Protocol
NOTE: Toutes les méthodes présentées dans ce protocole ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle.
1. Préparation de la table d'opération
- Mettre en place le coussin chauffant avec recirculation de l'eau chaude sur la table d'opération, sous le microscope de dissection. Placer la plaque de base en acier inoxydable sur le bloc de chauffage. Placez un tampon absorbant stérile sur la plaque de base et un coussin chauffant.
- Disposer des outils chirurgicaux stériles sur un tampon absorbant adjacente stérile. Rassemblez deux paires de pinces à pointe fine angle, deux paires de pinces inclinées, trois pinces hémostatiques, deux fils de écarteurs, petits ciseaux chirurgicaux, de micro-ciseaux, fils d'une angioplastie (diamètre 0,15 pouces) et trois segments de 6 pouces de suture 6.0 de soie .
- Plier l'extrémité ronde du fil d'angioplastie pour correspondre à la courbure de l'artère fémorale. Il sera ainsi plus facile de faire avancer le fil au cours de la chirurgie.
2. Préparation duSouris pour la chirurgie
- Anesthésier une souris par inhalation continue de 2,5% d'isoflurane. Ne oubliez pas de surveiller l'état de l'animal durant toute la procédure. Effectuer un test de pincement du pied de la souris pour confirmer qu'il est complètement anesthésié. Assurer que l'animal ne bouge pas lorsque le test de pincement est administré.
- Appliquer une pommade lubrifiante pour les yeux de l'animal pour éviter la dessiccation. Fixez l'animal en décubitus dorsal au coussin absorbant l'aide de ruban chirurgical. Continuer à administrer 2,5% d'isoflurane via cône de nez.
- Utiliser une crème dépilatoire, enlever la fourrure de la jambe et à l'abdomen à la ligne médiane. Rincer soigneusement la peau avec de l'eau. Dépilatoire peut être effectué un jour avant la chirurgie. Notez que le traitement avec la crème excessive peut entraîner une irritation de la peau.
- Immédiatement avant la chirurgie, appliquer povidone-iode à la zone épilée avec un applicateur coton-tige pour stériliser la peau. Rincer la peau épilée avec 70% d'éthanol et sècheavec un applicateur coton-tige stérile. Répétez 3 fois.
- Administrer une dose pré-opératoire de 5 mg / kg de carprofène par injection sous-cutanée.
3. Isolement de l'artère fémorale
- L'utilisation de petits ciseaux chirurgicaux, faire une incision courbe dans la peau sur l'artère fémorale. Carrément disséquer et sécuriser les tissus environnants en utilisant écarteurs écarteurs magnétique fixateurs pour localiser l'artère fémorale. Humidifiez les tissus en utilisant périodiquement solution saline pour l'irrigation Appliquer une solution saline en utilisant un applicateur de coton-tige stérile.
- Isoler l'artère fémorale à l'aide de pinces. Séparez doucement le nerf de la faisceau vasculaire en utilisant une pince à pointe fine. Éviter la perforation de la veine, et ne pas endommager le nerf. Poussez le nerf loin de la liasse pour éviter le stimuler.
- Séparez doucement la veine fémorale de l'artère fémorale, la localisation de la bifurcation fémorale. La région de la bifurcation est particulièrement difficile à disséquer.
- Posterior à la bifurcation, boucle une suture de soie 6,0 sous l'artère fémorale et sécurisée avec une pince hémostatique. Cette suture proximal sera utilisé pour restreindre le flux sanguin dans l'artère.
NOTE: Il ya une légère variation dans les liens lors de l'exécution de la méthode de ligature par rapport à la méthode de la cautérisation (voir Figure 1 et Figure 2). - Distale à la bifurcation, boucle 6,0 soie suture sous l'artère fémorale et sécurisée avec une pince hémostatique. Cette distales aides de suture dans la position de l'artère.
- Boucle deux sutures sous la branche musculaire de l'artère fémorale, pré-les attacher et fixer avec une pince hémostatique. Ne oubliez pas d'humidifier les tissus avec une solution saline. Si l'exécution du procédé de cautérisation de blessure de fil, une seule boucle de suture est nécessaire sur la branche musculaire.
4. Performance de l'artère fémorale fil blessures
- Restreindre le flux sanguin dans l'artère fémorale en tirant la suture proximale. Tirez légèrement le Hemost distaleau hémostatique et assurer la branche pour exposer le site pour l'artériotomie. Ligaturer la branche musculaire en liant la suture autour d'elle.
NOTE: La levée de l'artère vers le haut sera plus efficacement restreindre le flux sanguin que de tirer horizontalement seul. - Sever la petite branche avec le cautère entre les deux points de suture. L'aide de micro-ciseaux, effectuer une artériotomie dans la branche latérale de la bifurcation. Utilisez une pince en équilibre sur un rouleau de ruban adhésif chirurgical pour stabiliser les micro-ciseaux.
- Confirmer la présence de l'artériotomie aide d'une pince à pointe fine. Soulevez doucement l'ouverture de l'artériotomie avec la pince. Présentez l'extrémité arrondie du fil dans l'artériotomie aide d'une pince. Pour faciliter l'avancement du fil, ajouter une ou deux gouttes de lidocaïne dans la région en utilisant une seringue.
- Lorsque le fil atteint la suture proximale, relâchez la suture et l'ajuster de sorte qu'il ne peut pas nuire à l'avancement du fil. Insérez le fil jusqu'à ce qu'il ne peut pas avancer plus loin. La pointe de ee fil de fer devrait se arrêter dans la région du ligament inguinal.
- Laisser le fil de rester dans l'artère fémorale pendant une minute. Après une minute, retirer et de faire avancer le fil dans un mouvement de scie dix fois de blesser et de dénuder l'endothélium de l'artère fémorale. Pour une blessure de moindre gravité, de diminuer le nombre de fois que le fil est tiré dans et hors de l'artère ou de laisser le fil dans l'artère pendant 1 minute seulement.
- Rentrer le fil lentement. Lorsque l'extrémité ronde du fil a passé la suture proximale, restreindre la circulation dans l'artère en tirant la suture proximale. Rétracter complètement le fil.
5. ligature de la Direction musculaire
- Serrer la suture restant sur la branche musculaire. Cela permettra d'éviter des saignements de l'artériotomie. Débit Retour à la branche musculaire, et de confirmer que le sang ne fuit pas de lui. Couper les extrémités des sutures sur la branche musculaire.
6. Autre méthode: localisée Caurisation de l'artériotomie
REMARQUE: Une autre approche peut être prises pour éviter la ligature de la branche musculaire et permettre l'accès vasculaire à travers la principale artère fémorale plus grande.
- A partir de 4,1, limiter l'écoulement de l'artère fémorale en tirant sur le fil de suture proximal. Tirez la suture distale et la suture de fixation légèrement la branche musculaire pour exposer le site pour l'artériotomie (Figure 1 et Figure 2).
- L'aide de micro-ciseaux, effectuer une artériotomie au point de l'artère fémorale et la branche musculaire branche. Si l'incision est faite dans la partie de l'artère, il peut être plus facile à cautériser. Utilisez une pince en équilibre sur un rouleau de ruban adhésif chirurgical pour stabiliser les micro-ciseaux.
- Pour tester la réussite de la cautérisation, rétablir la circulation sur l'artère fémorale en desserrant la suture proximale. En cas de saignement de l'artériotomie, répéter la cautérisation. Si le cautère est réussie, le flux sanguin sera réstocké distale par rapport à l'artériotomie.
- Présentez le fil et effectuer la blessure de fil tel que décrit à la section 4.
- Continuer à restreindre le flux sanguin dans l'artère fémorale. Chauffer une cautérisation à pointe fine au moins six pouces de la souris. Comme la pointe de cautérisation refroidit, l'appliquer légèrement côté de l'artériotomie pour fermer l'incision.
- Pour tester la réussite de la cautérisation, rétablir la circulation sur l'artère fémorale en desserrant la suture proximale. En cas de saignement de l'artériotomie, répéter la cautérisation. Si la cautérisation est réussie, le flux sanguin est rétabli en aval de l'artériotomie. Retirez le proximale temporaire et liens distales.
7. Implantation de périvasculaire Drug Delivery Patch
- Créer un patch de drogue périvasculaire peut être créé comme décrit dans les études précédentes 11 ou en utilisant des méthodes similaires. Émousser les coins de la région de barrière du timbre d'administration du médicament en utilisant des ciseaux stériles
- Placez la pat d'administration de médicamentsch sur l'artère fémorale blessé avec le côté de libération de médicament faisant face à l'artère. Si nécessaire, utilisez une pince pour améliorer la position du patch.
8. fermeture de la plaie et récupération
- Fermer la plaie avec une suture interrompue simple, consistant en noeuds carrés. Une suture discontinue prolonge la fermeture de la plaie en cas l'animal tente de supprimer la suture.
- Éteignez l'anesthésie et enlever l'animal de la mise en place. Permettre à l'animal de récupérer sur le coussin chauffant.
- Continuer à surveiller le rétablissement de la souris. Consultez le site de l'incision chaque jour pour se assurer qu'il reste fermé. Pour le traitement de la douleur post-chirurgicale, administrer une injection sous-cutanée de 5 mg / kg de carprofène toutes les 12 heures après l'intervention puis toutes les 12 heures pendant 2 jours. Si la douleur persiste au-delà des 2 premiers jours, consulter un vétérinaire pour les directions sur des médicaments de la douleur plus loin.
9. Les artères fémorales récolte pour l'histologie
- A 28 jours post-opératoires, effectuer l'euthanasie dioxyde de carbone sur la souris.
REMARQUE: La vitesse d'écoulement appropriée de dioxyde de carbone doit déplacer 10-30% de la chambre par minute et sera variable en fonction de la taille de la chambre utilisée. Coupe de la membrane et ponction cardiaque doit être effectuée comme méthode secondaire de l'euthanasie. - Fixez la souris en position couchée en utilisant du ruban chirurgical. Faire une incision sur l'artère fémorale, où l'incision chirurgicale initiale n'a été effectué.
- Pour les deux l'artère lésée et l'artère indemne de la jambe controlatérale, carrément disséquer et sécuriser tissus en utilisant des écarteurs et fixateurs rétracteurs magnétiques pour localiser l'artère fémorale environnante. Humidifiez les tissus en utilisant périodiquement solution saline pour l'irrigation. Appliquer une solution saline à l'aide d'un coton-tige stérile. Prenez soin de ne pas endommager l'artère.
- Après l'artère fémorale a été isolé à partir du site d'origine de l'artériotomie de l'aorte abdominale, attacher un segment de suture de soie près du site original de l'artériotomie. Cela aidera à identifier suture l'extrémité la plus distale de l'artère fémorale et la facilité de manutention de l'échantillon.
- En utilisant les ciseaux de microdissection d'exciser l'artère fémorale. Faire une incision à la suture distale. Faire l'autre incision sur l'extrémité opposée de l'artère fémorale, à côté de l'aorte abdominale.
- Transférer l'artère excisé à une boîte de Petri en verre contenant une solution saline. Disséquer l'artère plus pour éliminer l'excès de graisse ou de tissus conjonctifs. Retirez délicatement le sang de la lumière par un rinçage avec une solution saline.
- Transférer l'artère à un flacon de formol à 10% tamponnée. Conservez le flacon à 4 ° C avec doux balancement pendant 48 heures.
- Transférer l'artère fixée à 70% d'éthanol, de stocker jusqu'à ce qu'il soit traité pour une histologie.
- Incluez l'artère dans des blocs de paraffine et la section des blocs pour la coloration.
- Effectuer la coloration histochimique et immunochimique pour évaluer l'étendue de la blessure et l'intima hyperplasia.
NOTE: Pour les résultats représentatifs, nous avons utilisé hématoxyline et de l'éosine pour visualiser les noyaux et la morphologie globale ou Pentachrome une coloration de Movat de visualiser les lamelles élastique et d'autres composants artérielles.
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Representative Results
Après une lésion de fil, l'hyperplasie intimale se développe au fil du temps et est généralement examiné après 14 à 28 jours. Les techniques décrites dans ce travail de plomb en génération robuste de l'hyperplasie intimale chez la souris comme le montre les résultats histologiques de la figure 3. Une artère fémorale indemne démontreront lamelles élastique intacte et une épaisseur normale et la circonférence. Une artère fémorale blessés montrera hyperplasie intimale, dégradé lamelles élastique et démontrer réendothélialisation à des moments plus tard. Réendothélialisation est généralement complète à environ 21 jours, mais cela dépend de la souche de souris utilisées de fond et peut être évaluée à l'aide immunocoloration pour marqueurs endothéliaux sur les sections ou, de préférence, mesurées sur en préparations de visage en utilisant un colorant bleu d'Evans, la microscopie électronique à balayage ou immunocoloration avec microscopie confocale sur des préparations en face de l'artère. 17,18 Pour la quantification de l'hyperplasie intimale, ilest préférable de mesurer la surface de l'intima ou le rapport intima-media à trois sites le long de l'artère lésée pour tenir compte des variations de potentiel le long de la longueur de la région lésée de l'artère.
Figure 1: photographies des étapes critiques des deux méthodes pour blessures de fil dans l'artère fémorale Une comparaison des étapes de la méthode de ligature (en haut) à la méthode de cautérisation (en bas) pour effectuer une blessure de fil.. Dans la méthode de ligature, les deux sutures de fixation de la branche musculaire sont pré-liés de sorte qu'ils peuvent être serrées pour ligaturer la branche musculaire. Le plus distale des deux sutures de succursales musculaires est serré. L'insertion de artériotomie et le fil sont effectuées dans la branche musculaire. Après la blessure est effectuée, la suture restant sur la branche musculaire est serré et coupé. Dans le procédé de cautérisation, seulement une sAVENIR est bouclée sous la branche musculaire. L'artériotomie et l'insertion de fil sont effectuées au point de branche de la branche musculaire de l'artère fémorale. Après la blessure est effectuée, l'incision est cautérisée sans ligature soit l'artère fémorale ou de la branche musculaire. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: La hausse des photographies de grossissement des étapes critiques des deux techniques pour blessures de fil comparaison Close-up des étapes de la méthode de ligature (en haut) à la méthode de cautérisation (en bas).. L'emplacement de l'artériotomie est délimité par la ligne pointillée. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cettefigure.
Figure 3:. Les résultats histologiques représentatifs de blessures de fil 14 jours après la procédure histologique des sections artères ont été colorées à l'hématoxyline et de l'éosine (en haut) et pentachrome coloration de Movat (en bas). Étiquetés dans l'image sont la lumière (L), intima (I) et de la lame élastique (EL).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
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