Protocol
NOTA: Todos os métodos mostrados neste protocolo ter sido aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional.
1. Preparação da Tabela cirúrgico
- Configure a almofada de aquecimento com recirculação de água quente sobre a mesa cirúrgica, sob o microscópio de dissecação. Coloque a placa de base de aço inoxidável para a almofada de aquecimento. Coloque um pano absorvente estéril na placa de base e almofada de aquecimento.
- Organizar instrumentos cirúrgicos estéreis sobre um pano absorvente estéril adjacente. Reunir duas pinças de ponta fina ângulo, duas pinças anguladas, três pinça hemostática, dois fios retratores, pequenas tesouras cirúrgicas, micro-tesoura, fio uma angioplastia (diâmetro de 0,15 polegadas) e três segmentos de sutura 6.0 seda de 6 polegadas .
- Dobre a rodada final do fio de angioplastia para coincidir com a curvatura da artéria femoral. Isso tornará mais fácil para avançar o fio durante a cirurgia.
2. Preparação deRato para Cirurgia
- Anestesiar um rato por inalação contínua de 2,5% de isoflurano. Certifique-se de monitorar o status do animal durante todo o procedimento. Realizar um teste pitada do pé do mouse para confirmar que ele está totalmente anestesiado. Certifique-se de que o animal não se mover quando o teste do beliscão é administrada.
- Aplique uma pomada lubrificante para os olhos do animal para evitar a dessecação. Fixe o animal em decúbito dorsal para a almofada absorvente usando fita cirúrgica. Continue a administração de 2,5% de isoflurano via nariz cone.
- Usar um creme depilatório, retire a pele da perna e do abdômen para a mid-line. Lavar a pele com água. Depilação pode ser realizada um dia antes da cirurgia. Note-se que o tratamento com o creme excessiva pode levar a irritação da pele.
- Imediatamente antes da cirurgia, aplica povidona-iodo na área depilada com um aplicador de ponta de algodão para esterilizar a pele. Lavar a pele depilada com etanol 70% e secocom um cotonete estéril. Repita 3 vezes.
- Administrar uma dose pré-operatória de 5 mg / kg de carprofeno, por injecção subcutânea.
3. Isolamento da Artéria Femoral
- Com uma tesoura pequena cirurgia, fazer uma incisão curva na pele sobre a artéria femoral. Sem rodeios dissecar e proteger os tecidos circundantes com afastadores fixadores retrator magnética para localizar a artéria femoral. Umedeça os tecidos periodicamente, utilizando solução salina para irrigação Aplicar soro fisiológico usando um aplicador de algodão estéril.
- Isolar a artéria femoral com a pinça. Separe cuidadosamente o nervo do feixe vascular usando uma pinça de ponta fina. Evite punção da veia, e não danificar o nervo. Empurre o nervo longe do pacote para evitar estimulá-lo.
- Suavemente separar a veia femoral a partir da artéria femoral, localizando a bifurcação femoral. A região da bifurcação é especialmente difícil para dissecar.
- Posterior à bifurcação, um laço de sutura de seda 6.0 sob a artéria femoral e seguro com uma pinça hemostática. Esta sutura proximal será utilizada para restringir o fluxo de sangue na artéria.
NOTA: Há uma ligeira variação nos laços ao executar o método de ligação em relação ao método de cauterização (veja a Figura 1 e Figura 2). - Distalmente à bifurcação, malha 6,0 sutura de seda por baixo da artéria femoral e seguro com uma pinça hemostática. Este distais auxiliares de sutura no posicionamento da artéria.
- Loop duas suturas sob o ramo muscular da artéria femoral, pré-amarrá-los e prenda com uma pinça hemostática. Lembre-se de umedecer os tecidos com solução salina. Se a realização do método cautério de lesão fio, apenas uma sutura em loop é necessário no ramo muscular.
4. Desempenho da artéria femoral Injury Fio
- Restringir o fluxo de sangue na artéria femoral, puxando o fio de sutura proximal. Ligeiramente puxar o Hemost distala pinça hemostática e garantir a filial para expor o local para a arteriotomy. Ligadura do ramo muscular amarrando a sutura em torno dele.
NOTA: Levantar a artéria para cima vai mais eficaz restringir o fluxo de sangue do que puxar horizontalmente sozinho. - Sever do pequeno ramo com cautério entre as duas suturas. Usando micro-tesoura, realizar uma arteriotomy no ramo lateral da bifurcação. Use uma pinça balanceada com um rolo de fita cirúrgica para estabilizar os micro-tesoura.
- Confirmar a presença do arteriotomy usando uma pinça de ponta fina. Levante cuidadosamente a abertura do arteriotomy com a pinça. Introduzir a extremidade arredondada do fio no arteriotomy usando uma pinça. Para facilitar o avanço do arame, adicionar uma ou duas gotas de lidocaína à região, utilizando uma seringa.
- Quando o fio atinge o fio de sutura proximal, libertar o fio de sutura e ajustá-lo de modo que ele não pode impedir o avanço do fio. Insira o fio até que ela não pode avançar ainda mais. A ponta do the fio deve parar na região do ligamento inguinal.
- Permitir que o fio de permanecer na artéria femoral para um minuto. Após um minuto, retrair e avançar o fio em um movimento de corte de dez vezes para ferir e desnudar o endotélio da artéria femoral. Para uma lesão de menor gravidade, diminuir o número de vezes que o fio é puxado para dentro e para fora da artéria ou deixar o fio na artéria para apenas 1 min.
- Recolha o fio lentamente. Quando a rodada final do fio passou a sutura proximal, restringir o fluxo na artéria puxando o fio de sutura proximal. Recolha o fio completamente.
5. ligando o Poder Muscular
- Aperte a sutura restante no ramo muscular. Isto irá prevenir o sangramento do arteriotomy. Retorno de fluxo para o ramo muscular, e confirme que o sangue não está vazando a partir dele. Corte as extremidades das suturas no ramo muscular.
6. Método Alternativo: Localizada Cauzação da arteriotomia
NOTA: pode ser tomado Uma abordagem alternativa para evitar a ligadura do ramo muscular e permitir o acesso vascular através da artéria femoral principal maior.
- A partir de 4.1, para restringir o fluxo na artéria femoral em puxando o fio de sutura proximal. Puxar o fio de sutura distal e segurar fio de sutura ligeiramente o ramo muscular para expor o local para a arteriotomia (Figura 1 e Figura 2).
- Usando micro-tesoura, realizar uma arteriotomy no ponto ramo da artéria femoral eo ramo muscular. Se a incisão é feita na parte lateral da artéria, pode ser mais fácil para cauterizar. Use uma pinça balanceada com um rolo de fita cirúrgica para estabilizar os micro-tesoura.
- Para testar o sucesso da cauterização, para restaurar o fluxo da artéria femoral, soltando a sutura proximal. Se o sangramento ocorre a partir do arteriotomy, repita o cautério. Se o cautério for bem sucedida, o fluxo de sangue será rearmazenado distal à arteriotomia.
- Introduzir o fio e executar a lesão fio conforme descrito no capítulo 4.
- Continuar a restringir o fluxo de sangue na artéria femoral. Aqueça uma cauterização de ponta fina, pelo menos, 6 centímetros de distância do mouse. Como o cautério arrefece, aplicar uma camada fina lado da arteriotomia para fechar a incisão.
- Para testar o sucesso da cauterização, para restaurar o fluxo da artéria femoral, soltando a sutura proximal. Se o sangramento ocorre a partir do arteriotomy, repita o cautério. Se a cauterização é bem sucedido, o fluxo de sangue vai ser restaurada distal à arteriotomia. Retire o proximal temporária e laços distais.
7. Implantação de perivascular Drogas patch Entrega
- Criar um remendo perivascular droga pode ser criado como descrito em estudos anteriores 11 ou utilizando métodos semelhantes. Blunt os cantos da região a barreira do patch entrega da droga usando uma tesoura esterilizada
- Coloque o pat entrega da drogach para a artéria femoral feridos com o lado de libertação de droga voltado para a artéria. Se necessário, utilize uma pinça para melhorar a posição do patch.
8. Wound Encerramento e Recuperação
- Fechar a ferida com uma sutura interrompida simples consistindo de nós quadrados. Uma sutura descontínua prolonga o fechamento da ferida em caso de o animal tenta remover o fio de sutura.
- Desligue a anestesia e retirar o animal do set up. Permitir que o animal possa recuperar na almofada de aquecimento.
- Continue a acompanhar a recuperação do mouse. Verifique o local da incisão a cada dia para garantir que permanece fechado. Para o tratamento de dor pós-cirúrgica, administrar uma injecção subcutânea de 5 mg / kg de carprofeno cada 12 horas após a cirurgia e, em seguida, a cada 12 h durante 2 dias. Se a dor continua para além dos primeiros dois dias, consulte um veterinário para obter instruções sobre mais medicação para dor.
9. Artérias colheita femoral para Histologia
- Aos 28 dias pós-cirurgia, realizar o dióxido de carbono a eutanásia no mouse.
NOTA: O caudal adequado de dióxido de carbono deve deslocar 10-30% da câmara por minuto e irá variar dependendo do tamanho da câmara usada. Corte do diafragma e punção cardíaca deve ser realizada como um método secundário de eutanásia. - Fixe o mouse na posição em decúbito dorsal com fita cirúrgica. Faça uma incisão sobre a artéria femoral, onde a incisão cirúrgica inicial foi feito.
- Para tanto a artéria feridos ea artéria ileso da perna contralateral, sem rodeios dissecar e garantir tecidos circundantes com afastadores e fixadores retrator magnéticos para localizar a artéria femoral. Umedeça os tecidos periodicamente, utilizando solução salina para a irrigação. Aplicar soro fisiológico usando um aplicador de algodão estéril. Tome cuidado para não danificar a artéria.
- Após a artéria femoral foi isolada a partir do local da arteriotomia original para a aorta abdominal, amarrar um segmento de fio de seda perto do local original do arteriotomy. Esta sutura vai ajudar a identificar a extremidade mais distai da artéria femoral e facilitar a manipulação da amostra.
- Usando a tesoura micro-dissecação para extirpar a artéria femoral. Faça uma incisão distal à sutura. Adicione outro incisão na extremidade oposta da artéria femoral, ao lado da aorta abdominal.
- Transferir a artéria excisada para uma placa de Petri de vidro contendo solução salina. Dissecção da artéria mais para remover o excesso de tecido conjuntivo ou de gordura. Remova cuidadosamente o sangue do lúmen por lavagem com soro fisiológico.
- Transfira a artéria de um frasco de formol a 10% tamponado. Armazenar o frasco a 4 ° C com agitação suave durante 48 horas.
- Transferir a artéria fixada a 70% de etanol, para armazenar até ser processado para histologia.
- Incorporar a artéria em blocos de parafina e secção dos blocos para a coloração.
- Execute coloração histoquímica e immunochemical para avaliar a extensão da lesão e da íntima hyperplasia.
NOTA: Para obter os resultados representativos, usamos Hematoxilina e Eosina para visualizar os núcleos e morfologia geral ou Pentachrome mancha de um Movat visualizar a lamelas elásticas e outros componentes arteriais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Após lesão fio, hiperplasia neointimal desenvolve ao longo do tempo e normalmente é examinado após 14 a 28 dias. As técnicas descritas neste trabalho levam à geração robusta de hiperplasia da íntima em camundongos como mostra os resultados histológicos na Figura 3. Uma artéria femoral ileso irá demonstrar lamelas elásticas intactas e uma espessura normal e circunferência. Uma artéria femoral ferido irá mostrar hiperplasia da íntima, degradada lamelas elásticas e demonstrar reendotelização em momentos posteriores. Re-Endotelização é tipicamente completa em cerca de 21 dias, mas isso depende da estirpe dos ratos usados fundo e pode ser avaliada através de imunomarcação para marcadores endoteliais em secções ou, de preferência, medidos em en preparações cara usando corante azul de Evan, microscopia eletrônica de varredura ou imunológica com microscopia confocal em en preparações face da artéria 17,18. Para a quantificação da hiperplasia da íntima-loé melhor para medir a área íntima ou relação íntima-to-media em três locais ao longo da artéria lesionada para explicar as possíveis variações ao longo do comprimento da região lesada da artéria.
Figura 1: Fotografias dos passos críticos dos dois métodos de lesão de arame na artéria femoral Uma comparação dos passos para o método de ligação (superior) para o método cautério (inferior) para a realização de lesão de arame.. No método de ligação, as duas suturas de fixação do ramo muscular são pré-amarrado para que eles possam ser apertados para ligar o ramo muscular. Quanto mais distal das duas suturas ramo muscular é apertada. A inserção arteriotomia e fio são realizadas no ramo muscular. Após a lesão é realizada, a sutura restante no ramo muscular é apertada e aparado. No método de cautério, apenas um suture é enrolado sob o ramo muscular. A arteriotomia e inserção do fio são executadas ao ponto de ramificação do ramo muscular da artéria femoral. Após a lesão é realizada, a incisão é cauterizado sem a ligadura ou a artéria femoral ou ramo muscular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fotografias ampliação maior dos passos críticos das duas técnicas de lesão fio comparação Close-up de etapas para o método de ligação (em cima) com o método de cautério (parte inferior).. A localização do arteriotomy é demarcada com a linha tracejada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior destafigura.
Figura 3:. Resultados histológicos representativos de lesão fio 14 dias após o procedimento histológica das seções artérias foram coradas com Hematoxilina e Eosina (parte superior) e coloração pentachrome de Movat (parte inferior). Marcado na imagem são o lúmen (L), íntima (I) e da lâmina elástica (EL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
- Hoffmann, R., Mintz, G. S. Coronary in-stent restenosis - predictors, treatment and prevention. Eur Heart J. 21 (21), 1739-1749 (2000).
- Erbel, R., et al. Coronary-artery stenting compared with balloon angioplasty for restenosis after initial balloon angioplasty. Restenosis Stent Study Group. N Engl J Med. 339 (23), 1672-1678 (1998).
- Farooq, V., Gogas, B. D., Serruys, P. W. Restenosis: delineating the numerous causes of drug-eluting stent restenosis. Circ Cardiovasc Interv. 4 (2), 195-205 (2011).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. Br Med Bull. 106, 193-211 (2013).
- Garg, S., Serruys, P. W. Coronary stents: current status. J Am Coll Cardiol. 56 (10 Suppl), S1-S42 (2010).
- Park, S. J., Kim, Y. H. Current status of percutaneous coronary intervention with drug-eluting stents in Asia. Circulation. 118 (25), 2730-2737 (2008).
- Alfonso, F. Treatment of drug-eluting stent restenosis the new pilgrimage: quo vadis. J Am Coll Cardiol. 55 (24), 2717-2720 (2010).
- Dake, M. D., et al. Paclitaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease: twelve-month Zilver PTX randomized study results. Circ Cardiovasc Interv. 4 (5), 495-504 (2011).
- Bosiers, M., et al. Results of the Protege EverFlex 200-mm-long nitinol stent (ev3) in TASC C and D femoropopliteal lesions. J Vasc Surg. 54 (4), 1042-1050 (2011).
- Duda, S. H., et al. Drug-eluting and bare nitinol stents for the treatment of atherosclerotic lesions in the superficial femoral artery: long-term results from the SIROCCO trial. J Endovasc Ther. 13 (6), 701-710 (2006).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (10), 2238-2244 (1997).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Roque, M., et al. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20 (2), 335-342 (2000).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Edelman, E. R., Adams, D. H., Karnovsky, M. J. Effect of controlled adventitial heparin delivery on smooth muscle cell proliferation following endothelial injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3773-3777 (1990).
- Stemerman, M. B., Ross, R. Experimental arteriosclerosis. I. Fibrous plaque formation in primates, an electron microscope study. J Exp Med. 136 (4), 769-789 (1972).
- Brouchet, L., et al. Estradiol accelerates reendothelialization in mouse carotid artery through estrogen receptor-alpha but not estrogen receptor-beta. Circulation. 103 (3), 423-428 (2001).
- Filipe, C., et al. Estradiol accelerates endothelial healing through the retrograde commitment of uninjured endothelium. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2822-H2830 (2008).
- Feuls, R., et al. Microvascular denudation of the femoral artery of the mouse as a model for restenosis. Rofo. 175 (7), 952-957 (2003).
- Holt, A. W., Tulis, D. A. Experimental Rat and Mouse Carotid Artery Surgery: Injury & Remodeling Studies. ISRN Minim Invasive Surg. 2013, (2013).
- Iafrati, M. D., et al. Estrogen inhibits the vascular injury response in estrogen receptor alpha-deficient mice. Nat Med. 3 (5), 545-548 (1997).
- Sullivan, T. R., et al. Estrogen inhibits the response-to-injury in a mouse carotid artery model. J Clin Invest. 96 (5), 2482-2488 (1995).
- Yin, Y., Zhao, X., Fang, Y., Huang, L. Carotid artery wire injury mouse model with a nonmicrosurgical procedure. Vascular. 18 (4), 221-226 (2010).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), (2010).
- Kuhlmann, M. T., et al. Implantation of a carotid cuff for triggering shear-stress induced atherosclerosis in mice. J Vis Exp. (59), (2012).
- Carmeliet, P., et al. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular electric injury in mice. Am J Pathol. 150 (2), 761-776 (1997).
