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Biology

Demostración Laboratorio Fisiología: tasa de filtración glomerular en una rata

doi: 10.3791/52425 Published: July 26, 2015

Protocol

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Antes de cualquier procedimiento de animales, el cuidado de los animales y el uso comité institucional (IACUC) debe aprobar el protocolo. Este protocolo fue aprobado por la Universidad Estatal de Michigan IACUC.

1. Preparación Pre-laboratorio de la solución de FITC-inulina

  1. Caliente 20 ml de solución salina a 70 ° C y agitar lentamente en 100 mg de FITC-inulina (5 mg / ml de FITC-inulina) hasta que se disuelva todo inulina.
  2. Solución enfriar a ta y añadir 800 mg de albúmina de suero bovino (40 mg / ml de BSA, polvo liofilizado, esencialmente globulina libre, bajo la endotoxina, ≥98% de pureza por electroforesis en gel de agarosa).
  3. Se filtra la solución de inulina-BSA con papel de filtro (grado 1). Coloque la solución filtrada en una jeringa de 20 ml con un filtro de jeringa de punta (0,2 micras) y cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz.

2. Anestesia y Cirugía

  1. Coloque la rata en una cámara de inducción lleno con 5% de isoflurano para inducir la anestesia. Bod Recordpeso y (250-350 g) y coloque la rata en una plataforma quirúrgica calentada diseñado para mantener 37 ° C la temperatura del cuerpo durante todo el experimento. Asegurar suavemente la rata a la plataforma con cinta de laboratorio sobre las patas. Mantener la anestesia con isoflurano al 1-2% con grado médico 100% de O 2 a la tasa de flujo de aire de 0,8 a 1,0 l / min.
  2. Inserte un catéter cónico (OD punta intravascular, 2.7F) en la arteria femoral de la presión arterial y la frecuencia cardíaca, y toma de muestras de sangre.
  3. Insertar un catéter (PE-50) en la vena femoral para la infusión de inulina. Asegure el catéter al tejido circundante con sutura quirúrgica trenzada seda 5-O 6.
  4. Conecte el catéter arterial a un transductor de presión del calibrador de tensión. La presión arterial y la frecuencia cardíaca Record usando software de adquisición de datos y visualización en una pantalla de ordenador en tiempo real. Esta técnica se muestra en detalle en el vídeo 6.
  5. Exponer la vejiga a través de una incisión suprapúbica. Corte un pequeñoagujero en la punta de la vejiga e insertar una cánula (PE-190) con un calor extremo estallaron dentro de la vejiga para la recolección de orina. Fije la cánula a la vejiga con una sutura en bolsa de tabaco.

3. La orina y extracción de sangre

  1. Coloque la jeringa de FITC-inulina en una bomba de jeringa con un caudal conjunto de 1 ml / hr por 100 g de peso corporal (3 ml / h para una rata de pesaje 300 g). Conecte la jeringa al catéter de la vena femoral. Iniciar la infusión de inulina y permitir un período de equilibrio 2.1 hr. Mantenga la jeringa cubierto con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
  2. Determinar si la tasa de flujo de orina es estable y adecuado para el análisis de la muestra (20 l / min) por recogida de una muestra de orina en un vial de recogida pesada previamente durante un período de 10 min. Determinar el volumen de orina por gravimetría con una balanza digital. Un volumen de orina adecuada para un periodo de recogida de 10 minutos es de 0,2 ml. Continuar para recoger muestras de orina hasta dos colecciones consecutivos indican una tasa de flujo de orina de 20 l / men o más.
  3. Muestras Pre-Droga
    1. Se recoge una muestra de orina durante un período de 20 min. Se recoge una muestra de sangre (0,5 ml) del catéter arterial en el punto medio del período de recolección de orina. Tenga cuidado para borrar por completo el catéter arterial de solución salina antes de recoger una muestra de sangre en un frasco de colección que contiene 1 U de heparina. Utilice viales de colección con las marcas de volumen para facilitar la recogida de 0,5 ml de sangre arterial.
    2. Enjuague el catéter arterial con heparina-solución salina (20 U / ml) para borrar el catéter de la sangre (aprox. 0,1 ml). La longitud del catéter arterial debe ser tan corto como sea posible para limitar el volumen de solución salina de heparina necesaria para tirar.
      Nota: Las muestras de sangre diluidas producen cálculos incorrectos de la TFG y la excreción fraccional de Na y K.
    3. Espere 10 minutos y repetir el cobro de una segunda orina Pre-drogas y muestra de sangre.
  4. Después de la colección de dos muestras Pre-drogas, administrar un diurético Drug, furosemida (10 mg / kg), a través del catéter arterial. Lave el catéter arterial con solución salina heparinizada para despejar el catéter de la droga. Tenga cuidado para evitar la inyección de aire a través del catéter arterial. Registre el momento de la inyección de furosemida.
  5. Las muestras post-drogas: En cada uno de los 3 puntos de tiempo abajo, recoger una muestra de orina durante el período de recogida de 10 minutos, y una muestra de sangre (0,5 ml) en el punto medio del período de recolección de orina.
    1. Para Post-Drogas de la muestra 1 - recoger cinco minutos después de la furosemida.
    2. Para la muestra post-Drogas 2 - recoger diez minutos después de la furosemida.
    3. Para la muestra post-Drogas 3 - recoger quince minutos después de la furosemida.
  6. Después se han recogido todas las muestras, la eutanasia la rata de conformidad con los procedimientos institucionales de la toracotomía y la extracción del corazón. Retire ambos riñones. Decapsulate (quitar la membrana que rodea) y sacudir a los riñones a eliminar el exceso de sangre. Pesar los riñones.

  1. Mida todos los volúmenes de muestra de orina por gravimetría con una balanza digital y pesos de discos.
  2. Muestras de sangre entera de centrífuga con una centrífuga de sobremesa (1800 xg) para separar el plasma. Transferir las muestras de plasma a los pequeños viales etiquetados.
  3. Analizar las concentraciones de Na y K en las muestras de orina y plasma con un analizador de sodio / potasio.
  4. Medición de FITC-inulina en plasma y orina
    1. Diluir la orina pre-fármaco (de 1: 200 a 1: 400), y la orina post-fármaco (1:10) con tampón HEPES (500 mM, pH 7,4).
    2. Añadir 40 l de l estándar o muestra y 60 de tampón HEPES en una placa de 96 pocillos (una muestra por pocillo) y se deja mezclar durante 10 min mientras está cubierto con papel de aluminio.
    3. Generar una curva estándar para FITC-inulina para las concentraciones de 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 g / ml (Figura 1). Determinar la fluorescencia FITC-inulina en las muestras y estándares utilizando un lector de microplacas con su excitas y emisión de longitudes de onda 485 y 538 nm, respectivamente.
    4. Ajustar los valores fluorescentes para los estándares de un análisis de regresión la función logística de 4 paramter. Los parámetros de la función de regresión se utilizan para calcular la concentración de FITC-inulina en muestras de plasma y orina (Tabla 1).

Análisis 5. Post-laboratorio de Resultados: Cálculos

  1. Calcula orina Caudal (UV; ml / min): [volumen de orina recogido (ml)] ÷ [momento de la recolección (min)]
  2. Calcular tasa de filtración glomerular (TFG; ml / min): [concentración de inulina de orina (mg / ml) x UV (ml / min)] ÷ [inulina concentrado de plasma. (G / ml)]
  3. Calcular filtrada de sodio de carga (mol / min): concentración plasmática de sodio (mmol / ml) x TFG (ml / min)
  4. Calcular sodio Excreción Rate (U Na V; mol / min): concentración de sodio en orina (mol / ml) x UV (ml / min)
  5. Calcula fraccional excreción de sodio (Na FE;%): [U Na V (mol / min)] ÷ [Filtrado de carga de sodio (mmol / min)] x 100
  6. Calcular carga filtrada de potasio (mol / min): concentración de potasio de plasma (mmol / ml) x TFG (ml / min)
  7. Calcular potasio Excreción Rate (U K V; mol / min): concentración de potasio en orina (mol / ml) x UV (ml / min)
  8. Calcula fraccional excreción de potasio (K FE;%): [U K V (mol / min)] ÷ [Cargar potasio filtrada (mol / min)] x 100

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Representative Results

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El diurético utilizado en la demostración de laboratorio era furosemida que inhibe muy rápidamente la reabsorción de Na y K filtrada por el riñón resulta en aumento de Na, K, y la excreción de agua en cuestión de minutos de la administración del fármaco. Por su mecanismo primario, furosemida debe tener efectos mínimos sobre la tasa de filtración glomerular y de la carga filtrada de Na y K, pero aumentará el flujo de orina y la excreción fraccional de Na y K.

Los resultados representativos en la Tabla 3 muestran que en una rata anestesiada, la media de los valores pre-farmacológicos para la TFG era 3,2 ml / min, Na excreción fue 0,58 mol / min (0,1% de la carga filtrada), y K excreción fue 4,4 mol / min (27% de la carga filtrada). Cinco minutos después de la furosemida (post-droga 1), la TFG y la carga filtrada de Na y K no se vieron afectados. Sin embargo, la excreción fraccional de Na aumentó a 11,5%, y la excreción fraccional de K aumentó a 63% de las respectivas cargas filtrados. Las mediciones de MAP y HR indicar que la furosemida tuvo efectos mínimos sobre MAP y HR (Tabla 2).

Los índices de la función renal evaluados en la demostración de laboratorio fueron la tasa de filtración glomerular, que se define como la tasa por el cual el plasma se filtra por el riñón; el Na se filtró y K, definido como el tipo por el que Na y K son filtrados por el riñón; Na y K excreción Rate, definida como la tasa por el cual Na y K son excretados por el riñón; y la excreción fraccional de Na y K, definido como el porcentaje de filtrado Na y K que se excreta por el riñón

Figura 1
Figura 1: La inulina. Curva estándar valores de fluorescencia FITC se muestran para los estándares que contienen 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200 y 400 mg / ml de inulina. Un análisis de regresión la función logística de 4 paramter genera la curva de mejor ajuste. Los parámetros de la función de regresión a partir de esta curva se utilizaron para calcular FIConcentración de TC-inulina en muestras de plasma y orina.

ht "> 1208.9
FITC-inulina de fluorescencia Concentración Resultado
Estándar replicar 1 replicar 2 Significar g / ml Dilución g / ml
Blanco 63.9 64.8 64.4 0.4 1 0.4
6.25 253.2 264.1 258.7 5.9 1 5.9
12.5 474.0 </ Td> 491.3 482.7 12.5 1 12.5
25 854.8 881.3 868.1 24.4 1 24.4
50 1617.1 1618.0 1617.6 50.3 1 50.3
100 2813.1 2846.1 2829.6 101.3 1 101.3
200 4367.3 4588.7 4478.0 198.2 1 198.2
400 6258.0 6650.0 6454.0 401.6 1 401.6
Muestra de orina
Pre-drogas 1 2443.9 2062.3 2253.1 88.5 200 17700
Pre-drogas 2 2266.5 1707.0 1986.8 76.3 200 15250
Post-drogas 1 1391.2 1300.1 44.7 10 447
Post-drogas 2 2753.4 2120.5 2437.0 97.0 10 970
Post-drogas 3 2888.3 3178.0 3033.2 124.4 10 1244

Tabla 1:. Resultados de la muestra de valores de fluorescencia inulina Ensayo de FITC-inulina se muestran para el blanco de reactivos, 7 normas, y 5 muestras de orina. Normas y muestras se analizaron por duplicado y se diluyeron según sea necesario. Se utilizó la fluorescencia media para cada muestra para calcular la concentración de inulina. Las concentraciones de inulina en estas muestras de orina se incluyen en la tabla de medidas (Tabla 2).

Tabla 2
Tabla 2: mediciones registradas durante la demostración Renal Lab Función Las variables registradas durante cinco períodos de tiempo (dos Pre-drogas y tres después de la droga) de la demostración de laboratorio de la función renal son la derecha y la izquierda de peso del riñón, presión arterial media (MAP),. la frecuencia cardíaca (HR), el tiempo de muestra, el volumen de orina, plasma y orina de sodio (Na), potasio (K), y las concentraciones de inulina. Las concentraciones de inulina de orina se determinaron a partir del ensayo de inulina muestra en la Tabla 1.

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Tabla 3:. Parámetros de función renal calculados a partir de medidas grabadas utilizando las fórmulas que se muestran en la sección 5 del Protocolo, las variables registradas (Tabla 2) se utilizan para calcular la tasa de flujo de la orina, la tasa de filtración glomerular (TFG), peso TFG / g de riñón, la tasa de excreción , carga filtrada, y la excreción fraccional de sodio (Na) y potasio (K) durante los dos Pre-drogas y tres períodos Post-drogas.

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Discussion

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Un marcador adecuado para la medición de la TFG debe cumplir con cuatro criterios: se filtra libremente en el glomérulo, sea no unido a las proteínas plasmáticas, y ni ser absorbida ni secreta en la nefrona. La inulina es un polímero de la fructosa que satisface estos criterios. Como resultado, el aclaramiento renal de inulina se considera el estándar de oro para medir la TFG 7. La técnica demostrada representa el enfoque tradicional de la determinación del aclaramiento renal de inulina usando muestras de orina programadas durante una infusión constante de inulina 8,9. Mediciones de inulina tradicionales se han hecho utilizando el método de antrona para producir una determinación colorimétrica cuantitativa de inulina medido por espectrofotómetro 10,11. Sin embargo, en un intento de facilitar la medición de la inulina en volúmenes más pequeños de orina y plasma, la inulina ha sido etiquetado con radiactivas 12-14, y etiquetas fluorescentes 15-17. La demostración de laboratorio se presenta en este u vídeosed marcado con FITC inulina para la medición de la función renal debido a la falta de riesgo de exposición a la radiación humana y la facilidad de la medición de la fluorescencia FITC 15.

Esta demostración de laboratorio tiene por objeto proporcionar una comprensión conceptual de cómo medir la función renal a los estudiantes con habilidades mínimas de laboratorio. Por lo tanto, la preparación pre-lab de solución de FITC-inulina, y la preparación quirúrgica de los animales se llevan a cabo por técnicos experimentados antes del comienzo de la manifestación. Los estudiantes llegan a la manifestación al final del período de equilibrio inulina 01.02 h. En este tiempo, los estudiantes se les presenta una visión general de Pre-laboratorio e informados de los procedimientos que se han realizado sobre los animales. Dos estudiantes son asignados a un experimento con animales, e instruidos sobre cómo recoger muestras de sangre y orina antes y después de la administración del fármaco diurético. El análisis de las muestras de sangre y orina se lleva a cabo por experielos técnicos y los resultados nz se entregan a los estudiantes para el cálculo de la función renal. Los resultados se presentan durante una discusión post-laboratorio que puede ser programada después de la manifestación.

Hay varios pasos críticos en el protocolo para asegurar respuestas válidas. En primer lugar, FITC inulina debe estar completamente disuelto y se filtró antes de la administración animal. Idealmente, FITC inulina debe dializó en agua durante 48 horas a RT para eliminar FITC no unido residual. En segundo lugar, las muestras de plasma deben estar libres de solución salina. Los estudiantes son instruidos para recoger una muestra de sangre sólo después de toda la solución salina en el catéter arterial ha sido expulsado y sólo la sangre está fluyendo fuera del catéter. Las muestras de sangre que se diluyen con solución salina proporcionarán valores inexactos de inulina de plasma, sodio y potasio. En tercer lugar, el flujo de la orina debe ser constante y adecuada para producir suficiente muestra para el análisis. Una tasa de flujo de orina estable en la línea de base es fundamental, ya que es una indicación deuna preparación experimental estable. Si el flujo de orina es demasiado bajo, la velocidad de infusión de inulina se puede aumentar antes de muestrear colecciones. Sin embargo, la infusión de inulina debe ser constante durante el curso del experimento, es decir, la velocidad de infusión de inulina no debe ser ajustado durante el experimento. Finalmente, la medición de la fluorescencia de inulina en muestras de plasma y orina por lector de microplacas es crítica para un experimento exitoso. Dado que las especificaciones del lector de microplacas determinarán si las muestras requieren diluciones, se recomienda que una prueba de funcionamiento del ensayo inulina se realizará antes de la demostración de laboratorio con el fin de optimizar las especificaciones del lector de microplacas y asegurar que los valores de la muestra de fluorescencia son dentro de la gama media de la curva estándar.

Si bien la evaluación de la función renal basado en el aclaramiento renal de inulina se considera el estándar de oro, esta técnica tiene limitaciones debido a que los animales deben ser anestesiados, yinstrumentado con vasculares y vesicales catéteres. Agentes Anesthethetic han sido demostrado que afectan a la hemodinámica renal y la TFG 18,19; sin embargo isoflurano y Inactin se utilizan normalmente en los experimentos de la función renal debido a sus efectos mínimos sobre el riñón 19,20. La técnica de aclaramiento de inulina también requiere una infusión constante de muestras de sangre y de inulina múltiple y de plasma que puede ser prohibitivo en animales más pequeños tales como ratones. Las modificaciones de esta técnica se han desarrollado para permitir la medición de aclaramiento plasmático a partir de una única inyección de inulina en animales conscientes 21. Estas modificaciones también requieren volúmenes más pequeños de muestras de sangre para el análisis, y proporcionan un método alternativo para evaluar la función renal en ratones.

La medición de la función renal es aplicable a estudios de fisiología, patología, toxicología, farmacología y enfermedades estados. Los estudiantes que participan en la manifestación de la función renal aprenderán tque la técnica estándar de oro de la depuración renal de inulina para evaluar la función renal. Por el dominio de esta técnica, los estudiantes van a entender los principios de la función renal y permitirles aplicar la técnica para sus propias investigaciones y determinar si las modificaciones de la técnica son adecuados para sus estudios.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son las opiniones privadas del autor y no deben ser interpretados como funcionario o como el reflejo de las opiniones del Departamento del Ejército o el Departamento de Defensa.

Acknowledgments

La fuente de financiamiento para la demostración de laboratorio fue subvención NIGMS: GM077119. Agradecemos al Dr. José R. Haywood y el Dr. Peter Cobbett por su apoyo a la corta Couse en Integrativa y sistemas de órganos Farmacología. También agradecemos a la Sra Hannah Garver por su apoyo técnico de la demostración de laboratorio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033
Assay Plate, 96-Well Costar  3922
Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G
Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG
Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200
Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0
Digital Scale  Denver Instrument APX-4001
FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G
Gauze Sponges Covidien 2146
Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212
Heparin Sagnet NDC 25021-402-10
HEPES Sigma Chemical Co H3375
Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F
Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12
PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435
Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199
Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01
Salix Furosemide 5% Intervet #34-478
Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11
Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12
Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump Razel Scientific R99-E
Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12
Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420

5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420

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References

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