية أو خلايا، وتحميلها مع علامات بما فيها الأدوية وradiolabels وتحقيقات الفلورسنت. هذه يمكن بعد ذلك يعاد حقنها الحيوانات المستفيدة لتقييم أكثر مباشرة وظيفتها، والتمثيل الغذائي، وإزالة و / أو أنماط التصرف الأنسجة 45-47. نموذج الليمفاوية الفئران القسطرة لديها العديد من المزايا على الغيرإيه في المختبر، في الموقع، في سيليكون، والنماذج الحية التي تم وصفها في المقدمة. الأهم من ذلك، القسطرة هو الأسلوب الوحيد الذي تمكن من الوصول المباشر إلى وحدة التخزين بالكامل من المكونات في السوائل الليمفاوية. عندما يقوم في يد عامل من ذوي الخبرة وهذا النموذج هو لا يمكن أن يتحقق قوية، استنساخه والتجريبية معدلات نجاح> 80٪. ومع ذلك، يمكن للتقنية جراحية يكون من الصعب السيطرة في البداية، خاصة في مختبر ليست على دراية تقنية.

عدة خطوات حاسمة لنجاح نموذج المساريقي الليمفاوية القسطرة. الأول هو الاختيار الصحيح للأدوات الجراحية ونوع قنية والتحضير. مختبرنا يستخدم قنية PE ذات أبعاد OD 0.8 * 0.5 ملم ID. ومع ذلك، شهدت مختبرات أخرى النجاح مع قنية PVC من نفس البعد 15. شطف غيض من قنية وقبل تمرغ في مكافحة تجلط الدم يساعد أيضا على منعانسداد، وتشكيل جلطات داخل، قنية بعد الإدراج (خطوة 3.13). الخطوة الأولى من العملية الجراحية أن بعض مشغلي تجد حرجة بشكل خاص هو رعاية لتنظيف طبقات من النسيج الضام والدهون فوق القناة الليمفاوية (الخطوة 3.10). وهذا يساعد على تجنب إدخال قنية بين الأنسجة والغدد القناة بدلا من في القناة الليمفاوية. ومع ذلك، هذه الخطوة التنظيف صعبة كما القناة الليمفاوية هش وسهل للتلف. بالنسبة للبعض، يتم الانتهاء من هذه الخطوة وإدخال قنية الأكثر بنجاح بمساعدة الميكروسكوب الجراحي على الرغم من أن البعض الآخر يجد المجهر ليست ضرورية. عند إدخال قنية في القناة في اتجاه وعمق الإدراج بالنسبة إلى الطرف المشطوف يتطلب بعض النظر من أجل منع قنية يجري المغطي بواسطة جدار الوعاء الدموي (الخطوة 3.12). كل مشغل يميل إلى إيجاد تفضيل الفردية الخاصة بهم. ومن المهم أيضا تجنب تشكيل فقاعة الهواء داخل كاليفورنيا nnula خلال الإدراج كما تنطبق الثغرات الهواء الخلفي الضغط على التدفق الحر للالليمفاوية (الخطوة 3.12). وأخيرا، يجب أن يكون تطبيق لاصقة البيطري لتأمين قنية في مكان ما دون نقطة الإدراج في القناة كما لاصقة وضعها مباشرة على الجزء العلوي من القناة يمكن أن يسبب السفينة إلى الانهيار وتسد طرف قنية (الخطوة 3.14).

أسهل دليل أولي حول ما إذا كان لعملية جراحية ناجحة هو معدل تدفق الليمفاوية. مرة واحدة قنية في مكان الليمفاوية يبدأ عادة في التدفق ببطء في 30 دقيقة الأولى، ويزيد ذلك الحين. عادة، ومعدلات التدفق لcannulations ناجحة في الفئران> 250 غرام و> 0.1 مل / ساعة في الساعة الأولى ثم تزيد إلى> 0.4 مل / ساعة في حالة مستقرة كما هو مبين في الشكل (4). وعلى الرغم من هذا بالطبع قد تختلف تبعا ل . حالة تجريبية من حيث استكشاف الأخطاء وإصلاحها، إذا لم الليمفاوية تتدفق من خلال قنية أو معدل تدفق منخفض وهذا قد يكون بسبب:

    [يب] = "ط">
  1. لم إدراج قنية بشكل صحيح في القناة
  2. قنية هي في القناة ولكن المغطي على جانب جدار الوعاء الدموي
  3. قنية هي في القناة ولكن المغطي بواسطة لاصقة تطبيقها في موقف غير صحيح
  4. قنية هي في القناة وفقاعة الهواء في قنية يتباطأ تدفق
  5. وشكلت جلطة داخل قنية

تفتيش دقيق عادة ما تكشف العامل الأساسي. إذا كان مشغل يعتقد لم يكن وضع قنية بشكل صحيح في المقام الأول (أي الليمفاوية كان يتدفق أبدا) ثم إعادة الإدراج هو ضروري. إذا قنية ويبدو أن في المكان الصحيح ثم العامل الأول هو للتحقق ما إذا كان فقاعة الهواء أو جلطة موجودة. سوف فقاعات الهواء تمر عموما من خلال قنية حيث التدفقات الليمفاوية وتدفق بطيء مؤقتا. ومن الممكن في بعض الأحيان لإزالة فقاعات الهواء أو الجلطات عن طريق رسم مرة أخرى على قنية باستخدام إبرة 25 G المرفقة، على سبيل المثال، حقنة 1 مل. إذا لم يكن هناك فقاعة الهواء أو جلطة يمكن أن يكون مفيدا لمحاولة إعادة تحديد المواقع الفئران و / أو تحويل أو سحب قنية قليلا. هذا يمكن في بعض الأحيان إعادة تنظيم قنية بحيث لا يتم حظر ضد جدار الوعاء الدموي. أحيانا إزالة لاصق مع أو بدون حركة صغيرة للقنية تمكن الليمفاوية في التدفق مرة أخرى أيضا. ومع ذلك، إذا فشل كل شيء آخر تحتاج قنية ليتم إعادة تركيبها. في تجربتنا التجارب هي أقل نجاحا عندما لم يتم إدخال قنية بشكل صحيح في المحاولة الأولى. ومع ذلك، والإنقاذ الجراحي هو ممكن. تعقيد آخر التي يمكن أن تنشأ صعوبة في القسطرة بسبب التباين التشريحي بين الفئران. على سبيل المثال، القناة الليمفاوية المساريقي يمر أحيانا في اتجاه حرج أو هناك هي القناة اللمفاوية التبعي على الجانب الآخر من الشريان المساريقي إلى أكبر متفوقة القناة الليمفاوية المساريقي. في التجارب التي تتطلب جمع كامل حجم الليمفاوية التي تتدفق من الأمعاء الدقيقة (كما هو الحالعند تقييم الدهن الكلي والنقل المخدرات من الأمعاء عن طريق الأوعية اللمفاوية)، يحتاج القناة الليمفاوية التبعي أن المغطي مثل أن جميع الليمفاوية موجه إلى القناة الليمفاوية متفوقة. وهذا أمر يصعب تحقيقه ولكن يمكن أن تكون محاولة من خلال ربط خياطة حول القناة التبعي أو قطع القناة الإكسسوارات وتسد عليه بمادة لاصقة البيطري (الخطوة 3.6). وجود القناة الليمفاوية التبعي هو واحد من العوامل الرئيسية التي تؤدي إلى فشل التجريبية في التجارب النقل المخدرات اللمفاوية. إذا لم يتم المغطي السفينة التبعي تماما، وتدفق الليمفاوية والدهون ونقل المخدرات هي أقل بكثير مما كان متوقعا.

في بروتوكول المعروضة هنا لا يزال تخدير الحيوان طوال فترة جمع الليمفاوية. نموذج الفئران تخدير (بدلا من نماذج واعية هو موضح أدناه) يزيد الإنتاجية التجريبية مثل جراحة ويمكن إجراء التجربة أكثر من واحدة بدلا من عدة أيام ونجاح ص الجراحيةأكل هو أكبر لأنه من الأسهل للحفاظ على قنية المباح في الحيوانات يجمد. التخدير يمكن أن تقلل من الناحية النظرية إفراغ المعدة، ومعالجة الدهون في الامعاء وتدفق الليمفاوية والنقل. في تجربتنا، ومع ذلك، الدهون اللمفاوي والنقل المخدرات مماثلة في الفئران تخدير تناول الدواء مباشرة في الاثني عشر (لتجاوز المعدة إفراغ) داخل المركبات قبل هضمها وفرقت مسبقا (مثل نظم، الأحماض الدهنية وأحادي الغليسريد micellar فرقت مع السطحي ) بالمقارنة مع الفئران واعية تناول الدواء من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم إلى المعدة في الدهون الثلاثية 21،23،27 ما يعادلها. في الواقع، وقد أجريت غالبية التجارب النقل المخدرات الليمفاوية المعوية في مختبرنا في السنوات ال 10 الماضية في النموذج تخدير بسبب ارتفاع الإنتاجية التي يمكن تحقيقها. في هذه التجارب قمنا غالبا ما تدار المخدرات في التركيبات التي تحتوي على الأحماض الدهنية (مثل حمض الأوليك) والسطحي 43.ويتم تخليق الأحماض الدهنية في الدهون الثلاثية السابقة لضمهما إلى البروتينات الدهنية الليمفاوية المعوية وهذا يتطلب مصدر المكونات لتشكل العمود الفقري الجلسرين من الدهون الثلاثية (أي 2-أحادي الغليسريد أو الجلسرين-3-الفوسفات). هذا يشير إلى أن إدارة الأحماض الدهنية في حالة عدم وجود مصدر الجلسرين قد يؤدي إلى انخفاض النقل اللمفاوي. إدارة الأحماض الدهنية، ومع ذلك، يمكن حساب المباشر للمساهمة خارجية المنشأ تدار الأحماض الدهنية والدهون الذاتية على الدهون اللمفاوي والنقل المخدرات 43. بالإضافة إلى ذلك، 2-أحادي الغليسريد مكلفة وغير مستقرة عموما كما isomerises بسهولة إلى 1-أحادي الغليسريد التي تساعد على عملية هضم لالجلسرين في لمعة الأمعاء. في دراسات نشرت هنا علينا أن نظهر أيضا أن الدهون اللمفاوي والنقل المخدرات ما يعادل التالية إدارة halofantrine المخدرات نموذج مع الأحماض الدهنية (مثل حمض الأوليك) والسطحي (الصفراء الملح) صياغة سواء في العلاقات العامةesence أو عدم وجود مصدر الجلسرين 2-monoolein (الجدول 1). مصادر داخلية من الجلسرين بالتالي تظهر كافية لدعم تدفق الليمفاوية يعادل والدهون ونقل المخدرات التالية إدارة هذا النموذج المخدرات مع الأحماض الدهنية (مثل حمض الأوليك) في حالة عدم وجود مصدر الجلسرين. وهذا يوفر الثقة بأن البيانات النقل اللمفاوية تمثيلية يمكن الحصول مع بسيطة تركيبات الأحماض الدهنية.

تم تمديد نموذج تخدير بسهولة إلى نموذج واعية عند الحاجة. في النماذج واعية يمكن gavaged الصيغ مباشرة في المعدة أو غرست في الاثني عشر أو عن طريق الوريد، ويمكن إجراء المقارنات المباشرة للدراسات الدوائية التي أجريت في غير الليمفاوية مقنى الحيوانات واعية والنتائج يمكن أن تعتبر أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية. فترة زمنية أطول المسموح بها في الحيوانات واعية أيضا لديه ميزة تسمح للجمع لمحات الدوائية أكثر اكتمالا للدكتورتركيزات ميكروغرام في الدم، بينما في التجارب تخدير، وملامح الدم وغالبا ما تكون غير مكتملة، وخاصة لفترة طويلة المخدرات بعمر نصف. كما هو موضح أعلاه، ومع ذلك، فإن نسبة النجاح للدراسات الليمفاوية مقنى واعية هو أقل والتجارب يستغرق وقتا أطول لإكمال. هناك نوعان من النماذج الليمفاوية القسطرة واعية وصفها في الأدب. في نماذج ضبط النفس واعية 15، في أعقاب جراحة القسطرة الليمفاوية، يتم تشغيل الحيوان ببساطة على جبهتها ووضعها في ضبط النفس المناسب للفترة المتبقية من التجربة مع قنية الليمفاوية externalised وإدراجها في أنبوب جمع. ثم يتم السماح للحيوان ليستعيد وعيه والتعافي من الجراحة إجراء O / N. نسبة النجاح مع هذا النموذج هو جيد جدا في يد المشغلين ذوي الخبرة ولكن قد يكون من الصعب الحصول على تصريح الأخلاق لكبح جماح الحيوانات لفترة طويلة من الوقت اللازم لجمع الليمفاوية. نموذج بديل حيث يتم جمعها الليمفاويةمن الفئران واعية والتحرك بحرية. وقد تم تفصيل هذا النموذج من قبل 25. في هذا النموذج يتم إدراج قنية طويلة في القناة الليمفاوية والاثني عشر والشريان السباتي المساريقي. ثم يتم عبر نفق على قنية تحت الجلد، exteriorized في الجزء الخلفي من الرقبة وضعها من خلال نظام قطب. يتم وضع الفئران في تسخير تعلق على قطب وسمح ليستعيد وعيه وللتعافي من عملية جراحية في O / N. الحيوان ديه حرية الحركة داخل قفص الأيض والعينات اللمفاوية والدم يمكن جمع من قنية externalised خارج القفص.

يبقى المساريقي القسطرة الليمفاوية الأداة الوحيدة التي تمكن من تقييم مباشر لمكونات الليمفاوية في دولتهم الوليدة. وغالبا ما وصفت الليمفاوية القسطرة في الفئران كما الجراحة هي أقل تعقيدا من الحيوانات الصغيرة والكبيرة، ونموذج أقل تكلفة من الحيوانات الكبيرة والنتائج تظهر مقارنة معقول عبر الأنواع 27. وضع الفئرانل يمكن تعديلها وفقا للحاجة التجريبية ونسبة نجاح عالية في أيدي المشغلين ذوي الخبرة. ويمكن أيضا أن يقترن هذا النموذج مع الآخر في المختبر أو في الدراسات المجراة لدراسة بالتفصيل عملية الأيض أو وظيفة مكونات الليمفاوية المعوية. مرة واحدة أنشأ الليمفاوية المساريقي نموذج الفئران مقنى وبالتالي أداة قوية لتقييم تركيز، والنقل، وظيفة والتمثيل الغذائي من المعلمات المختلفة التي تمر مباشرة من الأمعاء والجهاز الليمفاوي (وفي كثير من الحالات تتدفق في النهاية إلى الدوران الجهازي).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile saline Baxter healthcare AHB 1307 Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water Any Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) Livingstone International JJ60243L Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Betadine solution Livingstone International BU0510 Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  KETA I 1 http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  TRO-3828 http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) PROVET VICTORIA  VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone PROVET VICTORIA  24529 Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL) Sigma Pharmaceuticals 337220 http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E1644 Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. 
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm Microtube extensions PE8050 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm Microtube extensions PE9658 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m
Ruler Any Any brand can be used
Markers Any Any brand can be used
Cigarette lighter Any Any brand can be used
Veterinary adhesive Any Any brand can be used
23 gauge needles Livingstone International DN23GX0.75LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles Livingstone International DN25GX1.0LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1 ml syringe Livingstone International T3SS01TA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
10 ml syringe Livingstone International T3SS10SA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Gauze swabs Livingstone International GSC075 Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Cotton buds Livingstone International CTAST075DP Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Heating pad Ratek WT1 Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light Harvard Apparatus 72-0215 with 72-0267 Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope Zeiss 495005-0014-000 Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture Livingstone International DTSK163019F4 Any brand can be used. Example here is  

3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Scalpel blades Fine Science Tools (FST) 10020-00 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle Fine Science Tools (FST) 10004-13 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors Fine Science Tools (FST) 14060-09 Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip Fine Science Tools (FST) 11001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors Fine Science Tools (FST) 15000-08 Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x Forceps with straight serated tip Fine Science Tools (FST) 11650-10 Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-10 Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps Fine Science Tools (FST) 11063-07 Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats Fine Science Tools (FST) 13010-12 Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder Fine Science Tools (FST) 12001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp Fine Science Tools (FST) 18050-28 Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid Sigma Aldrich O1008 When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid Perkin  NEC317050UC  Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate Sigma Aldrich T4009 Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine Glaxo Smith Kline Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich 71507 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 71643 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barrowman, J. A., Tso, P. Gastrointestinal lymphatics. Comprehensive Physiology. , 1733-1777 (2010).
  2. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
  3. Mossel, E. C., Ramig, R. F. A lymphatic mechanism of rotavirus extraintestinal spread in the neonatal mouse. J Virol. 77 (22), 12352-12356 (2003).
  4. Pantaleo, G., et al. Hiv-Infection Is Active and Progressive in Lymphoid-Tissue during the Clinically Latent Stage of Disease. Nature. 362 (6418), 355-358 (1993).
  5. Chakraborty, S., Zawieja, S., Wang, W., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, R94-R102 (2010).
  6. Dixon, J. B. Lymphatic lipid transport: sewer or subway. Trends Endocrinol Metab. 21 (8), 480-487 (2010).
  7. Weid, P. -Y., Rehal, S., Ferraz, J. G. Role of the lymphatic system in the pathogenesis of Crohn's disease. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (4), 335-341 (2011).
  8. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PloS one. 4 (12), e8442 (2009).
  9. Ji, Y., et al. Activation of rat intestinal mucosal mast cells by fat absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1292-G1300 (2012).
  10. Kohan, A., Yoder, S., Tso, P. Lymphatics in intestinal transport of nutrients and gastrointestinal hormones. Ann N Y Acad Sci. 1207, Suppl 1. E44-E51 (2010).
  11. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Targeted drug delivery to lymphocytes: a route to site-specific immunomodulation. Mol Pharm. 7 (6), 2297-2309 (2010).
  12. Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin Exp Immunol. 92 (2), 317-322 (1993).
  13. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update. Adv Drug Deliv Rev. 60 (6), 702-716 (2008).
  14. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. Am J Physiol. 261 (3 Pt 1), G530-G538 (1991).
  15. Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
  16. Porter, C. J., Trevaskis, N. L., Charman, W. N. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nat Rev Drug Discov. 6 (3), 231-248 (2007).
  17. Trevaskis, N. L., et al. The role of the intestinal lymphatics in the absorption of two highly lipophilic cholesterol ester transfer protein inhibitors (CP524,515 and CP532,623). Pharm Res. 27 (5), 878-893 (2010).
  18. Choo, E. F., et al. The Role of Lymphatic Transport on the. Systemic Bioavailability of the Bcl-2 Protein Family Inhibitors Navitoclax (ABT-263) and ABT-199. Drug Metabolism and Disposition. 42 (2), 207-212 (2014).
  19. Han, S., et al. Targeted delivery of a model immunomodulator to the lymphatic system: comparison of alkyl ester versus triglyceride mimetic lipid prodrug strategies. J Control Release. 177, 1-10 (2014).
  20. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. J Lab Clin Med. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  21. Porter, C. J., Charman, S. A., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the triple-cannulated anesthetized rat model: effect of lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85 (4), 351-356 (1996).
  22. Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (2), 115-120 (2004).
  23. Porter, C. J., Charman, S. A., Humberstone, A. J., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the conscious rat when administered as either the free base or the hydrochloride salt: effect of lipid class and lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85 (4), 357-361 (1996).
  24. Caliph, S. M., Charman, W. N., Porter, C. J. Effect of short-, medium-, and long-chain fatty acid-based vehicles on the absolute oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of halofantrine and assessment of mass balance in lymph-cannulated and non-cannulated rats. J Pharm Sci. 89 (8), 1073-1084 (2000).
  25. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Adv Drug Deliv Rev. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  26. Noguchi, T., Charman, W. N. A., Stella, V. J. Lymphatic Appearance of Ddt in Thoracic or Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rats. International Journal of Pharmaceutics. 24 (2-3), 185-192 (1985).
  27. Trevaskis, N. L., et al. A mouse model to evaluate the impact of species, sex, and lipid load on lymphatic drug transport. Pharm Res. 30 (12), 3254-3270 (2013).
  28. Kota, J., et al. Lymphatic absorption of subcutaneously administered proteins: influence of different injection sites on the absorption of darbepoetin alfa using a sheep model. Drug Metab Dispos. 35 (12), 2211-2217 (2007).
  29. McHale, N. G., Adair, T. H. Reflex modulation of lymphatic pumping in sheep. Circ Res. 64 (6), 1165-1171 (1989).
  30. White, D. G., Story, M. J., Barnwell, S. G. An Experimental Animal-Model for Studying the Effects of a Novel Lymphatic Drug Delivery System for Propranolol. International Journal of Pharmaceutics. 69 (2), 169-174 (1991).
  31. Khoo, S. M., Edwards, G. A., Porter, C. J., Charman, W. N. A conscious dog model for assessing the absorption, enterocyte-based metabolism, and intestinal lymphatic transport of halofantrine. J Pharm Sci. 90 (10), 1599-1607 (2001).
  32. Kararli, T. T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals. Biopharm Drug Dispos. 16 (5), 351-380 (1995).
  33. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. J Biomed Opt. 17 (8), 086005 (2012).
  34. Dahan, A., Hoffman, A. Evaluation of a chylomicron flow blocking approach to investigate the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs. Eur J Pharm Sci. 24 (4), 381-388 (2005).
  35. Xiao, C., Lewis, G. F. Regulation of chylomicron production in humans. Biochim Biophys Acta. 1821 (5), 736-746 (2012).
  36. Seeballuck, F., Ashford, M., O'Driscoll, C. The Effects of Pluronic® Block Copolymers and Cremophor EL on Intestinal Lipoprotein Processing and the Potential Link with P-Glycoprotein in Caco-2 Cells. Pharmaceutical Research. 20 (7), 1085-1092 (2003).
  37. Levy, E., Mehran, M., Seidman, E. Caco-2 cells as a model for intestinal lipoprotein synthesis and secretion. The FASEB Journal. 9 (8), 626-635 (1995).
  38. Cartwright, I. J., Higgins, J. A. Isolated rabbit enterocytes as a model cell system for investigations of chylomicron assembly and secretion. Journal of Lipid Research. 40 (7), 1357-1365 (1999).
  39. Dixon, J. B., Raghunathan, S., Swartz, M. A. A Tissue-Engineered Model of the Intestinal Lacteal for Evaluating Lipid Transport by Lymphatics. Biotechnology and Bioengineering. 103 (6), 1224-1235 (2009).
  40. Gershkovich, P., et al. The role of molecular physicochemical properties and apolipoproteins in association of drugs with triglyceride-rich lipoproteins: in-silico prediction of uptake by chylomicrons. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 61 (1), 31-39 (2009).
  41. Gershkovich, P., Hoffman, A. Uptake of lipophilic drugs by plasma derived isolated chylomicrons: Linear correlation with intestinal lymphatic bioavailability. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 26 (5), 394-404 (2005).
  42. Holm, R., Hoest, J. Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer. International Journal of Pharmaceutics. 272 (1-2), 189-193 (2004).
  43. Trevaskis, N. L., Porter, C. J., Charman, W. N. Bile increases intestinal lymphatic drug transport in the fasted rat. Pharm Res. 22 (11), 1863-1870 (2005).
  44. Miura, S., et al. Increased proliferative response of lymphocytes from intestinal lymph during long chain fatty acid absorption. Immunology. 78 (1), 142-146 (1993).
  45. Caliph, S. M., et al. The impact of lymphatic transport on the systemic disposition of lipophilic drugs. J Pharm Sci. 102 (7), 2395-2408 (2013).
  46. Caliph, S. M., Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Intravenous dosing conditions may affect systemic clearance for highly lipophilic drugs: implications for lymphatic transport and absolute bioavailability studies. J Pharm Sci. 101 (9), 3540-3546 (2012).
  47. Trevaskis, N. L., et al. Tissue uptake of DDT is independent of chylomicron metabolism. Arch Toxicol. 80 (4), 196-200 (2006).

Tags

علم المناعة، العدد 97، الأمعاء، المساريقي، اللمفاوي، الليمفاوية، الشريان السباتي، القسطرة، قنية، الجرذ، المخدرات، الدهن، الامتصاص، جراحة
المساريقي الليمفاوية القناة مقنى نموذج الفأر: بالتطبيق على تقييم المعوية اللمفاوي النقل المخدرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trevaskis, N. L., Hu, L., Caliph, S. … More

Trevaskis, N. L., Hu, L., Caliph, S. M., Han, S., Porter, C. J. H. The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport. J. Vis. Exp. (97), e52389, doi:10.3791/52389 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter