Protocol
注：このプロトコルに示されているすべてのメソッドは、施設内動物管理使用委員会によって承認されている。
手術台の調製
- 解剖顕微鏡下で、手術台に温水を循環させるとともに加熱パッドを設定します。加熱パッド上にステンレス鋼製基板を置きます。ベースプレートと加熱パッド上の無菌吸収パッドを配置します。
- 隣接無菌の吸収パッド上の無菌手術器具を配置します。傾斜した先の細いピンセット2対の角度付き鉗子二対の三止血鉗子つ開創ワイヤ、小さな外科用ハサミ、マイクロ剪刀つ血管形成ワイヤ（0.15インチ径）と6.0絹縫合糸の3~6インチのセグメントを集める。
- 大腿動脈の曲に合わせて血管形成術線のラウンド終了を曲げる。これは、簡単に手術中にワイヤーを前進させるために行います。
の調製手術のためのマウス
- 2.5％のイソフルランの連続吸入により、マウスを麻酔。手順を通して、動物の状態を監視するようにしてください。それは完全に麻酔をかけていることを確認するために、マウスの足のピンチテストを実行します。ピンチ試験を投与した場合、動物が動かないことを確認してください。
- 乾燥を防ぐために、動物の目に潤滑軟膏を適用します。サージカルテープを使用して吸収パッドに仰臥位で動物を固定します。ノーズコーンを経由して、2.5％イソフルランを投与し続けます。
- 脱毛クリームを使用して、ミッドラインに足と腹部から毛を取り除く。水で十分に皮膚を洗い流す。脱毛は、手術の前に一日に行うことができる。クリームとの過度の治療は皮膚刺激につながる可能性があることに注意してください。
- すぐに手術の前に、皮膚を滅菌するために綿棒で脱毛した領域にポビドンヨードを適用します。 70％エタノールで脱毛し皮膚を洗い流すとドライ無菌の綿棒を持つ。 3回繰り返します。
- 皮下注射を介してのカルプロフェン5mg / kgの術前投与量を投与する。
大腿動脈の3.絶縁
- 小さな外科用ハサミを使用して、大腿動脈上の皮膚に湾曲した切開する。ぶっきらぼうに大腿動脈を見つけるために開創磁気リトラクター固定器を使用して周囲の組織を解剖し、固定します。無菌の綿棒を使用して生理食塩水を適用する灌漑用生理食塩水を使用して定期的に組織を湿らせます。
- ピンセットを用いて大腿動脈を分離します。静かに先の細いピンセットを用いて維管束から神経を分離する。静脈穿刺避け、神経を損傷しない。それを刺激避けるために離れてバンドルから神経を押してください。
- 静かに大腿分岐の位置を、大腿動脈から大腿静脈を分離する。分岐部の領域を解剖するのが特に困難である。
- P分岐、ループ6.0絹の大腿動脈の下で縫合し、止血剤との安全にosterior。この近位の縫合糸は、動脈内の血流を制限するために使用される。
注：焼灼法に対するライゲーション法を行う際関係に若干のばらつきがある（ 図1及び図2を参照）。 - 分岐部の遠位に、ループ6.0絹の大腿動脈の下で縫合し、止血剤で固定します。動脈の位置で、この遠位縫合糸を支援します。
- 大腿動脈の筋肉の枝の下にループ2本の縫合糸は、それらを事前にタイや止血剤で固定します。生理食塩水で組織を湿らすることを忘れないでください。ワイヤ傷害の焼灼法を実施した場合、唯一のループ付き縫合糸は、筋枝に必要である。
大腿動脈ワイヤ傷害の4.性能
- 近位縫合糸を引いて、大腿動脈への血流を制限します。少し遠位hemostを引っ張るATと止血動脈切開のためのサイトを公開するために枝を固定する。その周りに縫合糸を結びつけることによって筋肉の枝を結紮。
注：上向きの動脈をリフティングすると、より効果的に一人で水平に引っ張っよりも血流を制限します。 - 2本の縫合糸の間にメスで小枝を切除。マイクロはさみを使用して、分岐部の側枝に動脈切開を行う。マイクロハサミを安定させるための手術テープのロールにバランスのとれた鉗子を使用してください。
- 先の細いピンセットを用いて動脈切開の存在を確認。静かに鉗子で動脈切開の開口部を持ち上げる。鉗子を用いて動脈切開にワイヤーの丸い端部を導入する。ワイヤの前進を容易にするために、シリンジを用いて領域にリドカインの1つまたは2つの滴を加える。
- ワイヤーは、近位縫合糸に到達すると、縫合糸を解放し、ワイヤの前進を妨げることができないように調整する。それをさらに進めることができないまでワイヤーを挿入します。目の先端電子線は鼠径靭帯の領域に停止する必要があります。
- ワイヤーは1分間大腿動脈に残るようにします。傷つけると大腿動脈の内皮をdenude 10回を1分後に、後退させソーイング運動ワイヤを前進させる。あまり重症の怪我のために、ワイヤは動脈の内と外に引っ張られたり、わずか1分間の動脈にワイヤーを残している回数を減少させる。
- ゆっくりとワイヤーを撤回。ワイヤーの丸い端が近位縫合糸を経過すると、近位縫合糸を引くことによって動脈への流れを制限する。完全にワイヤーを撤回。
5.筋肉支店を連結
- 筋肉の枝に残っている縫合糸を締めます。これは動脈切開からの出血防止します。筋肉の枝に流れを戻し、血液がそこから漏れていないことを確認。筋肉の枝に縫合糸から端をトリミング。
6.代替方法：ローカライズされたカウ動脈切開のクタリゼーション
注：別のアプローチは、筋肉枝のライゲーションを回避し、より大きなメイン大腿動脈を通して血管アクセスを可能にするために取ることができる。
- 4.1から出発して、近位縫合糸を引くことにより大腿動脈への流れを制限する。遠位縫合糸と動脈切開（ 図1と図2）のためのサイトを公開するために少し筋肉の枝を固定して縫合糸を引き出します。
- マイクロはさみを使用して、大腿動脈と筋肉の枝の分岐点での動脈切開を行う。切開は、動脈の側で行われる場合には、焼灼するのがより容易であり得る。マイクロハサミを安定させるための手術テープのロールにバランスのとれた鉗子を使用してください。
- 焼灼の成功をテストするには、近位の縫合糸を緩めて大腿動脈への流れを復元する。出血が動脈切開から発生する場合は、焼灼を繰り返します。焼灼が成功した場合、血流が再され動脈切開の遠位に格納されている。
- ワイヤーを紹介し、4章で説明したように、ワイヤ傷害を行う。
- 大腿動脈への血流を制限し続ける。少なくとも6インチ離れてマウスから先の細い焼灼を熱し。焼灼先端が冷えると、切開を閉じるために動脈切開の側面を軽くそれを適用する。
- 焼灼の成功をテストするには、近位の縫合糸を緩めて大腿動脈への流れを復元する。出血が動脈切開から発生する場合は、焼灼を繰り返します。焼灼が成功した場合、血流が動脈切開の遠位に復元される。一時的な近位および遠位の関係を削除します。
血管周囲ドラッグデリバリーパッチの7。移植
- 血管周囲の薬剤パッチの作成11以前の研究で、または類似の方法を用いて説明したように作成することができる。無菌のハサミを使用して薬物送達パッチのバリア領域の角を鈍ら
- 薬物送達パットを配置動脈に直面して薬物放出側に負傷した大腿動脈の上にCH。必要に応じて、パッチの位置を改善するために鉗子を使用しています。
8.創傷閉鎖と回復
- 正方形の結び目からなるシンプルな中断された縫合糸で傷口を閉じます。不連続縫合糸は、動物が縫合糸を削除しようとする場合には、創傷閉鎖を延長。
- 麻酔をオフにして、セットアップから動物を削除する。動物が温暖化パッド上に回復することを許可する。
- マウスの回復を監視し続ける。それは閉じたままであることを確実にするために、毎日切開部位を確認してください。手術後の痛みの治療のために、2日間カルプロフェンの5〜10mg / kgの皮下注射、手術後12時間ごとに、その後12時間ごとに管理する。痛みは最初の2日間を超えて継続した場合、さらに鎮痛薬の指示のために獣医師に相談してください。
組織学9.収穫大腿動脈
- 手術後28日目に、マウスに、二酸化炭素の安楽死を行う。
NOTE：二酸化炭素の適切な流量は毎分室10〜30％を置換する必要があり、使用されるチャンバーのサイズに応じて変化するであろう。横隔膜と心臓穿刺の切断が安楽死の二法として行われるべきである。 - サージカルテープを使用して仰臥位でマウスを固定します。最初の外科的切開が行われた大腿動脈、上の切開を行います。
- 負傷した動脈と対側脚から無傷の動脈の両方のために、ぶっきらぼうに解剖し、大腿動脈を見つけるためにリトラクターと磁気リトラクター固定器を使用して周囲の組織に固定します。灌漑用の生理食塩水を使用して定期的に組織を湿らせます。無菌の綿棒を使用して生理食塩水を適用します。動脈を損傷しないように注意してください。
- 大腿動脈は腹部大動脈元動脈切開部位から単離された後に、ワンセグを結ぶ動脈切開の元のサイトの近くに絹縫合のメント。この縫合糸は、大腿動脈の最遠位端を特定し、試料の取り扱いを容易にするのに役立ちます。
- 大腿動脈を切除するためのマイクロ解剖ハサミを使用する。縫合糸の1切開遠位てください。腹部大動脈の横に、大腿動脈の反対側の端に他の切開を行います。
- 生理食塩水を含有するガラスシャーレに切除された動脈を転送します。過剰結合組織や脂肪を除去するためにさらに動脈を解剖。静かに生理食塩水ですすぐことによって内腔から血液を除去する。
- 10％緩衝ホルマリンのバイアルに動脈を転送します。穏やかに48時間揺らしながら4℃でバイアルに保管してください。
- それは組織学のために処理されるまで保存するために、70％エタノールに固定動脈を転送します。
- パラフィンブロックとセクション染色のためのブロックの中で動脈を埋め込みます。
- 傷害および内膜HYPの程度を評価するために組織化学的および免疫化学染色を行いますerplasia。
注：代表的な結果のために、我々は、弾性層板や他の動脈のコンポーネントを視覚化するために、核および全体的な形態またはモバットのペンタクロム染色を可視化するためにヘマトキシリンおよびエオシンを使用していました。
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Representative Results
ワイヤー損傷後、新生内膜過形成は、時間をかけて開発し、一般的に14〜28日後に検査される。 図3の組織学的結果を示すように、マウスにおける内膜過形成の堅固な生成に、この作業のリードに記載された技術は、無傷の大腿動脈は、無傷の弾性ラメラと通常の厚さ及び外周を実証する。負傷した大腿動脈は、内膜過形成を示し、弾性ラメラが劣化し、後の時点で再内皮のデモンストレーションを行います。再内皮化は、約21日後に典型的に完了したが、これは使用したマウスのバックグラウンド系統に依存し、切片上での内皮マーカーについて免疫染色を用いて評価し、又は、好ましくは、エバンスブルー色素は、走査型電子顕微鏡を用いて顔の調製途中で測定することができるまたは動脈の顔調製専用に共焦点顕微鏡を用いた免疫染色。17,18内膜過形成の定量化のためには、動脈の損傷領域の長さに沿った電位変動を考慮するために負傷した動脈に沿って3つのサイトでの内膜領域または内膜対メディア比を測定することが最善である。
図1：大腿動脈ワイヤ傷害のための二つの方法の重要なステップの写真をワイヤー傷害を実施するための焼灼法（下）にライゲーション法（上）するためのステップの比較。。ライゲーション法では、筋肉の分岐を固定する2本の縫合糸は、事前に結ばれている、彼らは筋肉枝を結紮する締め付けることができるように。 2筋肉の分岐縫合糸のより遠位に締められる。動脈切開ワイヤ挿入は筋肉分岐して行われる。傷害が行われた後、筋肉枝の残りの縫合糸が締めとトリミングされる。焼灼法では、一つだけのutureは筋肉の枝の下にループバックされます。動脈切開ワイヤ挿入は大腿動脈から筋肉枝の分岐点で行われる。怪我が実行された後、切開は、大腿動脈または筋肉の枝のいずれかを連結することなく、焼灼される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ワイヤー傷害のための2つの技術の重要なステップの高倍率写真焼灼法（下）にライゲーション法（上）するためのステップのクローズアップ比較。。動脈切開の位置が点線で区切られている。 これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。
図3：14日間処置後のワイヤ傷害の代表的な組織学的結果の動脈切片から組織をヘマトキシリンおよびエオシン（上）とモバットのペンタクロム染色（下）で染色した。画像中の標識された管腔（L）、内膜（I）及び弾性板（EL）である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
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