Summary

De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

Published: March 06, 2015
doi:

Summary

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

Abstract

De intestinale lymfestelsel speelt een belangrijke rol in vochttransport, lipide absorptie en het immuunsysteem. Lymfe stroomt direct uit de dunne darm via een reeks lymfevaten en knooppunten die convergeren de superieure mesenterische lymfklieren duct. Canulatie van de mesenteriale lymfeklieren duct stelt derhalve het verzamelen van mesenteriale lymfe stroomt uit de darm. Mesenterium bestaat uit een cellulaire fractie van immuuncellen (99% lymfocyten), waterfractie (vloeistof, peptiden en eiwitten, zoals cytokines en hormonen darm) en lipoproteïne fractie (lipiden, lipofiele moleculen en apo-eiwitten). Het mesenterium kanaal infusen model kan derhalve worden gebruikt om de concentratie en de transportsnelheid van een aantal factoren van de darm via het lymfestelsel meten. Wijzigingen in deze factoren in reactie op verschillende problemen (bijvoorbeeld diëten, antigenen, drugs) en ziekte (bijvoorbeeld inflammatoire darmziekte, HIV, diabetes) kan ook be bepaald. Een gebied van de uitbreiding van belang is de rol van lymfatische vervoer in de absorptie van oraal toegediende lipofiele geneesmiddelen en pro-geneesmiddelen die associëren met intestinale lipide absorptiewegen. Hier beschrijven we, in detail, een mesenteriale lymfe duct canule rat model dat de evaluatie van de snelheid en mate van lipide en drugs transport via het lymfestelsel maakt voor enkele uren na intestinale levering. De werkwijze is gemakkelijk aan het meten van andere parameters lymfe. Wij bieden gedetailleerde beschrijvingen van de moeilijkheden die zich kunnen voordoen bij het vaststellen van dit complexe chirurgische methode, evenals representatieve gegevens van mislukte en geslaagde experimenten om instructie over hoe om experimentele succes te bevestigen en de verkregen gegevens te interpreteren bieden.

Introduction

Lymfe stroomt van de dunne darm via een unidirectionele proces beginnend op één melkvaten die zijn opgenomen in elke kleine darmvlokken 1. Melkvaten zijn relatief doorlaatbaar voor vocht, macromoleculen en cellen en de lymfe formatie dus begint met de komst van deze factoren in melkvaten. De eerste lymfe in de melkvaten stroomt vervolgens uit de darm via een netwerk van lymfatische haarvaten, verzamelen (afferente) lymfevaten, een reeks mesenteriale lymfeklieren en uiteindelijk de post-nodale (efferente) lymfevaten. Binnen de knooppunten, lymfe gaat door een reeks medullaire sinussen waarbij uitwisseling plaatsvindt met knooppunt resident immuuncellen en materiaal die het knooppunt uit het bloed. Alle lymfe stroomt uit de dunne darm uiteindelijk convergeert naar de efferente superieure mesenteriale lymfe kanaal en vervolgens de cisterna chyli. De Cisterna chyli verzamelt tevens lymfedrainage de caudale perifere weefsels, INTESTinal, lever- en lumbale regio's en voegt zich bij de thoracale lymfe kanaal samen met lymfe uit het mediastinum en craniale delen van het lichaam. De thoracale lymfe kanaal uitmondt lymfe rechtstreeks in het veneuze systeem bij de verbinding van de linker interne halsader en subclavia. Faciliteert de hier beschreven protocol, waarin de collectie van lymfe direct in staat stelt van de superieure mesenteriale lymfe kanaal, waardoor de analyse van de verschillende factoren die rechtstreeks op doorreis vanuit de darm naar de systemische (algemene) circulatie via de intestinale lymfestelsel.

De belangrijkste fysiologische functies toegewezen aan de intestinale lymfestelsel zijn om de vochtbalans te behouden, om lipide en lipofiel molecuul absorptie te vergemakkelijken, en om passende immuunreacties 1 mogelijk te maken. Tumorcellen en virussen ook verspreiden via de intestinale lymfevaten 2-4 en belangrijke wijzigingen voordoen in de lymfevaten in verschillende inflammatoire en metabolische ziekten 5-7. Kannulation van de mesenteriale lymfe kanaal om de lymfe te verzamelen binnen het mesenterium maakt een analyse van bulk vloeistofstroom via de intestinale lymfevaten evenals kwantificering van de concentratie en het vervoer tarief van verschillende cellen en moleculen. Wijzigingen in de concentratie of doorvoer van die factoren als reactie op verschillende uitdagingen (bijvoorbeeld diëten, antigenen, drugs) en ziektemodellen (bijvoorbeeld colitis, HIV, diabetes) kan ook worden beoordeeld. Hoewel het onmogelijk is elke lymfe component die kan worden geanalyseerd en vergeleken hier uitgebreid beschreven, mesenterische lymfklieren simplistisch uit waterige, lipiden en cellulaire fasen. Onderdelen van belang in de waterige fase omvatten peptiden en eiwitten zoals antigenen of tolerogenen 8, immuun boodschappers zoals cytokinen en mestcel mediatoren 9 en metabole mediatoren zoals incretines 10. De cellulaire fractie van de post-nodale mesenteriale lymfeklieren bestaat bijna volledig (meer dan 99%) van lymphocytes 11. Verscheidene immuuncellen (dendritische cellen, mestcellen, etc.) voert de pre-nodale mesenterische lymfevaten maar binnen het knooppunt 12 blijven. Indien de cellen in afferente lymfe van belang, is het mogelijk om deze cellen te verzamelen door verwijdering van de mesenterische lymfeklieren enkele dagen voor canulatie van de mesenterische lymfklieren kanaal 12. Zo de afferente en efferente lymfevaten zijn direct verbonden en de lymfe cellen in afferente lymfe direct doorgeven aan de mesenterische lymfklieren kanaal. De doorvoer en fenotype van verschillende immuuncellen die door de intestinale lymfevaten kan dus worden onderzocht. Wellicht wordt aangevoerd verzamelen mesenterium actueel meest voorkomende reden is echter de intestinale verwerking, opname en het transport van voedingslipiden en lipofiele moleculen 10 bestuderen.

Na inslikken wordt voedingslipiden gedigereerd (bijvoorbeeld van triglyceride vetzuren en monoglyceride, Phospholipid vetzuren en lysofosfolipide en cholesterol ester tot vetzuur en cholesterol, etc.) en gedispergeerd in het darmlumen in kleine micellen en vesiculaire structuren door de toevoeging van amfifielen van gal (fosfolipiden, cholesterol en galzouten) en de werking van pancreasenzymen 10,13. Vanaf hier zijn ze opgenomen in enterocyten. Een deel van de geabsorbeerde componenten worden opnieuw veresterd aan triglyceriden, fosfolipiden en cholesterol esters in het absorberende cellen (enterocyten) vormen. Deze opnieuw veresterd lipiden zijn opgebouwd uit een combinatie van exogeen ingenomen lipidecomponenten en endogene lipide componenten van de gal uitgescheiden, mucosale lipidendepots of intestinale bloedtoevoer 13. Vanaf hier de veresterde lipiden zijn ofwel opgeslagen in enterocyten of geassembleerd tot intestinale lipoproteïnen (chylomicronen, zeer lage dichtheid lipoproteïnen (VLDL)) samen met diverse apoproteins en andere lipofiele moleculen ( <em> bijvoorbeeld, vitaminen) 10,13. Na enterocyten verlaten, worden lipoproteïnen bijzonder van de darm getransporteerd naar de systemische circulatie via de mesenterische lymfatische systeem de intestinale melkvaten meer doorlaatbaar voor binnenkomst dan de intestinale bloedvaten. Een deel van de geabsorbeerde lipiden componenten worden ook via het bloed haarvaten en poortader als één niet-lipoproteïne geassocieerd vervoerd vanuit de darm naar de systemische circulatie, moleculen 14. In het algemeen echter, de poortader transportroute slechts een belangrijke speler in de absorptie van korte en middellange ketenlengte lipiden.

De verzameling mesenterium maakt het aldus mogelijk de beoordeling van het transport van lipoproteïnen en bijbehorende onderdelen (lipiden, lipofiele moleculen, apo-eiwitten) uit de darm. De lipoproteïnen kan worden gekwantificeerd en gekarakteriseerd met als voordeel dat het mesenterium lipoproteïnen in het algemeen in een nascent staat aangezien ze niet uitgebreid door systemische enzymen gemodificeerd zoals lipoproteïne lipase 15. Terwijl de mesenteriale lymfeklieren model gecannuleerd rat is misschien historisch gezien het meest uitgebreid beschreven voor de analyse van lipiden / lipoproteïne transport vanuit de darm, een gebied van de uitbreiding van belang is de rol van lymfevaten bij het ​​transport van lipofiele geneesmiddelen, pro-drugs en ​​andere lichaamsvreemde stoffen 13,16 dat de focus van de hier beschreven model. Lipofiele geneesmiddelen (over het algemeen mensen met een log P> 5 en oplosbaarheid in lange-keten triglyceriden> 50 mg / g, hoewel uitzonderingen zijn schijnbare) 17,18, prodrugs 19 en andere lichaamsvreemde stoffen 13,16 kan de toegang tot de intestinale lymfevaten ofwel passief of door te krijgen actief te integreren in intestinale lipoproteïne transportroutes 19.

De rat mesenteriale lymfe canulatie techniek heeft dus vele toepassingen. Bollman et al. Beschreef een eerste techniqUE het mesenterium kanaal bij ratten canule in 1948 20. Sindsdien is een aantal variaties op het model beschreven. Zo kan verzamelen optreden wanneer de rat wordt verdoofd met verschillende anesthetica 21,22 of in de bewustzijnstoestand terwijl tegengehouden 15 of vrij bewegende 23,24. Ratten worden toegediend verschillende rehydratatie oplossingen en andere stoffen zoals lipiden en geneesmiddelformuleringen met verschillende snelheden in de maag, darm of parenteraal (gewoonlijk 0-5 ml / h) 25. In sommige studies de thoracale lymfklieren kanaal plaats mesenterium duet canule te schatten transport van de darm via de lymfevaten hoewel dit doorvoer kunnen overschatten van de dunne darm, afhankelijk van de factor van belang, zoals de thoracale lymfe kanaal ontvangt ook lymfe uit andere regio 22,26. Lymfe canule modellen zijn ook beschreven in verschillende andere soorten waaronder muizen 15,27, mini-pigs 12, 28,29 schapen, varkens 30 en 31 honden. De ratmodel is het meest consistent en geciteerd. Gedetailleerde protocollen voor canulatie van de mesenteriale lymfe kanaal gevolgd door verzameling van lymfe in het bewuste 25 of verdoofd 22 ratten en muizen 15,27 zijn eerder gepubliceerd en de geïnteresseerde lezer wordt doorverwezen naar deze protocollen. Dit protocol is de eerste om de techniek in een gevisualiseerde formaat tonen.

De lymfe gecanuleerde rat model heeft voordelen ten opzichte van grotere diermodellen in termen van kosten, het gemak van de operatie en ethische overwegingen. In vergelijking met het muismodel, mesenterium canulatie chirurgie is ook makkelijker in de rat hoewel het muismodel kunnen meer gedetailleerde studies in transgene dieren 27. Toch zijn er enkele beperkingen van de rat model, met name die geassocieerd met verschillen in fysiologie, deze grens extrapolation andere preklinische en klinische situaties. Bijvoorbeeld, in de rat galstroom is constant en onafhankelijk van de voedselinname, terwijl hogere soorten voedsel of lipiden stimuleert galstroom 32. Dit creëert uitdagingen verkrijgen representatief pre- en postprandiale omgevingen ratten die weerspiegelen wat wordt gezien in grotere soorten en mensen. Voor drug delivery studies, kunnen grotere soorten ook de voorkeur bij de beoordeling van lymfatische transport na de toediening van realistische menselijke toedieningsvormen 25. In een recente studie, werden lipiden transportsnelheden in de mesenterische lymfklieren vond vergelijkbaar tussen soorten (muis, rat, hond) na toediening van een equivalente massa en type lipide die enig vertrouwen extrapoleren lipide datatransport tussen soorten 27 verschaft zijn. Echter, het vervoer van een model lipofiel geneesmiddel, halofantrine, gerangschikt in de orde van grootte van dieren (dwz, hond> rat> muis). Een schaalfactor kan dus nodig zijn om extrapolate lymfatische gegevens drug vervoer van rat naar andere soorten.

Een beperking van lymfe cannulatie modellen, in het algemeen, dat passieve lymfe rechtstreeks vanaf een lymfevat kan lymfestroom en transport niet, omdat lymfevaten tegen een drukgradiënt die wordt veranderd wanneer het vaartuig canule 33 werken. De lymfe canulatie model kan ook moeilijk zijn om vast te stellen in laboratoria die niet vertrouwd zijn met de techniek zijn. Alternatieve modellen zijn derhalve beschreven. Bijvoorbeeld, de doorvoer factoren via de intestinale lymfestelsel, zoals lipoproteïnen en lipofiele moleculen is indirect onderzocht door bloedafname. Een dergelijk model vergelijkt men bloedconcentraties van lipiden en / of geneesmiddelen na orale toediening in aanwezigheid en afwezigheid van remmers (bijvoorbeeld colchicine, Pluronic L81, cycloheximide) van intestinale lipoproteïne productie die lymfatisch transport 34 blokkeren. Een voordeelvan modellen die lymfatische transport kwantificeren indirect via de bloedafname is dat het in staat stelt een aantal evaluatie van lymfatische vervoer bij de mens als invasieve chirurgie niet nodig is 35. Echter, remmers van lymfatisch transport niet specifiek en factoren die via de lymfevaten getransporteerd worden verdund en gewijzigd in de systemische circulatie met dergelijke beoordelingen compliceert. In vitro alternatieven zijn ook beschreven. Bijvoorbeeld zijn Caco-2 cellen of geïsoleerde enterocyten culturen gebruikt bestuderen in meer detail de intestinale secretie van moleculen die de lymfevaten 36-38 voeren. Een geavanceerde in vitro model dat meer representatief voor de humane intestinale micro werd recent beschreven 39. In dit model een lymfatische endotheliale cellaag samen gekweekt met Caco-2-cellen die meer gedetailleerde analyse van de overdracht van stoffen uit de darm naar de lymfevaten mogelijk maakt. In vitro cel systemen ontbreekt uitwisseling flow en overdragen dwz interconnectie met een intestinale lumen en de onderliggende bloed en lymfatische vasculaire aanbod. In een alternatieve benadering, Kassis et al. Werd een dual-channel (high-speed bright-field video en fluorescentie) in situ imaging systeem dat kwantitatieve vergelijkingen tussen vaartuig contractie, lymfestroom en fluorescerende lipide concentraties in mesenteriale lymfevaten 33 mogelijk maakt. Een voordeel van dit model op de bovengenoemde in vitro systemen is dat daardoor nauwkeurig volgen van de doorgang van immuuncellen door de lymfevaten. Absolute metingen van massa lipide (of drugs) vervoer zijn echter nog niet vastgesteld met behulp van beeldvormende technieken. In vitro en in silico benaderingen om specifiek te voorspellen de mate van lipofiele vervoer geneesmiddel via de intestinale lymfevaten zijn ook gepubliceerd 40-42. Bijvoorbeeld, de ex vivo affiniteit van verschillende compounds voor plasma chylomicronen bleek redelijk goed te correleren met hun lymfatische transport in vivo 41. Vervolgens dezelfde groep opgericht een in silico model om drug affiniteit voorspellen voor chylomicronen op basis van meerdere fysisch-chemische eigenschappen 40. Holm et al. Stelde ook relatief complex in silico model regelrechte voorspellen lymfatisch transport van lipofiele verbindingen op basis van moleculaire descriptoren 42. Deze modellen kunnen een nuttige benadering voor de omvang van lymfatisch transport van onbekende geneesmiddelen voorspellen verschaffen. Validatie van de modellen met een breed scala van drugs en over verschillende labo's zullen echter worden verplicht hun nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te bevestigen.

Canulering van de mesenterische lymfklieren kanaal blijft dus de enige manier om de inhoud van lymfe aftappen van de dunne darm en de doorvoer snelheid van de complexe reeks factoren (cellen, eiwitten direct onderzoekenpeptiden, lipiden, drugs) in lymfe in een in vivo situatie. Hierin beschrijven we een protocol voor canulatie van de mesenteriale lymfe duct en halsslagader dat het verzamelen van mesenteriale lymfe en systemische bloed van verdoofd ratten maakt. Representatieve gegevens tonen hoe het model kan worden gebruikt om lipide en geneesmiddel transport van de darm te onderzoeken via de mesenteriale lymfestelsel. Dit wordt gevolgd door een bespreking van problemen die kunnen worden ondervonden bij het vaststellen van het model en een gids voor probleemoplossing. Eenmaal gevestigd het model is een krachtig hulpmiddel om intestinale lymfatische vervoer te onderzoeken.

Protocol

De in dit manuscript beschreven studies werden goedgekeurd door de lokale dier ethische commissie en werden uitgevoerd in overeenstemming met de Australische en Nieuw-Zeelandse Raad voor de verzorging van dieren in onderzoek en onderwijs richtlijnen. Voorafgaand aan het begin van elk dier procedure, zorgen dat de juiste toestemming is verkregen via de lokale instelling / organisatie. Zoals met alle dierlijke operaties, ervoor te zorgen dat de operatie wordt uitgevoerd door daarvoor opgeleide operators, onder aseptische …

Representative Results

De resultaten van een representatief experiment kwantificeerbaar de cumulatieve mate en snelheid van lipide en geneesmiddel transport via het lymfestelsel volgende intestinale aflevering met behulp van de mesenterische lymfklieren canule model worden in figuur 4 en figuur 5. In dit experiment, 200 ug van het model lipofiele en 7,1 mg 2-monooleïne gedispergeerd in 5,6 ml van 5 mM natrium taurocholaat in fosfaatgebufferde – drug halofantrine is in een formulering die 40 mg oliezuur (5 uC…

Discussion

De rat mesenteriale lymfe canulatie model maakt directe kwantificering van de concentratie en de snelheid van het vervoer van verschillende cellen en moleculen (zoals lipiden en drugs) uit de darm naar de lymfe en de aanpassingen aan deze die optreden in reactie op uitdagen van verschillende stoffen (dieet antigeen, drugs, formuleringen etc.) 10,27 en ziekten (kanker, virussen, colitis, insulineresistentie, etc.) 5-7. De in lymfe verzameld componenten kunnen ook verder worden gebr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding from the Australian Research Council (ARC) and National Health and Medical Research Council (NHMRC) is gratefully acknowledged.

Materials

Sterile saline Baxter healthcare AHB 1307 Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water Any Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) Livingstone International JJ60243L Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Betadine solution Livingstone International BU0510 Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  KETA I 1 http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  TRO-3828 http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) PROVET VICTORIA  VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone PROVET VICTORIA  24529 Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL) Sigma Pharmaceuticals 337220 http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E1644 Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. 
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm Microtube extensions PE8050 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8×0.5 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm Microtube extensions PE9658 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96×0.58 mm, 30 m
Ruler Any Any brand can be used
Markers Any Any brand can be used
Cigarette lighter Any Any brand can be used
Cyanoacrylate glue Any Any brand can be used
23 gauge needles Livingstone International DN23GX0.75LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles Livingstone International DN25GX1.0LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1 ml syringe Livingstone International T3SS01TA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
10 ml syringe Livingstone International T3SS10SA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Gauze swabs Livingstone International GSC075 Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5×7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Cotton buds Livingstone International CTAST075DP Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Heating pad Ratek WT1 Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light Harvard Apparatus 72-0215 with 72-0267 Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope Zeiss 495005-0014-000 Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture Livingstone International DTSK163019F4 Any brand can be used. Example here is * 
Email this item to my friend
3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Scalpel blades Fine Science Tools (FST) 10020-00 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle Fine Science Tools (FST) 10004-13 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors Fine Science Tools (FST) 14060-09 Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip Fine Science Tools (FST) 11001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8×1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors Fine Science Tools (FST) 15000-08 Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x Forceps with straight serated tip Fine Science Tools (FST) 11650-10 Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-10 Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps Fine Science Tools (FST) 11063-07 Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats Fine Science Tools (FST) 13010-12 Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example here is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder Fine Science Tools (FST) 12001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp Fine Science Tools (FST) 18050-28 Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9×1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid Sigma Aldrich O1008 When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid Perkin  NEC317050UC  Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate Sigma Aldrich T4009 Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine Glaxo Smith Kline Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich 71507 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 71643 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU

References

  1. Barrowman, J. A., Tso, P. Gastrointestinal lymphatics. Comprehensive Physiology. , 1733-1777 (2010).
  2. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
  3. Mossel, E. C., Ramig, R. F. A lymphatic mechanism of rotavirus extraintestinal spread in the neonatal mouse. J Virol. 77 (22), 12352-12356 (2003).
  4. Pantaleo, G., et al. Hiv-Infection Is Active and Progressive in Lymphoid-Tissue during the Clinically Latent Stage of Disease. Nature. 362 (6418), 355-358 (1993).
  5. Chakraborty, S., Zawieja, S., Wang, W., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, R94-R102 (2010).
  6. Dixon, J. B. Lymphatic lipid transport: sewer or subway. Trends Endocrinol Metab. 21 (8), 480-487 (2010).
  7. Weid, P. -. Y., Rehal, S., Ferraz, J. G. Role of the lymphatic system in the pathogenesis of Crohn’s disease. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (4), 335-341 (2011).
  8. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PloS one. 4 (12), e8442 (2009).
  9. Ji, Y., et al. Activation of rat intestinal mucosal mast cells by fat absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1292-G1300 (2012).
  10. Kohan, A., Yoder, S., Tso, P. Lymphatics in intestinal transport of nutrients and gastrointestinal hormones. Ann N Y Acad Sci. 1207, E44-E51 (2010).
  11. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Targeted drug delivery to lymphocytes: a route to site-specific immunomodulation. Mol Pharm. 7 (6), 2297-2309 (2010).
  12. Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin Exp Immunol. 92 (2), 317-322 (1993).
  13. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update. Adv Drug Deliv Rev. 60 (6), 702-716 (2008).
  14. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. Am J Physiol. 261 (3 Pt 1), G530-G538 (1991).
  15. Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
  16. Porter, C. J., Trevaskis, N. L., Charman, W. N. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nat Rev Drug Discov. 6 (3), 231-248 (2007).
  17. Trevaskis, N. L., et al. The role of the intestinal lymphatics in the absorption of two highly lipophilic cholesterol ester transfer protein inhibitors (CP524,515 and CP532,623). Pharm Res. 27 (5), 878-893 (2010).
  18. Choo, E. F., et al. The Role of Lymphatic Transport on the. Systemic Bioavailability of the Bcl-2 Protein Family Inhibitors Navitoclax (ABT-263) and ABT-199. Drug Metabolism and Disposition. 42 (2), 207-212 (2014).
  19. Han, S., et al. Targeted delivery of a model immunomodulator to the lymphatic system: comparison of alkyl ester versus triglyceride mimetic lipid prodrug strategies. J Control Release. 177, 1-10 (2014).
  20. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. J Lab Clin Med. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  21. Porter, C. J., Charman, S. A., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the triple-cannulated anesthetized rat model: effect of lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85 (4), 351-356 (1996).
  22. Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (2), 115-120 (2004).
  23. Porter, C. J., Charman, S. A., Humberstone, A. J., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the conscious rat when administered as either the free base or the hydrochloride salt: effect of lipid class and lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85 (4), 357-361 (1996).
  24. Caliph, S. M., Charman, W. N., Porter, C. J. Effect of short-, medium-, and long-chain fatty acid-based vehicles on the absolute oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of halofantrine and assessment of mass balance in lymph-cannulated and non-cannulated rats. J Pharm Sci. 89 (8), 1073-1084 (2000).
  25. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Adv Drug Deliv Rev. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  26. Noguchi, T., Charman, W. N. A., Stella, V. J. Lymphatic Appearance of Ddt in Thoracic or Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rats. International Journal of Pharmaceutics. 24 (2-3), 185-192 (1985).
  27. Trevaskis, N. L., et al. A mouse model to evaluate the impact of species, sex, and lipid load on lymphatic drug transport. Pharm Res. 30 (12), 3254-3270 (2013).
  28. Kota, J., et al. Lymphatic absorption of subcutaneously administered proteins: influence of different injection sites on the absorption of darbepoetin alfa using a sheep model. Drug Metab Dispos. 35 (12), 2211-2217 (2007).
  29. McHale, N. G., Adair, T. H. Reflex modulation of lymphatic pumping in sheep. Circ Res. 64 (6), 1165-1171 (1989).
  30. White, D. G., Story, M. J., Barnwell, S. G. An Experimental Animal-Model for Studying the Effects of a Novel Lymphatic Drug Delivery System for Propranolol. International Journal of Pharmaceutics. 69 (2), 169-174 (1991).
  31. Khoo, S. M., Edwards, G. A., Porter, C. J., Charman, W. N. A conscious dog model for assessing the absorption, enterocyte-based metabolism, and intestinal lymphatic transport of halofantrine. J Pharm Sci. 90 (10), 1599-1607 (2001).
  32. Kararli, T. T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals. Biopharm Drug Dispos. 16 (5), 351-380 (1995).
  33. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. J Biomed Opt. 17 (8), 086005 (2012).
  34. Dahan, A., Hoffman, A. Evaluation of a chylomicron flow blocking approach to investigate the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs. Eur J Pharm Sci. 24 (4), 381-388 (2005).
  35. Xiao, C., Lewis, G. F. Regulation of chylomicron production in humans. Biochim Biophys Acta. 1821 (5), 736-746 (2012).
  36. Seeballuck, F., Ashford, M., O’Driscoll, C. The Effects of Pluronic® Block Copolymers and Cremophor EL on Intestinal Lipoprotein Processing and the Potential Link with P-Glycoprotein in Caco-2 Cells. Pharmaceutical Research. 20 (7), 1085-1092 (2003).
  37. Levy, E., Mehran, M., Seidman, E. Caco-2 cells as a model for intestinal lipoprotein synthesis and secretion. The FASEB Journal. 9 (8), 626-635 (1995).
  38. Cartwright, I. J., Higgins, J. A. Isolated rabbit enterocytes as a model cell system for investigations of chylomicron assembly and secretion. Journal of Lipid Research. 40 (7), 1357-1365 (1999).
  39. Dixon, J. B., Raghunathan, S., Swartz, M. A. A Tissue-Engineered Model of the Intestinal Lacteal for Evaluating Lipid Transport by Lymphatics. Biotechnology and Bioengineering. 103 (6), 1224-1235 (2009).
  40. Gershkovich, P., et al. The role of molecular physicochemical properties and apolipoproteins in association of drugs with triglyceride-rich lipoproteins: in-silico prediction of uptake by chylomicrons. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 61 (1), 31-39 (2009).
  41. Gershkovich, P., Hoffman, A. Uptake of lipophilic drugs by plasma derived isolated chylomicrons: Linear correlation with intestinal lymphatic bioavailability. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 26 (5), 394-404 (2005).
  42. Holm, R., Hoest, J. Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer. International Journal of Pharmaceutics. 272 (1-2), 189-193 (2004).
  43. Trevaskis, N. L., Porter, C. J., Charman, W. N. Bile increases intestinal lymphatic drug transport in the fasted rat. Pharm Res. 22 (11), 1863-1870 (2005).
  44. Miura, S., et al. Increased proliferative response of lymphocytes from intestinal lymph during long chain fatty acid absorption. Immunology. 78 (1), 142-146 (1993).
  45. Caliph, S. M., et al. The impact of lymphatic transport on the systemic disposition of lipophilic drugs. J Pharm Sci. 102 (7), 2395-2408 (2013).
  46. Caliph, S. M., Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Intravenous dosing conditions may affect systemic clearance for highly lipophilic drugs: implications for lymphatic transport and absolute bioavailability studies. J Pharm Sci. 101 (9), 3540-3546 (2012).
  47. Trevaskis, N. L., et al. Tissue uptake of DDT is independent of chylomicron metabolism. Arch Toxicol. 80 (4), 196-200 (2006).

Play Video

Cite This Article
Trevaskis, N. L., Hu, L., Caliph, S. M., Han, S., Porter, C. J. The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport. J. Vis. Exp. (97), e52389, doi:10.3791/52389 (2015).

View Video