Protocol
注：在本协议中显示的所有方法已被批准的机构动物护理和使用委员会。
1.制备手术台的
- 成立加热垫与循环上手术台温水，解剖显微镜下。放置在不锈钢底板上的加热垫。放置在基板和加热垫无菌吸水垫。
- 安排在相邻的无菌吸水垫无菌手术工具。收集两对成角度的细尖镊子，两对成角度的镊子，三止血钳，2拉钩电线，小手术剪，微型剪刀，1血管成形术线（0.15英寸直径）的6.0丝缝合3 6英寸的段。
- 弯曲成形术线的圆端以匹配股动脉的曲率。这将使它更容易在手术过程中推进线。
2.制备鼠标手术
- 连续吸入2.5％异氟醚麻醉的小鼠。确保整个手术过程监控动物的状态。执行鼠标的脚的压紧测试，以确认其完全麻醉。确保动物时夹送测试施用不移动。
- 涂抹润滑软膏动物的眼睛，以防止干燥。固定动物在仰卧位使用外科胶带的吸收垫。继续通过鼻锥管理2.5％，异氟醚。
- 使用脱毛霜，去除腿部和腹部的皮毛到中线。用清水彻底冲洗皮肤。脱毛可以事先手术来进行一天。需要注意的是过度治疗与奶油可能导致皮肤刺激。
- 紧接外科手术前，应用碘伏到脱毛区域用棉签消毒皮肤。冲洗脱毛皮肤用70％乙醇和干用无菌棉签。重复3次。
- 通过皮下注射施用手术前剂量为5毫克/公斤卡洛芬的。
3.隔离股动脉
- 使用小手术剪，使一个弧形切口，在皮肤上的股动脉。用拉钩牵开磁性固定器，找到股动脉解剖直言和保护周围组织。滋润定期用生理盐水组织灌溉用消毒棉签应用生理盐水。
- 隔离使用镊子的股动脉。轻轻地用细尖镊子维管束分隔神经。避免穿刺静脉，不损伤神经。按神经离束，以避免刺激它。
- 轻轻分开从股动脉股静脉，定位股骨分叉。分叉的区域是特别困难剖析。
- Posterior分叉，环股动脉和安全用止血钳下一个6.0丝缝线。这个近端缝线将用于限制在动脉的血流。
注：在执行结扎方法与烧灼方法时有一个在关系略有变化（ 见图1和图2）。 - 远端分叉，股动脉下循环6.0丝线缝合，安全用止血钳。此远端缝合辅助中动脉的定位。
- 环2在股动脉的肌支缝合线，预配合他们，并用止血钳固定。记住滋润组织用生理盐水。如果执行丝损伤的烧灼方法中，只有一个环缝合线是必要的肌肉分支。
股动脉线损伤4.性能
- 通过拉动近端缝合限制血流进入股动脉。稍微拉远hemost在和止血钳固定支暴露部位的动脉切开术。通过把缝线周围结扎肌支。
注：向上提升的动脉会更有效地限制水平比单独拉血流量。 - 切断小分支两缝线之间的烧灼。采用微型剪刀，在分叉的侧枝执行动脉切开术。使用镊子外科带的辊平衡以稳定微剪刀。
- 确认用细尖镊子动脉切开术的存在。轻轻抬起与钳动脉切开开幕。电线的圆形端引入使用镊子的动脉切开术。为缓解丝的前进，一或两滴利多卡因添加到使用注射器的区域。
- 当线到达近侧缝合，松开缝合线，并调整它，以便它不能妨碍导线的进步。插入金属丝，直到它不能进一步前进。次的尖端Ë线应停止在腹股沟韧带的区域。
- 允许金属丝保持在股动脉一分钟。一分钟后，缩回和推进所述导线在锯切运动十次伤害和剥夺股动脉的内皮。对于更低的严重程度的损伤，减少的次线被拉动和流出动脉的数目或离开丝在动脉仅1分钟。
- 拉回金属丝缓慢。当线的圆端已通过近端缝合，通过拉动近端缝合限制流进动脉。完全缩回线。
5.结扎肌支
- 拧紧肌支剩余的缝合。这将防止从动脉切开出血。回流到肌支，并确认血液不能从中泄漏。修剪从缝合线两端的肌支。
6.替代方法：本地化驹动脉切开术的terization
注：另一种方法，可采取避免肌肉分支结扎，并允许通过较大主股动脉血管通路。
- 从4.1开始，通过拉动近端缝合限制流动到股动脉。拉远侧缝合和缝线固定肌肉分支略微露出的部位的动脉切开术（ 图1和图2）。
- 采用微型剪刀，在股动脉和肌肉分支的分支点执行动脉切开术。如果切口是在动脉的侧面，它可以更容易地烧灼。使用镊子外科带的辊平衡以稳定微剪刀。
- 为了测试烧灼的成功，通过松开近端缝线恢复流动到股动脉。如果发生在动脉切开出血，反复烧灼。如果烧灼是成功的，血流将被重新存储远端的动脉切开术。
- 引入线和在第4节进行导线损伤。
- 继续限制血流进入股动脉。热火细尖烧灼至少6英寸远离鼠标。由于烧灼尖端冷却，轻轻地应用它侧动脉切开术，以关闭切口。
- 为了测试烧灼的成功，通过松开近端缝线恢复流动到股动脉。如果发生在动脉切开出血，反复烧灼。如果烧灼是成功的，血流将恢复远端的动脉切开术。除去临时近端和远端的关系。
7.植入血管周围给药的补丁
- 创建血管周围药物贴剂可如先前的研究11或通过使用类似的方法描述来创建。生硬的药物递送贴片的使用无菌剪刀阻挡区域的角
- 放置药物递送轻拍CH到受伤的股动脉与药物释放面朝动脉。必要时，可使用产钳来提高贴片的位置。
8.伤口愈合和恢复
- 关闭伤口用一个简单间断缝合组成的平方海里。不连续缝合延长伤口愈合的情况下动物尝试删除缝合。
- 关掉麻醉，并从该组向上取出动物。让动物恢复的变暖垫。
- 继续关注鼠标的复苏。检查切口部位每一天，以确保它保持闭合。用于治疗手术后疼痛，管理一个皮下注射5毫克/公斤的卡布洛芬，每12小时的手术后，然后每12小时2天。如果疼痛持续超过了最初的2天，请教兽医进一步止痛药的方向。
9.收获股动脉组织学
- 28天手术后，对小鼠进行二氧化碳安乐死。
注：二氧化碳的适当流速应置换为每分钟腔的10-30％，并会根据所使用的腔室的大小而异。切割膜片和心脏穿刺的应执行安乐死的次级方法。 - 确保鼠标在使用医用胶带仰卧位。做一个切口在大腿动脉，其中的初始手术切口制成。
- 对于这两个受伤的动脉和对侧的腿未受伤的动脉，直言解剖和安全的使用环境拉钩和磁牵引器固定器，找到股动脉组织。滋润定期用盐水灌溉的组织。使用无菌棉签申请盐水。小心不要损坏动脉。
- 后股动脉已被隔离从原来的动脉切开的部位的腹主动脉，扎赛格换货附近的动脉切开的原址丝线缝合的。此缝合将有助于确定股动脉的最远端和缓和处理样品。
- 使用显微解剖剪切除股动脉。使一个切口远侧的缝合。使上股动脉的相对端的另一切口，腹主动脉旁。
- 切除的动脉转移到含有生理盐水的玻璃培养皿。进一步剖析动脉，去除多余的结缔组织和脂肪。轻轻地用生理盐水冲洗，从管腔清除血液。
- 动脉转移到10％的福尔马林缓冲液的小瓶。储存小瓶在4℃下轻轻摇动48小时。
- 固定动脉转移到70％的乙醇，以存储直到它被处理用于组织学。
- 嵌入在石蜡块和部分染色块的动脉。
- 进行组织化学和免疫组织化学染色评估损伤内膜HYP程度erplasia。
注：对于代表的结果，我们采用HE染色，以可视化的核和整体形态或Movat的Pentachrome染色可视化的弹性薄片和其他动脉成分。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
以下电线损伤，内膜增生的发展随着时间的推移和后14〜28天，通常检验。在这项工作中铅的小鼠描述健壮代内膜增生， 如图组织学结果的技术的3。一种未受伤的股动脉将展示完整的弹性薄片和一个正常的厚度和周长。受伤的股动脉将显示内膜增生，降低弹性片层和展示再内皮化，在以后的时间点。再内皮通常完全在约21天，但此取决于所使用的小鼠的背景应变，并且可以使用免疫染色对切片内皮标记物，或优选，测得的上连接使用伊文思蓝染料脸制剂进行评估，扫描电子显微镜免疫组化或与连接的动脉面对准备共聚焦显微镜，17,18对于内膜增生量化它最好是测量内膜面积或内膜到媒体比在三个地点沿受伤动脉占沿动脉的损伤区域的长度的电位变化。
图1：这两种方法用于线损伤的股动脉的关键步骤的照片的步骤，为结扎法（顶部）向烧灼方法（底），用于执行丝损伤 的比较。在连接法中，两个缝线固定肌肉分支是预先打结，以便它们可以被收紧结扎肌肉分支。两个肌支缝线的更远端被紧固。动脉切开术和电线插入在肌肉分支执行。之后进行的损伤，对肌肉分支剩余缝线收紧和修整。在烧灼的方法，只有一个Suture是根据肌支循环。动脉切开术和电线插入是在肌肉分支从股动脉分支点执行。在执行完损伤，切口无烧灼或者结扎股动脉或肌支。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：这两种技术的电线受伤的关键步骤高倍照片为结扎法（顶部）向烧灼方法（底）的步骤特写比较。动脉切开术的位置划分的虚线。 请点击此处查看本一个更大的版本数字。
图3：电线受伤从动脉部分中的过程的组织学在14天后代表性的组织学结果用苏木精和曙红（上）和Movat的pentachrome染色（底部）。标记图像中有内腔（L），内膜（I）和弹性层（EL）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
- Hoffmann, R., Mintz, G. S. Coronary in-stent restenosis - predictors, treatment and prevention. Eur Heart J. 21 (21), 1739-1749 (2000).
- Erbel, R., et al. Coronary-artery stenting compared with balloon angioplasty for restenosis after initial balloon angioplasty. Restenosis Stent Study Group. N Engl J Med. 339 (23), 1672-1678 (1998).
- Farooq, V., Gogas, B. D., Serruys, P. W. Restenosis: delineating the numerous causes of drug-eluting stent restenosis. Circ Cardiovasc Interv. 4 (2), 195-205 (2011).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. Br Med Bull. 106, 193-211 (2013).
- Garg, S., Serruys, P. W. Coronary stents: current status. J Am Coll Cardiol. 56 (10 Suppl), S1-S42 (2010).
- Park, S. J., Kim, Y. H. Current status of percutaneous coronary intervention with drug-eluting stents in Asia. Circulation. 118 (25), 2730-2737 (2008).
- Alfonso, F. Treatment of drug-eluting stent restenosis the new pilgrimage: quo vadis. J Am Coll Cardiol. 55 (24), 2717-2720 (2010).
- Dake, M. D., et al. Paclitaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease: twelve-month Zilver PTX randomized study results. Circ Cardiovasc Interv. 4 (5), 495-504 (2011).
- Bosiers, M., et al. Results of the Protege EverFlex 200-mm-long nitinol stent (ev3) in TASC C and D femoropopliteal lesions. J Vasc Surg. 54 (4), 1042-1050 (2011).
- Duda, S. H., et al. Drug-eluting and bare nitinol stents for the treatment of atherosclerotic lesions in the superficial femoral artery: long-term results from the SIROCCO trial. J Endovasc Ther. 13 (6), 701-710 (2006).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (10), 2238-2244 (1997).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Roque, M., et al. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20 (2), 335-342 (2000).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Edelman, E. R., Adams, D. H., Karnovsky, M. J. Effect of controlled adventitial heparin delivery on smooth muscle cell proliferation following endothelial injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3773-3777 (1990).
- Stemerman, M. B., Ross, R. Experimental arteriosclerosis. I. Fibrous plaque formation in primates, an electron microscope study. J Exp Med. 136 (4), 769-789 (1972).
- Brouchet, L., et al. Estradiol accelerates reendothelialization in mouse carotid artery through estrogen receptor-alpha but not estrogen receptor-beta. Circulation. 103 (3), 423-428 (2001).
- Filipe, C., et al. Estradiol accelerates endothelial healing through the retrograde commitment of uninjured endothelium. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2822-H2830 (2008).
- Feuls, R., et al. Microvascular denudation of the femoral artery of the mouse as a model for restenosis. Rofo. 175 (7), 952-957 (2003).
- Holt, A. W., Tulis, D. A. Experimental Rat and Mouse Carotid Artery Surgery: Injury & Remodeling Studies. ISRN Minim Invasive Surg. 2013, (2013).
- Iafrati, M. D., et al. Estrogen inhibits the vascular injury response in estrogen receptor alpha-deficient mice. Nat Med. 3 (5), 545-548 (1997).
- Sullivan, T. R., et al. Estrogen inhibits the response-to-injury in a mouse carotid artery model. J Clin Invest. 96 (5), 2482-2488 (1995).
- Yin, Y., Zhao, X., Fang, Y., Huang, L. Carotid artery wire injury mouse model with a nonmicrosurgical procedure. Vascular. 18 (4), 221-226 (2010).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), (2010).
- Kuhlmann, M. T., et al. Implantation of a carotid cuff for triggering shear-stress induced atherosclerosis in mice. J Vis Exp. (59), (2012).
- Carmeliet, P., et al. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular electric injury in mice. Am J Pathol. 150 (2), 761-776 (1997).
