Abstract
Исследование в области использования вируса-опосредованного переноса генов, чтобы арестовать или обратить вспять процесс утраты слуха в значительной степени были отнесены к периферической слуховой системы. В нескольких исследованиях изучали перенос генов к центральной слуховой системы. Спинной Cochlear Nucleus (DCN) ствола мозга, который содержит второй нейронов порядка слухового пути, это потенциальное место для переноса генов. В этом протоколе, техника для прямого и максимальному облучению мышиного DCN через задней черепной ямки подхода продемонстрирована. Такой подход позволяет любой острой или выживания хирургии. После прямой визуализации DCN, хозяин экспериментов можно, в том числе инъекции опсинов в кохлеарной ядра и последующим стимуляции оптического волокна в сочетании с синим светом лазера. Другие эксперименты нейрофизиологии, такие как электрической стимуляции и нейронных начертаний форсунок также возможны. Уровень visualizaции и продолжительность стимуляции достижимо делают этот подход применим к широкому кругу экспериментов.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные процедуры выполняются в соответствии с уходу и использованию комитета животных из Массачусетского глаз и ушей лазарет и Гарвардской медицинской школы, которые следуют национальные руководящие принципы по уходу за животными, в том числе политики общественного здравоохранения по гуманное лечение и использования лабораторных животных, ИЛАР Руководство и Закон защиты животных. Экспериментальные процедуры, перечисленные ниже подробно воздействии на левой DCN. Используйте стерильные инструменты при выполнении операции выживания.
1. Первичная Краниотомия и Спинной Cochlear Nucleus экспозиции
- Анестезия
- Обезболить мыши в возрасте 8-12 недель, весом 18-24 г, с ксилазина 20 мг / кг кетамина и 100 мг / кг через внутрибрюшинного введения. Подтвердите надлежащего анестезии сердечного ритма мониторинга, частоту дыхания, а также ног щепотку отмены рефлекса. Место ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. После того, как адекватно под наркозом, бритье волос, покрывающий тон скальп, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к хирургической операции.
- Хирургическое позиционирования
- Наведите надежно в небольшом владельца животного стереотаксической, удерживается на месте с помощью рыла зажима.
- Убедитесь, что морда зажим достаточно свободно, чтобы обеспечить адекватное дыхание, но достаточно плотно, чтобы полностью обездвижить голову мыши. Если головка мышь свободно, животное может выпасть из держателя головки во время краниотомии части процедуры.
- Поместите слуховые ствола мозга имплантатов электродов в стандартном моды, что позволяет для мониторинга сердечного ритма. Частота дыхания должны контролироваться визуализации. Следует отметить, что нормальный сердечный ритм и частота дыхания может изменяться в зависимости от возраста мыши.
- Термометр помещают и euthermia обеспечивается путем размещения на теплокровных одеяло отопления.
- Разрез кожи и разоблачение interparietal и затылочной костей черепа
- Под microscОПЕ, сделать вертикальный разрез через кожу, начиная с средней линии, непосредственно между ушной раковины, а также включить в каудальной части затылка. После срединный разрез кожи, вытеснять кожу с боков. Представьте мышцы, охватывающие левую заднюю сторону черепа.
- Удалить мышцы, покрывающий левую теменную, interparietal и затылочные кости черепа по экзартикуляции вложений мышечных их соответствующих костей с помощью скальпеля или радужной оболочки глаза ножницами. Соблюдайте небольшую степень кровотечения по разрезу мышечных краев. Свернуть это при слабом давлении с ватным наконечником аппликатора на 10-15 сек.
- Краниотомия вышележащих Cochlear Nucleus
- Определить соответствующие строки шов, в том числе в сагиттальной и лямбда швов линий (рис 1, слева).
- Использование кусачек, сделать трепанацию черепа над Кость инков, слева от срединной линии, ~ 2 мм каудально к лямбда шва. Этот регион покрывает DCN.
- Followinг трепанация черепа, наблюдать тонкий слой твердой мозговой оболочки, что перекрывает мозжечок. Использование лезвие скальпеля, удалить твердую мозговую оболочку. (Рисунок 1, средняя панель).
Примечание: Удаление твердой мозговой оболочки может вызвать небольшую степень кровотечения. Этот процесс с использованием лезвие скальпеля, чтобы удалить твердую мозговую оболочку предназначен, чтобы уменьшить количество кровопотери во время мозжечка аспирации, которая будет бассейн на поверхности мозга и неясной идентификации DCN. Общий объем крови мыши ~ 1,5 мл не должна превышать> чем на 15%. Если кровотечение превышает эту сумму, мышь должна быть обеспечена с добавками жидкости. - Удалить свернувшейся крови, покрывающий мозжечок ватным наконечником аппликатором. При желании, мягко капать солевой раствор с помощью зубной точку на мозжечке, чтобы очистить кровь от крови.
- Мозжечка Стремление
- Использование 5 французскую всасывания, аспирации в поперечном направлении наиболее части левой мозжечка, покрывающей DCN до DCN не по отношениюUAL (рис 1, справа). Удалить примерно от 1/4 до 1/3 от левой мозжечка. Главная достопримечательность рядом с DCN является ампула высшего полукружных каналов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стремление мозжечка ключевым шагом протокола. Режиссер стремление мозжечка наиболее успешно выполняется, если это происходит в одной попытке, а не с несколькими проходами всасывания, так как это вызовет кровотечение. Чтобы помочь в стремлении, установлен в фокальной плоскости микроскопа на ожидаемой глубины CN, которая будет немного удален от поверхности мозжечка. Установка фокальной плоскости в CN улучшит визуализацию и обеспечить четкое изображение. - После аспирации, в дальнейшем кровотечения, спинномозговой жидкости (ликвора) наращивание и мозжечок смещение на DCN ожидается. Привить 0,5 см стерильного физиологического раствора быстро в трепанации черепа, чтобы предотвратить свертывание крови. Сочетание нежного вытирать с зубной точки всасывания и может быть затемиспользуется для расчищать путь для прямой визуализации DCN. Есть непосредственно не контактирует с поверхностью DCN.
- Использование 5 французскую всасывания, аспирации в поперечном направлении наиболее части левой мозжечка, покрывающей DCN до DCN не по отношениюUAL (рис 1, справа). Удалить примерно от 1/4 до 1/3 от левой мозжечка. Главная достопримечательность рядом с DCN является ампула высшего полукружных каналов.
2. Давление Микроинъекция для Касперского опосредованного переноса гена и хирургической восстановления
- После DCN свободна от вышележащих крови и спинномозговой жидкости, и отчетливо видно, чтобы микроинъекций давления в DCN с использованием 10 мкл Hamilton шприца в течение 2 мин.
- не вносят иглу микроманипулятор до кончика больше не видны под поверхностью DCN.
- Для оптимальной производительности используйте 33 или 34 иглы (используйте герметичное шприц с 34 датчик иглы) с мелкой фаски, например, 45 °, чтобы свести к минимуму тупой травмы и локализовать объем впрыска в пределах DCN, который тонкий и мелкой структуры ствола мозга (<300 мкм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие микроинъекции инструменты могут быть использованы на основе. В идеале, инъекции инструмент должен быть гибким, чтобы позволить некоторую небольшим Бенd, если нужно, чтобы непосредственно нацелены на DCN. Кроме того, как мышь слегка движется в течение всей процедуры за счет дыхания, прибор должен быть достаточно прочным, чтобы выдерживать незначительные количества движения.
3. Хирургическое восстановление
- Сразу после инъекции, вновь приблизить кожу и позволяют мышь, чтобы восстановить в стандартной процедуры восстановления. Оставшееся мозжечок и рубцовая ткань заполнит полости, вызванного стремлением мозжечка. Постоянно следить животных, пока достаточно сознание не восстанавливается поддерживать грудины лежачее положение. Монитор сердечного ритма, частоты дыхания, а также способность прокормить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет животное, которое перенес операцию возвращается в клетку с другими животными, пока полностью выздоровел. - Если мышь начинает ходить кругами после операции (<5% случаев), как правило, 2-4 часа после закрытия разреза кожи, немедленно пожертвовать мышь, так как это, скорее всего, имеют трудное время кормления. Tего побочный эффект, скорее всего, из-за стремления мозжечка. Животное должно контролироваться на боли в послеоперационном периоде, а также соответствующие наркотики следует уделять обеспечить комфорт животных на основе институциональных стандартов. Антибиотики могут быть необходимы, если признаков инфекции.
4. Средняя Краниотомия и Cochlear Nucleus экспозиции
- Через 2-4 недель заживления и вируса-опосредованного генного переноса инкубации, повторно обезболить ранее вводили мыши и повторите шаг 1,1-1,5 Оптимальное время инкубации зависит от типа гена перевода.
- Удалить рубцовой ткани над трепанации черепа сайте сочетанием пинцетом, скальпелем, и кусачек.
- После визуализации трепанацию черепа, определить комбинацию остальные мозжечок и рубцовой ткани, покрывающий DCN. Используйте 5 французскую всасывания аспирации лежащего мозжечок / рубцовой ткани (по аналогии с предыдущим мозжечка аспирация).
- После аспирации, ожидать дальнейшего кровотечения, CSF бuild-до, и оставшиеся биты мозжечка. Быстро ввести физиологический раствор в краниотомия, чтобы предотвратить свертывание крови. Используйте сочетание нежной зубной точки вытирая и всасывания, чтобы очистить путь для прямой визуализации DCN.
- Обратите внимание на поверхность DCN. Выполните Оптогенетика на основе экспериментов физиологии как DCN теперь доступна. Внедрение световой раздражитель, например, с помощью оптического волокна (рисунок 2), для привода эксперимент Оптогенетика основе.
5. Гистология
- После заключения экспериментов, усыпить мышь с передозировкой кетамина. Заливать мышь с физиологическим раствором, а затем 4% параформальдегидом.
- Экстракт ствол мозга из черепа и после исправления в течение 2 часов. Cryoprotect ствол мозга в 30% сахарозы в течение 24-48 часов. Раздел ствола головного мозга с помощью стандартного криостата с помощью 60 мкм разделов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Частичное мозжечка Стремление Демонстрирует Доступ к Cochlear Nucleus
После кожу и мышцы вышележащих черепа удаляются, поверхности черепа ориентиры, такие как корональных и Lamda линий шва, показывают приблизительное локализацию краниотомия. После трепанации черепа с кусачек, мозжечок визуализируется. Тщательное стремление небольшой части мозжечка демонстрирует визуализацию CN, который затем может быть введен (рис 1).
Среднее Cochlear Nucleus экспозиции для стимуляции синий свет лазера
После первоначального воздействия на DCN, перенос генов с опсина и инкубационного периода, DCN может быть стимулировано синий свет лазера. Вторичный краниотомия подвергая поверхность DCN для оптического стимуляции похожа на технического подхода к первичной краниотомия (Supp. Movie 1). DCN, будучиструктура поверхности, что меньше, чем 300 мкм толщиной. Экспериментальная мышиная подготовка остается жизнеспособной на срок до 6 часов.
Рисунок 1: Частичный мозжечка стремление демонстрирует доступ к спинной кохлеарного ядра. Левая панель: После Мышь помещают в держатель, разрез сделан по вертикали через кожу и мягкие ткани вдоль задней поверхности черепа к мягкой ткани шеи. Кожа латерализованых и мышцы вышележащих венечного шва линии удаляется средняя панель:. Краниотомия затем завершена по области мозжечка и спинного основной кохлеарного ядра с костных кусачек правой панели:. Для воздействия на спинной кохлеарного ядра , 5 Французский всасывания затем используется для аспирации мозжечоквышележащих Cochlear Nucleus пока спинной Cochlear Nucleus не визуализируется.
Рисунок 2: Воздействие на поверхности улиткового ядра для стимуляции синим светом лазера для получения оптически, вызвали слуховой реакции ствола мозга Размещение оптического волокна, соединенного с синим светом лазера на поверхности спинного кохлеарного ядра позволяет оптической стимуляции. опсин-инфицированных спинной улитка ядро. Синяя полоса = 400 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья описывает методику прямой визуализации DCN в мышиной модели для манипуляции центральной слуховой системы. Изложил подход непосредственной визуализации обеспечивает значительные преимущества по сравнению с основной альтернативы, которые стереотаксической подходы. В первую очередь, непосредственной визуализации DCN позволяет немедленного подтверждения месте в стволе головного мозга, тогда как стереотаксических подходы не обеспечивают прямой визуализации. В экспериментах, которые требуют длительных инкубационных периодов, как это имеет место в вирус-опосредованного переноса гена, существует потенциальная возможность низкой эффективности инфекции, если инъекции "не попадает" целевое местоположение. Кроме того, прямой подход визуализация позволяет для инъекций в широком возрастов диапазон животных. Аналогичное хирургическое подход может быть использован в экспериментах с другими выживаемости животных моделях, например, крыс и морских свинок.
Есть несколько важных шагов в этом протоколе. Во-первых,мышь должна быть правильно установлена в стереотаксической держателя. Любое движение головы приводит к сложности с внесением трепанации черепа. Во-вторых, расположение трепанации черепа имеет решающее значение. Если трепанация черепа не сделано в правильном положении, визуализация DCN в результате аспирации мозжечка будет сложным, если не невозможным. Наконец, самый важный шаг протокола является частичное направлены стремление мозжечка. Существуют два подхода к технической аспирации мозжечка. В рамках первого подхода аспирации, всасывание постоянно проводятся на мозжечок, подняв его вверх, от мозга. При таком подходе, DCN может быть частично визуализировали под мозжечка и всасывания проходит до тех пор, CN не будет полностью визуализировать и мозжечок удал. Во втором подходе, мозжечок частично атмосферный в нескольких слоистых проходит, пока DCN не визуализируется. Зубные точки могут быть использованы при осторожном вытирать, чтобы очистить кровь или оставшийся мозжечок fragmeNTS от CN, если она не может быть полностью визуализированы.
Кровотечение является одним из основных недостатков прямого подхода визуализации и главным происходит во время начальной краниотомия и после мозжечка аспирации. Во многих случаях в начальный трепанации черепа, кровотечение остановится времени, в течение 2-5 мин. Размещение папиросной бумаги или зубной точку в месте кровотечения и позволяет гемостаза. С точки зрения кровотечение после аспирации мозжечка, важно, чтобы ввести физиологический раствор (0,5-1 куб.см) на месте краниотомия разбавить кровь и предотвращать образование сгустков крови на уровне базовой сети. Сочетание всасывания и нежной зубной точки вытирать могут быть использованы, чтобы убрать кровь и солевым раствором. В самом деле, основным ограничением этого подхода является то, инвазивность процедуры.
Протокол имеет значение за пределами манипуляции слуховой системы. В естественных условиях переноса генов в центральную нервную систему позволяет манипулировать DIVERSE нервные пути и предложил взглянуть на нескольких нейронных функций, включая память, управления двигателем, обоняния и слуха. 16,21-26 хирургический метод, позволяющий прямую визуализацию для целей передачи генов и стимуляции может потенциально быть применены в других регионах в стволе головного мозга, как те, которые перечислены выше, и другие. После овладения прямой визуализации DCN, хозяин экспериментов можно, в том числе инъекции опсинов в CN и последующей стимуляции с синим светом лазера. Другие эксперименты нейрофизиологии, такие как электрической стимуляции и нейронных начертаний форсунок, 18 также возможны. Уровень визуализации и продолжительности стимуляции Такой подход позволяет для множественных приложений для широкого спектра экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Финансирование: Эта работа была поддержана грантом Фонда Бертарелли (DJL), гранта MED-EL (DJL) и Национальных институтов здравоохранения грантов DC01089 (MCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic holder | Stoelting | 51500 | |
| Homeothermic blanket | Harvard | 507214 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| Iris scissor | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 French suction | Symmetry Surgical | 2777914 | |
| Dental Points | Henry Schein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, needle | Hamilton | 207434 | |
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
References
- Lalwani, A., Mhatre, A.
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
- Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Hernandez, V. H., et al.
- Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
- Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612 (2012).
- Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
- Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
- Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
- Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
- Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
- Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
- Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
- Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
- Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
- Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
- Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
- Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
- Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
- Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
- Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
