This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.
Degradação de proteínas Regulado é crucial para praticamente todas as funções celulares. Muito do que se sabe sobre os mecanismos moleculares e requisitos genéticos para a degradação da proteína eucariótica foi inicialmente estabelecida em Saccharomyces cerevisiae. Análises clássicas de degradação de proteínas têm contado com metodologias de pulso-Chase e cycloheximide-perseguição bioquímicos. Embora essas técnicas de fornecer os meios sensíveis para a observação de degradação de proteínas, eles são trabalhoso, demorado, e de baixo rendimento. Estas abordagens não são passíveis de triagem rápida ou em larga escala de mutações que impedem a degradação da proteína. Aqui, um ensaio baseado no crescimento das leveduras para a identificação fácil dos requisitos genéticos para a degradação da proteína é descrito. Neste ensaio, uma enzima repórter necessária para o crescimento sob condições selectivas específicas é fundida com uma proteína instável. As células a que falta a enzima repórter endógeno mas expressam a proteína de fusão pode crescer sob selecondições CTIVE apenas quando a proteína de fusão é estabilizado (ou seja, quando a degradação da proteína é comprometida). No ensaio de crescimento descrito aqui, diluições em série de tipo selvagem e mutantes de células de levedura contendo um plasmídeo que codifica uma proteína de fusão são manchados para o meio selectivo e não selectivo. O crescimento em condições selectivas é consistente com insuficiência degradação por uma dada mutação. O aumento da abundância de proteína deve ser confirmada bioquimicamente. Um método rápido para a extracção de proteínas de levedura numa forma adequada para a electroforese e Western blotting é também demonstrada. Uma leitura à base de crescimento para a estabilidade da proteína, combinado com um protocolo simples para a extracção de proteínas para análise bioquímica, facilita a rápida identificação dos requisitos genéticos para a degradação da proteína. Estas técnicas podem ser adaptadas para controlar a degradação de uma variedade de proteínas de vida curta. No exemplo apresentado, a enzima His3, o qual é necessário para a biossíntese de histidina, foi fundidapara Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 é alvo de degradação após a aberrante engata a translocon retículo endoplasmático. As células que albergam Deg1 -Sec62-His3 foram capazes de crescer em condições selectivas quando a proteína foi estabilizado.
Degradação selectiva de proteínas é essencial para a vida eucariótica, e a degradação da proteína alterada contribui para um certo número de condições médicas, incluindo vários tipos de cancro, doença neurodegenerativa, doença cardiovascular, e fibrose cística 1-5. O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS), que catalisa a degradação da proteína seletivo, é um alvo terapêutico emergente para estas condições 6-10. Ubiquitina ligases covalentemente anexar polímeros da ubiquitina ácido 76-amino de proteínas 11. Proteínas que foram marcados com correntes poliubiquitina são reconhecidos e proteolizada pelos 2,5 megadalton ~ proteassoma 26S 12. Estudos iniciados no organismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento) ter sido fundamental na elucidação dos mecanismos de degradação de proteínas em células eucarióticas. O primeiro substrato fisiológico demonstrou da UPS foi a levedura repressor da transcrição MATα2 13, 14, e muitos componentes altamente conservadas da UPS foram inicialmente identificados ou caracterizado por leveduras (por exemplo, 15-26). Descobertas feitas neste organismo modelo versátil e geneticamente tratável são susceptíveis de continuar a fornecer importantes insights sobre os mecanismos conservadas de degradação mediada por ubiquitina.
Reconhecimento e degradação da maioria dos substratos UPS exigem uma acção combinada de várias proteínas. Por conseguinte, um objectivo importante na caracterização da degradação regulada de uma dada proteína é instável a determinar os requisitos genéticos para a proteólise. As abordagens clássicas (por exemplo pulse-chase e experiências cicloheximida-chase 27) para monitorar a degradação de proteínas em células de mamífero ou de levedura são trabalhosos e demorados. Embora estes tipos de metodologia proporcionar meios muito sensíveis para a detecção da degradação de proteínas, eles não são adequados para a análise rápida de degradação da proteína ou screeni grande escalang para as mutações que impedem a degradação da proteína. Aqui, um ensaio à base de levedura de crescimento para a rápida identificação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas instáveis é apresentado.
No método baseado no crescimento da levedura para analisar a degradação de proteínas, uma proteína instável de interesse (ou sinal de degradação) é fundida, na estrutura, para uma proteína que é necessária para o crescimento de levedura em circunstâncias específicas. O resultado é um substrato artificial, que pode servir como uma ferramenta poderosa para determinar os requisitos genéticos de degradação de proteínas da proteína instável de interesse. Convenientemente, as estirpes de levedura laboratorial mais comummente utilizados abrigar um painel de mutações em genes que codificam enzimas metabólicas envolvidas na biossíntese de aminoácidos específicos ou bases azotadas (por exemplo, 20,28-30). Estes enzimas são essenciais para a proliferação celular na ausência de metabolitos fornecidos exogenamente em cuja síntese das enzimas participar. Talenzimas metabólicas podem assim funcionar como repórteres à base de crescimento para a degradação de proteínas instáveis ao qual se encontram fundidos. Os requisitos genéticos para a degradação da proteína pode ser facilmente elucidadas, uma vez que as mutações que impedem a proteólise irá permitir que as células portadoras do repórter degradação de crescer em condições selectivas.
Uma vantagem de crescimento é uma indicação indirecta que uma mutação em particular aumenta a abundância da proteína de interesse. No entanto, a análise bioquímica direta é necessário para confirmar que uma mutação permite o crescimento através do aumento dos níveis de proteína e não através de causas indiretas ou artificial. O efeito de uma mutação na abundância da proteína pode ser confirmada por análise de mancha de Western dos níveis de proteína em estado estacionário em células que fazem e não abrigam a mutação em particular. Um método para a extracção rápida e eficiente de proteínas de levedura (incubação sequencial de células de levedura com hidróxido de sódio e tampão de amostra) numa forma adequadapara análise por transferência Western também é apresentada 31. Em conjunto, estas experiências facilitar a rápida identificação de candidatos reguladores de degradação da proteína.
A metodologia aqui apresentada permite a determinação rápida e confirmação bioquímica dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas em células de levedura. Este estudo destacou a utilidade e poder de levedura como um organismo modelo eucariótica (vários excelentes comentários da biologia fermento e compilações de protocolos para manuseio, armazenamento e manipulação de células de levedura (por exemplo, 41-44) estão disponíveis para os investigadores novos para o organis…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos membros atuais e antigos do laboratório Rubenstein para proporcionar um ambiente de apoio e entusiasmo pesquisa. Agradecemos Ryan T. Gibson de assistência em otimização de protocolo. Agradecemos Mark Hochstrasser (Universidade de Yale) e Dieter Wolf (Universität Stuttgart) para cepas de leveduras e plasmídeos. Agradecemos aos nossos revisores anônimos por sua ajuda para melhorar a clareza ea utilidade deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um prémio de investigação a partir do capítulo Ball State University de Sigma Xi para SGW, a National Institutes of Health subvenção (R15 GM111713) para EMR, um prémio de investigação Ball State University aspirar a EMR, e fundos da Ball State University Gabinete do Reitor e do Departamento de Biologia.
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs |
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer |
Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers |
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) |
Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |