Protocol
BEMÆRK: Alle er vist i denne protokol metoder er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Fremstilling af operationsbordet
- Opsætning af varmepude med recirkulerende varmt vand på operationsbordet under dissektion mikroskop. Placer rustfri bundplade på varmepude. Placer en steril absorberende pude på bundpladen og varmepude.
- Arranger sterile kirurgiske værktøjer på en tilstødende steril absorberende pude. Saml to par vinklede spids pincet, to par vinklede pincet, tre hæmostatiske pincet, to retraktorer ledninger, små kirurgiske sakse, mikro-saks, en ballonudvidelse wire (0,15 inch diameter) og tre 6-tommer segmenter af 6,0 silkesutur .
- Bøj den runde ende af angioplastik tråd svarer til krumningen af den femorale arterie. Dette vil gøre det lettere at fremføre tråden under operationen.
2. Fremstilling afMus til operation
- Bedøver en mus ved kontinuerlig inhalation af 2,5% isofluran. Sørg for at overvåge dyrets status under hele proceduren. Udfør en knivspids test af musens fod for at bekræfte, at det er fuldt bedøvet. Sørg dyret bevæger sig ikke, når knivspids test administreres.
- Påfør en smørende salve til dyrets øjne for at forhindre udtørring. Fastgør dyret i liggende position til den absorberende pude ved hjælp af kirurgisk tape. Fortsæt administrere 2,5% isofluran via næse kegle.
- Ved hjælp af en hårfjerningsmiddel Fjern skind fra benet og maven til midterlinjen. Skyl huden grundigt med vand. Depilation kan udføres én dag i forvejen for kirurgi. Bemærk, at overdreven behandling med cremen kan føre til hudirritation.
- Umiddelbart før operation, anvende povidon-iod til afhåret område med en bomuld tippes applikator at sterilisere huden. Skyl depileret huden med 70% ethanol og tørmed en steril bomuld applikator. Gentag 3 gange.
- Administrere en præoperativ dosis på 5 mg / kg carprofen via subkutan injektion.
3. Isolering af lårarterien
- Ved hjælp af små kirurgiske sakse, gør en buet indsnit i huden over den femorale arterie. Omsvøb dissekere og sikre omgivende væv ved hjælp retraktorer magnetisk retractoren fikseringsindretninger at lokalisere den femorale arterie. Fugt væv periodisk ved hjælp saltvand til vanding Anvend saltvand ved hjælp af en steril bomuld spids applikator.
- Isoler den femorale arterie ved hjælp af pincet. Forsigtigt adskille nerve fra det vaskulære bundt med fin spids pincet. Undgå at punktere venen, og ikke beskadige nerve. Skub nerve væk fra bundtet for at undgå at stimulere det.
- Forsigtigt adskille femorale vene fra den femorale arterie, lokalisere den femorale bifurkation. Regionen af forgreningen er især vanskeligt at dissekere.
- Posterior til forgreningen, loop en 6,0 silkesutur under lårarterien og sikkert med en hæmostat. Denne proximale sutur vil blive anvendt for at begrænse blodstrømmen i arterien.
BEMÆRK: Der er en lille variation i båndene ved udførelse ligeringen metode versus ætsninger metode (se figur 1 og figur 2). - Distalt for forgreningen, loop 6,0 silkesutur under den femorale arterie og sikkert med en hæmostat. Denne distale sutur hjælpemidler i positioneringen af arterien.
- Loop to suturer under muskulære gren af den femorale arterie, præ-binde dem og sikkert med en hæmostat. Husk at fugte vævet med saltvand. Hvis der udføres af cautery metode wire skade, er nødvendig på den muskuløse gren kun en løkke sutur.
4. Udførelse af lårarterien Wire Skade
- Begrænse blodstrømmen i den femorale arterie ved at trække den proximale sutur. Lidt trække den distale Hemostpå og hæmostat sikre filialen for at blotlægge site for arteriotomien. Ligere muskulære gren ved at binde suturen omkring det.
BEMÆRK: Løft af arterien opad mere effektivt begrænser blodgennemstrømning end at trække vandret alene. - Sever den lille gren med cautery mellem de to suturer. Brug af mikro-saks, udføre en arteriotomi i siden gren af forgreningen. Brug pincet afbalanceret på en rulle kirurgisk tape til at stabilisere mikro-saks.
- Bekræfte tilstedeværelsen af arteriotomien med fin spids pincet. Løft forsigtigt åbningen af arteriotomien med pincet. Indfør den afrundede ende af tråden i arteriotomien ved hjælp af pincet. For at lette fremføringen af tråden, tilføje en eller to dråber af lidocain til regionen ved hjælp af en sprøjte.
- Når tråden når den proximale sutur, frigive suturen og justere den, så den ikke kan hindre fremføringen af tråden. Sæt ledningen, indtil det ikke kan gå længere. Spidsen af the wire skal stoppe i området lyskeligamentet.
- Lad tråden til at forblive i den femorale arterie i et minut. Efter et minut trække og fremføre tråden i en savning bevægelse ti gange at skade og denude endotelet i den femorale arterie. For en skade af mindre sværhedsgrad, reducere antallet af gange tråden trækkes ind og ud af arterien eller forlade tråden i arterien for kun 1 min.
- Træk tråden langsomt. Når den runde ende af tråden har passeret den proximale sutur, begrænse strømmen ind i arterien ved at trække den proximale sutur. Træk ledningen fuldstændigt.
5. ligere det Muscular Branch
- Spænd resterende sutur på den muskuløse gren. Dette vil forhindre blødning fra arteriotomi. Returløb til den muskulære gren, og bekræfter, at blodet ikke siver fra det. Trim enderne fra suturerne på muskuløse gren.
6. Alternativ metode: Lokaliseret Cauterization af arteriotomien
BEMÆRK: kan tages En alternativ fremgangsmåde for at undgå ligering af muskulære gren og tillade vaskulær adgang gennem større vigtigste femorale arterie.
- Startende fra 4,1 begrænse strømning til den femorale arterie ved at trække på den proximale sutur. Træk den distale sutur og suturen sikre muskulære gren lidt at blotlægge site for arteriotomien (figur 1 og figur 2).
- Brug af mikro-saks, udføre en arteriotomi på grenen punkt lårarterien og muskuløse gren. Hvis incision i siden af arterien, kan det være lettere at ætse. Brug pincet afbalanceret på en rulle kirurgisk tape til at stabilisere mikro-saks.
- For at teste succes ætsninger, genoprette strømning til den femorale arterie ved at løsne den proximale sutur. Hvis der opstår blødning fra arteriotomien Gentag kautering. Hvis cautery lykkes, vil blodgennemstrømningen være relagret distalt arteriotomien.
- Indføre wiren og udføre wire skade som beskrevet i afsnit 4.
- Fortsæt begrænser blodgennemstrømningen i den femorale arterie. Opvarm en spids cautery mindst 6 inches væk fra musen. Da cautery spids køler, anvende det let side af arteriotomien at lukke snittet.
- For at teste succes ætsninger, genoprette strømning til den femorale arterie ved at løsne den proximale sutur. Hvis der opstår blødning fra arteriotomien Gentag kautering. Hvis cautery lykkes, vil blodgennemstrømningen genoprettes distalt for arteriotomi. Fjern midlertidige proximale og distale bånd.
7. Implantation af Perivaskulær Drug Delivery Patch
- Opret en perivaskulær lægemiddel plaster kan oprettes som beskrevet i tidligere undersøgelser 11 eller ved at bruge lignende metoder. Blunt hjørnerne af barrieren region af afgivelsesenheden plaster med sterile sakse
- Placer afgivelsesenheden patCH på såret femorale arterie med den lægemiddel-frigivende vendende arterien. Som nødvendigt, brug pincet til at forbedre situationen for plasteret.
8. sårlukning og Recovery
- Lukke såret med en enkel afbrudt sutur, der består af firkantede knob. En diskontinuerlig sutur forlænger sårlukning i tilfælde af dyr forsøger at fjerne suturen.
- Sluk for anæstesi og fjerne dyret fra sættet op. Lad så dyret kan komme på opvarmning pad.
- Fortsæt med at overvåge musens opsving. Kontroller incisionsstedet hver dag for at sikre, at den forbliver lukket. Til behandling af post-operative smerter, administrere en subkutan injektion af 5 mg / kg af carprofen hver 12 timer efter kirurgi og derefter hver 12 timer i 2 dage. Hvis smerten fortsætter ud over de første 2 dage, konsultere en dyrlæge for retninger på yderligere smertestillende medicin.
9. Høst lårarterier til histologi
- Efter 28 dage efter kirurgi, udføre kuldioxid eutanasi på musen.
BEMÆRK: Den passende strømningshastighed af kuldioxid bør fortrænge 10-30% af kammeret per minut og vil variere afhængigt af størrelsen af kammeret anvendes. Skæring af membranen og hjertepunktur skal udføres som en sekundær fremgangsmåde til eutanasi. - Fastgør musen i liggende position ved hjælp kirurgisk tape. Lave et snit i den femorale arterie, hvor den oprindelige kirurgiske indsnit blev foretaget.
- For både den skadede arterie og skadede arterie fra det kontralaterale ben, uden omsvøb dissekere og sikre omkringliggende væv ved hjælp af retraktorer og magnetiske retractoren fikseringsindretninger at lokalisere den femorale arterie. Fugt væv periodisk ved hjælp saltvand til kunstvanding. Anvend saltvand under anvendelse af en steril bomuld applikator. Pas på ikke at beskadige arterie.
- Efter den femorale arterie er blevet isoleret fra stedet for den oprindelige arteriotomi til den abdominale aorta, binde en segling af silkesutur nær det oprindelige websted af arteriotomien. Denne sutur vil hjælpe med at identificere den mest distale ende af den femorale arterie og lette håndteringen af prøven.
- Brug af mikrodissektion saks til at udskære den femorale arterie. Lav en indsnit distalt suturen. Gøre den anden snit på den modsatte ende af den femorale arterie, ved siden af den abdominale aorta.
- Overfør udskåret arterien til et glas petriskål indeholdende saltvand. Skær arterien yderligere at fjerne overskydende bindevæv eller fedt. Fjern forsigtigt blod fra lumen ved skylning med saltvand.
- Overfør arterien til et hætteglas med 10% pufret formalin. Opbevar hætteglas ved 4 ° C med forsigtig vipning i 48 timer.
- Overfør den faste arterie til 70% ethanol til at lagre indtil det forarbejdes til histologi.
- Integrer arterien i paraffinblokke og afsnittet blokkene til farvning.
- Udfør histokemisk og immunokemisk farvning at vurdere omfanget af skaden og intima hyperplasia.
BEMÆRK: de repræsentative resultater, brugte vi Hematoxylin og Eosin at visualisere kerner og overordnede morfologi eller en Movat s Pentachrome pletten til at visualisere den elastiske lameller og andre arterielle komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter wire skade, neointimahyperplasi udvikler sig over tid og er typisk undersøgt efter 14 til 28 dage. Beskrevet i dette arbejde førte til robust generation af intimal hyperplasi i mus som vist de histologiske resultater i figur teknikker 3. En uskadt femoral arterie vil demonstrere intakt elastisk lameller og en normal tykkelse og omkreds. En skadet femorale arterie vil vise intimal hyperplasi, nedbrudt elastisk lameller og demonstrere re-endotelialisering på senere tidspunkter. Re-endotelialisering er typisk færdig på omkring 21 dage, men dette afhænger af baggrunden stamme af anvendte mus og kan vurderes ved hjælp af immunfarvning for endotel markører på afsnit eller, helst, målt på en face præparater ved anvendelse af Evans blå farvestof, scanning elektronmikroskopi eller immunfarvning med konfokal mikroskopi på en face præparater af arterien. 17,18 til kvantificering af intimahyperplasi deter bedst at måle intimale areal eller intimal-til-media ratio på tre steder langs arterien skadede at redegøre for potentielle variationer langs længden af de sårede område af arterien.
Figur 1: Fotografier af de kritiske trin i de to metoder til wire skade i den femorale arterie En sammenligning af de skridt til ligation metode (top) til cautery metoden (nederst) til at udføre wire skade.. I ligeringen fremgangsmåde de to suturer fastgør muskulære gren er præ-bundet, så de kan strammes til at ligere den muskulære gren. Jo mere distale af de to muskulære gren suturer strammes. Arteriotomien og wire indsættelse udføres i den muskulære gren. Efter skaden er udført, vises den resterende sutur på den muskuløse gren strammet og trimmet. I cautery fremgangsmåde kun én suture er loopes under den muskulære gren. Arteriotomien og wire indsættelse udføres ved forgreningspunktet af muskelkraft gren fra den femorale arterie. Efter skaden er udført, bliver snittet ætses uden ligere enten lårarterien eller muskuløs gren. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: højere forstørrelse fotografier af de kritiske trin i de to teknikker til wire skade Close-up sammenligning af trin til ligering metode (øverst) til cautery metode (nederst).. Placeringen af arteriotomien er afgrænset med den stiplede linje. Klik her for at se en større udgave af dettefigur.
Figur 3:. Repræsentative histologiske resultater af tråd skade 14 dage efter proceduren Histologisk fra arterier sektioner blev farvet med hematoxylin og eosin (øverst) og Movat s pentachrome farvning (nederst). Mærket i billedet er lumen (L), intima (I) og elastiske lamina (EL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
- Hoffmann, R., Mintz, G. S. Coronary in-stent restenosis - predictors, treatment and prevention. Eur Heart J. 21 (21), 1739-1749 (2000).
- Erbel, R., et al. Coronary-artery stenting compared with balloon angioplasty for restenosis after initial balloon angioplasty. Restenosis Stent Study Group. N Engl J Med. 339 (23), 1672-1678 (1998).
- Farooq, V., Gogas, B. D., Serruys, P. W. Restenosis: delineating the numerous causes of drug-eluting stent restenosis. Circ Cardiovasc Interv. 4 (2), 195-205 (2011).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. Br Med Bull. 106, 193-211 (2013).
- Garg, S., Serruys, P. W.
- Park, S. J., Kim, Y. H. Current status of percutaneous coronary intervention with drug-eluting stents in Asia. Circulation. 118 (25), 2730-2737 (2008).
- Alfonso, F. Treatment of drug-eluting stent restenosis the new pilgrimage: quo vadis. J Am Coll Cardiol. 55 (24), 2717-2720 (2010).
- Dake, M. D., et al. Paclitaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease: twelve-month Zilver PTX randomized study results. Circ Cardiovasc Interv. 4 (5), 495-504 (2011).
- Bosiers, M., et al. Results of the Protege EverFlex 200-mm-long nitinol stent (ev3) in TASC C and D femoropopliteal lesions. J Vasc Surg. 54 (4), 1042-1050 (2011).
- Duda, S. H., et al. Drug-eluting and bare nitinol stents for the treatment of atherosclerotic lesions in the superficial femoral artery: long-term results from the SIROCCO trial. J Endovasc Ther. 13 (6), 701-710 (2006).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (10), 2238-2244 (1997).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Roque, M., et al. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20 (2), 335-342 (2000).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A.
- Edelman, E. R., Adams, D. H., Karnovsky, M. J. Effect of controlled adventitial heparin delivery on smooth muscle cell proliferation following endothelial injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3773-3777 (1990).
- Stemerman, M. B., Ross, R. Experimental arteriosclerosis. I. Fibrous plaque formation in primates, an electron microscope study. J Exp Med. 136 (4), 769-789 (1972).
- Brouchet, L., et al. Estradiol accelerates reendothelialization in mouse carotid artery through estrogen receptor-alpha but not estrogen receptor-beta. Circulation. 103 (3), 423-428 (2001).
- Filipe, C., et al. Estradiol accelerates endothelial healing through the retrograde commitment of uninjured endothelium. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2822-H2830 (2008).
- Feuls, R., et al. Microvascular denudation of the femoral artery of the mouse as a model for restenosis. Rofo. 175 (7), 952-957 (2003).
- Holt, A. W., Tulis, D. A. Experimental Rat and Mouse Carotid Artery Surgery: Injury & Remodeling Studies. ISRN Minim Invasive Surg. 2013, (2013).
- Iafrati, M. D., et al. Estrogen inhibits the vascular injury response in estrogen receptor alpha-deficient mice. Nat Med. 3 (5), 545-548 (1997).
- Sullivan, T. R., et al. Estrogen inhibits the response-to-injury in a mouse carotid artery model. J Clin Invest. 96 (5), 2482-2488 (1995).
- Yin, Y., Zhao, X., Fang, Y., Huang, L. Carotid artery wire injury mouse model with a nonmicrosurgical procedure. Vascular. 18 (4), 221-226 (2010).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), (2010).
- Kuhlmann, M. T., et al. Implantation of a carotid cuff for triggering shear-stress induced atherosclerosis in mice. J Vis Exp. (59), (2012).
- Carmeliet, P., et al. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular electric injury in mice. Am J Pathol. 150 (2), 761-776 (1997).
