Abstract
Деградация Регулируемый белок имеет решающее значение практически для каждого клеточной функции. Многое из того, что известно о молекулярных механизмах и генетических требований к деградации эукариотической белка была первоначально создана в Saccharomyces CEREVISIAE. Классические анализ деградации белков полагались на биохимические импульсно-Чейз и циклогексимид погони методологий. Хотя эти методы обеспечивают чувствительные средства для наблюдения деградации белка, они являются трудоемкими, отнимающим много времени, и низкая пропускная способность. Эти подходы не поддаются быстрому или крупномасштабного скрининга мутаций, которые предотвращают деградацию белка. Здесь дрожжи роста на основе анализа для поспешном идентификации генетических требований к деградации белков описано. В этом анализе, фермент-репортер требуется для роста в конкретных условиях селективного слит с неустойчивой белка. Клетки, не имеющие эндогенного фермента-репортера, но, экспрессирующие слитый белок может расти в СелеCTIVE условия только тогда, когда слитый белок стабилизируют (т.е. при деградации белка нарушена). В анализе роста, описанного здесь, серийные разведения дикого типа и мутантных клеток дрожжей, несущих плазмиду, кодирующую слитый белок, наносили на селективной и неселективной среды. Рост в селективных условиях в соответствии с обесценение деградации данного мутации. Увеличение белка обилие должны быть биохимически подтверждено. Способ быстрого извлечения дрожжевых белков в форме, подходящей для электрофореза и Вестерн-блоттинга также продемонстрировал. Считывание рост на основе стабильности белка, в сочетании с простым протоколом для экстракции белка для биохимического анализа, облегчает быструю идентификацию генетических требований к деградации белка. Эти методы могут быть адаптированы для мониторинга деградации различных короткоживущих белков. В примере, представленном фермент HIS3, который необходим для биосинтеза гистидина, был слитв Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 предназначен для деградации после аномально занимается эндоплазматической сети транслокон. Клетки, несущие Deg1 -Sec62-his3 удалось вырастить в селективных условиях, когда белок был стабилизирован.
Introduction
Селективный деградации белка имеет важное значение для эукариотической жизни, и деградация измененный белок способствует ряда заболеваний, в том числе некоторых видов рака, нейродегенеративных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, и кистозный фиброз 1-5. Система убиквитин-протеасомный (ИБП), который катализирует селективное разрушение белка, является новым терапевтической мишенью для этих условий 6-10. Убиквитин-лигазы ковалентно присоединить полимеры убиквитина 76-аминокислота белков 11. Белки, которые были отмечены с полиубиквитиновый цепей признаются и proteolyzed по ~ 2,5 megadalton 26S протеасом 12. Исследования, начатые в модели эукариотических организмов Saccharomyces Cerevisiae (почкованием дрожжей) были основополагающими в выяснении механизмов деградации белка в эукариотических клетках. Впервые продемонстрирована физиологический субстрат ИБП был дрожжи транскрипции репрессор MATα2 13, 14, и многие высоко консервативные компоненты ИБП впервые были определены или отличающийся тем, дрожжей (например, 15-26). Открытия, сделанные в этом универсальном и генетически послушный модельного организма, скорее всего, продолжит оказывать важную информацию консервативных механизмов убиквитин-опосредованной деградации.
Признание и деградация большинства субстратов ИБП требуют совместных действий нескольких белков. Таким образом, важной задачей при характеристике регулируемого деградации данного нестабильной белка, чтобы определить генетические требования для протеолиза. Классические методы (например, импульсно-чейз и циклогексимид-чейз-эксперименты 27) для мониторинга деградации белка в млекопитающих или дрожжевые клетки трудоемким и занимает много времени. В то время как эти типы методологии обеспечивают высоко чувствительные средства для детектирования деградацию белков, они не подходят для быстрого анализа деградации белка или крупномасштабного screeniнг для мутаций, которые предотвращают деградацию белка. Здесь дрожжи роста на основе тест для быстрой идентификации генетических требований к деградации неустойчивых белков представлены.
В дрожжей на основе экономического роста метод анализа деградации белка, неустойчивый интерес белок (или деградации сигнала) сливают, в рамке, с белком, который необходим для роста дрожжей при определенных обстоятельствах. Результатом является искусственный субстрат, который может служить в качестве мощного инструмента для определения генетического требованиям деградации белков нестабильной белка. Удобно, наиболее часто используемые дрожжевые штаммы лаборатории укрывает панель мутаций в генах, кодирующих метаболические ферменты, участвующие в биосинтезе определенных аминокислот или азотистых оснований (например, 20,28-30). Эти ферменты имеют важное значение для клеточной пролиферации в отсутствие экзогенно предоставленных метаболитов в которых синтез ферменты участвуют. Такиеметаболические ферменты могут, таким образом, функционировать в качестве роста на основе репортеры за деградацию нестабильных белков, к которым они слиты. Генетические требования к деградации белков могут быть легко объяснены, так как мутации, которые предотвращают протеолиз позволит клетки, несущие деградации репортер расти при селективных условиях.
Преимущество рост косвенным свидетельством того, что особенности мутация увеличивает изобилие белка. Тем не менее, прямой биохимический анализ необходим, чтобы подтвердить, что мутация позволяет рост за счет увеличения содержания белка, а не через косвенные или артефактом причин. Эффект мутации на белковой изобилии, может быть подтверждено с помощью Вестерн-блот анализа уровней стационарных белка в клетках, что делать, и не питают особого мутацию. Способ быстрого и эффективного извлечения дрожжевых белков (последовательной инкубацией клеток дрожжей с помощью гидроксида натрия и образец буфера) в форме, пригоднойдля анализа с помощью Вестерн-блоттинга также представлены 31. Вместе, эти эксперименты содействия скорейшей идентификации регуляторов кандидатов деградации белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Дрожжи Анализ роста к выявления возможных мутантов, дефектных по Protein деградации
- Преобразование дикого типа и мутантных клеток дрожжей с плазмидой, кодирующей нестабильную белок, слитый в рамке, с репортером метаболического фермента.
- Посев трансформантов в 5 мл синтетической определенной (SD) минимальной среде, что является селективным для клеток, несущих плазмиды молекулы. Инкубируют в течение ночи при 30 ° С, вращение.
- Измерение оптической плотности при 600 нм (OD 600) в каждой ночной культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации в течение ночи, клетки в культуре могут быть в любом логарифмической или стационарной фазы роста, но должны были достичь минимальной OD 600 0,2. Очень медленно растущие штаммы дрожжей может потребовать времени инкубации дольше, чем одну ночь, или прививка большего числа клеток, как определено эмпирически. - Подготовьте шесть-кратные серийные разведения трансформированных дрожжевых клеток в стерильной 96-луночного планшета, начиная с клетки разводили дон OD 600 0,2. Место каждого трансформанта дрожжей для анализа в другой строке в 96-луночного планшета.
- Для каждого трансформанта, рассчитать объем ночной культуры, необходимой для разбавления клеток к OD 600 0,2 в конечном объеме 200 мкл. Добавить этот объем в течение ночи культуры в соответствующую лунку в колонке 1. Добавьте соответствующее количество стерильной воды, чтобы довести объем до 200 мкл.
- Для каждой строки дрожжей, добавить 125 мкл стерильной воды в лунки в колонках 2, 3, и 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуально упакованные стерильные 96-луночные планшеты могут быть упакованы с стерильных крышек. Крышки могут быть использованы в качестве резервуаров для стерильной воды, который распространяется на этой стадии. Это позволяет одновременную передачу стерильной воде для всех скважин в данном столбце с многоканальной пипетки. - Смешайте содержимое первого столбца (дрожжевой разбавляют до OD 600 0,2) с помощью пипетки вверх и вниз с помощью многоканальной пипетки.
- Transfэ 25 мкл дрожжей из колонки 1 в колонку 2, с помощью многоканального дозатора. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Передача 25 мкл из колонки 2 в колонку 3, и 25 мкл из колонки 3 на колонку 4 (хорошо перемешивая на каждом шагу).
- Смешайте каждого образца многоканальной пипетки. Исходя из наиболее разбавленных до менее разбавленных колонны дрожжей, пипетки 4 мкл каждого образца на двух пластинах, содержащих соответствующую селективную среду. Используйте одну пластину со средой, которая поддерживает выбор плазмиды (это пластина служит дрожжей кровянистые выделения и контроля роста). Использование второй пластины со средой, которая выбирает для поддержания плазмиды и экспрессии в неустойчивом белка, слитого с фермента-репортера. Потому что дрожжи быстро оседают, смешать клетки с помощью пипетки вверх и вниз на регулярной основе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сушилка пластины будут с большей готовностью поглощает жидкость, чем свежеприготовленных пластин и, следовательно, рекомендуется для этих экспериментов. Влажные пластины могут быть высушены путем инкубации при комнатной температуре в ЛоW влажности в течение 1 - 2 дней или более короткие инкубации в ламинарном потоке. Плиты могут высохнуть неравномерно, если ламинарный поток воздуха параллельно скамье. Использование шаблона делает его легче обнаружить дрожжевых клеток через равные расстояния. Два Образцы шаблонов предусмотрены на фиг.1. Они могут быть напечатаны, вырезали и прикреплены к внутренней крышке посудомоечной Петри. - Разрешить пластин для просушки на скамейке наверху.
- Планшеты инкубируют при 30 ° С в течение 2 - 6 дней.
- Фотоснимок каждой пластины после инкубации.
Рисунок 1. Шаблоны для пятнистость дрожжевых клеток на 100-мм чашках с агаром. Эти шаблоны могут быть использованы для облегчения пятнистость дрожжи через равные промежутки с помощью многоканальной пипетки. Шаблоны могут быть напечатаны, вырезали и прикреплены к внутренней крышке посудомоечной Петри. Поместите чашку Петри с ростомсреда внутри крышки с шаблоном прикреплена. Шаблоны отмечены с выемкой для отслеживания ориентации. Рекомендуется, чтобы пластины, используемые в анализах роста быть аналогичным образом помечены с выемкой для отслеживания ориентации. Шаблоны для кровянистые выделения четырех (а) или пяти (B) серийные разведения дрожжевых клеток предоставляются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть версию для печати этой фигуры с шаблонами 100-мм.
2. Биохимический Подтверждение Пробирной роста дрожжей
- Рост дрожжевых клеток и пост-щелочной протеиновый Добыча (модифицированный из 31)
- Преобразование дикого типа и мутантных клеток дрожжей с плазмидой, кодирующей белок нестабильную.
- Привить трансформантов в 5 мл SD среде, которая является селективной для клеток, несущих молекулы плазмиды. Инкубируют в течение ночи при 30 ° С, вращение.
- Измерьте OD 600 каждой ночи кубlture.
Примечание: После инкубации в течение ночи, клетки могут быть в любом логарифмической или стационарной фазе роста, но должны достигли OD 600, который позволит разбавление до OD 600 0,2 в 10 мл свежей селективной среде (этап 2.1.4). Очень медленно растущие штаммы дрожжей может потребовать времени инкубации дольше, чем одну ночь, или прививка большего числа клеток, как определено эмпирически. - Развести дрожжевых клеток на OD 600 0,2 в 10 мл свежей селективной средой.
- Продолжали инкубировать клетки при 30 ° С, вращающихся или встряхивании, пока культура не достигает наружный диаметр 600 между 0,8 и 1,2 (т.е. в середине логарифмической фазе роста).
Примечание: Если неустойчивым интерес белок находится под контролем регулируемого промотора, оптимальный выбор времени индукции экспрессии белка и урожай клеток может изменяться в зависимости от предыдущих исследований или эмпирических наблюдений. - Соберите 2,5 OD 600 единиц культуры в 15-мл коническаяаль трубки центрифугированием при 5000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации.
Примечание: Один из OD 600 единица определяется как количество дрожжей, присутствующих в 1 мл культуры в ОД 600 из 1,0. Объем культуры (в мл), необходимое для сбора 2,5 OD 600 единиц (V) может быть определена с помощью следующего уравнения: V = 2,5 OD 600 единиц / Измеренные OD 600 - Ресуспендируют клеток в 1 мл дистиллированной воды. Передача взвешенных клеток в микроцентрифужных трубки.
- Гранул клетки центрифугированием при 6500 х г в течение 30 сек при комнатной температуре. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл дистиллированной воды с помощью пипетки вверх и вниз или встряхивания и добавить 100 мкл 0,2 М NaOH. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируйте образцы в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Пелле клеток (большинство из которых так и не выпустили белки и еще жизнеспособна) путем центрифугирования при 18000 хг в течение 5 мин. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации.
- Ресуспендируют осадок в 50 - 100 мкл буфера Лэммли 1x образца, который будет лизировать клетки, с помощью пипетки вверх и вниз или вортексе.
Примечание: Удаление щелочной супернатанта следующей центрифугированием и последующей ресуспендирования клеток в буфере Лэммли образца извлекает белки при рН, совместимого с додецилсульфатом натрия гель-электрофореза в полиакриламидном сульфат (SDS-PAGE) с использованием трис-глицин систему рабочего буфера и Вестерн-блоттинга. - Для полной денатурации белков, инкубировать лизатов при 95 ° С в течение 5 мин.
Примечание: Агрегирование-склонные белки (например, белки с несколькими трансмембранных сегментов) может стать нерастворимым при инкубации при 95 ° С. Таким образом, лизаты должны быть инкубировали при более низких температурах (например, 37 ° С - 70 ° С) в течение 10 - 30 мин, как определено эмпирически, для анализа таких белков. - Холодные лизаты путем размещения на льду в течение 5 мин.
- Центрифуга лизаты в 18000 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре для осаждения нерастворимого материала. Отделить супернатант (солюбилизируют экстрагируют белка) в ДСН-ПААГ перед последующим Вестерн-блот-анализа (раздел 2.2). Кроме того, магазин лизаты при -20 ° С.
- Представитель вестерн-блоттинга протокол
- Загрузка определены эмпирически объем лизата в SDS-PAGE гель.
- Бегите гель при 200 V до передней красителя достиг дна геля.
- Передача белков из геля из поливинилиденфторида (ПВДФ) мембраны влажной передачи при 20 В в течение 60 - 90 мин при 4 ° С.
- Блок мембраны путем инкубации в 5% обезжиренном молоке в Трис-солевом буфере (TBS), качалки, в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
- Слейте блокировании решения.
- Инкубируйте мембраны с первичным антителом, специфичным для белка, представляющего интерес (или эпитопов тега их) в 1% обезжиренным молоком в TBS с 0,1% Твин-20 (TBS / T) в течение 1 ч при комнатной Temperature, покачиваясь.
- Декантировать раствор антител и мыть мембраны 3 х 5 мин при TBS / T при комнатной температуре, качалки.
- Инкубируйте мембраны с соответствующим флуорофора-сопряженных вторичными антителами в 1% обезжиренным молоком в TBS / T в течение 1 ч при комнатной температуре, качалки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку флуорофоры светочувствительный, разведения флуорофорных-сопряженных антител должны быть подготовлены в темноте. Кроме того, инкубирование мембраны в присутствии флуорофора-конъюгированного антитела должно происходить в светонепроницаемыми контейнеров. Это может быть достигнуто путем обертывания инкубации лотки в алюминиевую фольгу. - Декантировать раствор антител и мыть мембраны 3 х 5 мин при TBS / T при комнатной температуре, качалки.
- Получить изображение мембраны с помощью Li-Cor Odyssey CLX и Image Studio программного обеспечения (или сравнимой комплектации изображения и программное обеспечение), в соответствии с рекомендациями производителя.
- После визуализации мембраны, мембраны инкубируют с первичным антителом, специфичным к нагрузкечисле белок управления в 1% обезжиренным молоком в TBS / T в течение 1 ч при комнатной температуре, качалки.
- Декантировать раствор антител и мыть мембраны 3 х 5 мин при TBS / T при комнатной температуре, качалки.
- Инкубируйте мембраны с соответствующим флуорофора-сопряженных вторичными антителами в 1% обезжиренным молоком в TBS / T в течение 1 ч при комнатной температуре, качалки.
- Декантировать раствор антител и мыть мембраны 3 х 5 мин при TBS / T при комнатной температуре, качалки.
- Получить изображение мембраны с помощью Li-Cor Odyssey CLX и Image Studio программного обеспечения (или сравнимой комплектации изображения и программное обеспечение), в соответствии с рекомендациями производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать эту методологию, фермент HIS3 был слит с карбокси-конца модели эндоплазматического ретикулума (ER) -associated деградации (ERAD) подложки, Deg1 -Sec62 (2А), чтобы создать Deg1 -Sec62-HIS3 (фиг.3) . Deg1 -Sec62 представляет членом-основателем нового класса ERAD субстратов, которые ориентированы ниже стойким, отклоняющееся связь с транслокона, канал, прежде всего, отвечает за перемещение белков через ЭР мембраны 32-34. Такие нестабильные белки условно называют Erad-T (для транслокон-ассоциированной) подложках. Предыдущие исследования показывают, что, по аномальным зацепления транслокона, Deg1 -Sec62 предназначен для деградации по Hrd1 убиквитинлигазы (фиг.2В-D) 32, 34, 35. Факторы, необходимые для деградации других субстратов Hrd1 оказаться необязательной для <EM> деградация Deg1 -Sec62, предлагая механизм деградации новый 32. В условиях нарушенной липида связывания и длительной транслокона ассоциации, аполипопротеина В, белковый компонент млекопитающих липопротеинов низкой плотности, по-видимому, будет ухудшаться связанной механизма 36-38. Таким образом, Deg1 -Sec62 может обеспечить полезную модель деградации медицинской соответствующих транслокон-ассоциированных белков.
Дикого типа и hrd1Δ дрожжевые клетки, которые не имеют хромосомных генов HIS3 были преобразованы с пустым вектором 39 или плазмидой, кодирующей Deg1 -Sec62-his3 и наносили на селективной среде (рис 4). Чтобы подтвердить, что равные количества трансформированных дрожжевых клеток были перенесены в пластины, клетки наносили на среде, не содержащей триптофан (который выбирает для клеток, несущих плазмиды), но содержащей гистидина. Подобный рост наблюдался для всех трансформированных дрожжевых клеток.Ожидалось, клетки, которые экспрессируют Deg1 -Sec62-HIS3 расти в отсутствие гистидина только тогда, когда слитый белок стабилизированного (т.е. когда ERAD-Т скомпрометирована). Действительно, hrd1Δ дрожжи выразив Deg1 -Sec62-his3 выставлены роста преимущество по сравнению с диким типом клеток, экспрессирующих Deg1 -Sec62-his3 на среде, не содержащей триптофан и гистидин. Тем не менее, отмечается рост Fusion-белка-зависимое отсутствие гистидина наблюдалось даже в присутствии Hrd1. В целях повышения жесткости анализа, средой, не содержащей гистидина был дополнен 3-амино-1H-1,2,3-триазола (3-AT), конкурентным ингибитором фермента в HIS3 40. Дрожжи выражения Hrd1 росли очень плохо на среде, не содержащей гистидина, дополненной 1 - 2 мм 3-АТ; когда HRD1 был удален, рост клеток был восстановлен. Включение 3-АТ в концентрации 3 мМ значительно ингибирует рост всех клеток, независимо от наличия или отсутствия Hrd1. Эти разрешения ULTS согласуются с Hrd1-зависимой деградации субстрата.
Далее, стационарная обилие белка Deg1 -Sec62-his3 в дрожжах выражения или отсутствие фермента Hrd1 непосредственно тестирование. Вестерн-блоттинга анализ показал, что аналогичное увеличение Deg1 -Sec62-his3 и Deg1 -Sec62 белка в hrd1Δ дрожжей по отношению к клеткам дикого типа (Рисунок 5). Это подтверждает роль Hrd1 в регуляции уровней обоих белков. Hrd1 зависит от деградации Deg1 -Sec62 продолжается после белок аберрантно входит в зацепление с ER транслокон 32. Важно отметить, что Deg1 -Sec62-HIS3 аномально входит в зацепление с транслокон аналогичным образом (неопубликованные данные), дополнительно проверки использования Deg1 -Sec62-HIS3 как репортера роста на основе деградации Deg1 -Sec62 конкретно и транслокона белков, ассоциированных в целом.
с ">
Рисунок 2:.. Модель деградации Deg1 -Sec62 следующей аберрантной зацепления транслокона (А) Схематическое представление Deg1 -Sec62 Deg1 (аминоконцевой 67 аминокислот из MATα2) следует, в последовательности, при установке флага (F), эпитоп , 2-трансмембранный эндоплазматическая сеть (ER) белок Sec62, и две копии S. стафилококк белка (АРП). Для ясности, слитый белок называют Deg1 -Sec62. (В) в соответствии с нормальным введение двух трансмембранных сегментов в ER мембрану, стойкие взаимодействие Deg1 -Sec62 с транслокона вызывает аномальное, Deg1 -зависимых транслокон взаимодействие. Часть изначально цитозольного хвоста амино-концевой аномально входит-и, вероятно, остается в пределах-транслокона. (C) После аномальных транслокона engagemenт, Hrd1 признает и ubiquitylates Deg1 -Sec62. Красные круги указывают молекулы убиквитин. (D) Deg1 -Sec62 затем извлекается из ER мембраны и разлагается протеасоме, скорее всего, освободив транслокон препятствие.
Рисунок 3:. Схематическое представление Deg1 -Sec62-his3 после аномальным участия транслокон Deg1 следует, в любой последовательности, флага (F) эпитоп, 2-трансмембранный ER белок Sec62, в двух экземплярах, S. стафилококк белка (PRA), а дрожжи HIS3 фермента. Для ясности, слитый белок называют Deg1 -Sec62-HIS3.
Рисунок 4: Слияние his3 в Deg1 (HRD1) и hrd1Δ дрожжей, трансформированных пустым вектором или плазмидой, кодирующей Deg1 -Sec62-HIS3 были замечены на среде, не содержащей триптофан, среде, не содержащей триптофан и гистидин и среду, не триптофан и гистидин с добавлением 3-амино-1H-1,2,3-триазола (3-AT), конкурентным ингибитором his3, при указанных концентрациях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры ,
Рис. 5: Увеличение обилие Deg1 -Sec62 и Deg1 -Sec62-HIS3 в клетках, не имеющих Hrd1 белковые экстракты получают из дикого типа (+) и hrd1Δ(Δ) дрожжи выразив Deg1 -Sec62 или Deg1 -Sec62-his3. Белки (эквивалент 0,125 OD 600 единиц) были разделены SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга с кроличьей анти-мышиных вторичными антителами, которые непосредственно связывают белок А эпитопы слитых белков. После вестерн-блоттинга с антителами, специфичными к PGK1 обеспечивает контроль загрузки.
| Решение | Компоненты | Комментарии | ||
| Синтетический определен (SD) Минимальная дрожжевой среде | 2% -ный раствор декстрозы, 0,67% от основного дрожжевого азота без аминокислот, 0,002% аденина, 0,004% урацил, 0,002% аргинина, 0,001% гистидина, 0,006% изолейцин, лейцин 0,006%, 0,004% лизина, метионина 0,001%, 0,006% фенилаланина, 0,005 % треонин, триптофан 0,004%. Для твердого вещества (пластины) среде, включают в себя 2% агара. | 1. Селективная среда готовится путем исключения APщих образовательных аминокислот (ы) или азотистых оснований. | ||
| 2. Для удобства, эти ингредиенты могут быть сохранены в виде концентрированных маточных растворов в следующем. Аминокислоты могут быть сохранены как 100X исходного раствора, содержащего все желаемые аминокислоты. Дрожжи азотистого основания может быть сохранена в 20X маточного раствора (13,4%). Декстроза может быть сохранена в 40% маточного раствора. Аденина и урацила может быть сохранена в 1% исходных растворов в 0,1 М NaOH. | ||||
| 3. стерилизацию автоклавированием среды. | ||||
| 1X Laemmli буфера для образца | 2% ДСН, 10% глицерина, 5% β-меркаптоэтанола, 60 мМ Трис HCl, рН 6,8, 0,008% бромфенол синий | 1. 1X буфера для образца часто готовят путем разбавления более концентрированной (например, 5x) акции. | ||
| 2. бромфенол синий краситель может быть добавлен к желаемой интенсивности. "Пинч" (очень небольшое количество выпущенного из края шпателем), как правило, достаточным. | ||||
| 0,2 М гидроксида натрия | Подготовка в воде. Гидроксид натрия реагирует со стеклом. Таким образом, для длительного хранения, 0,2 М гидроксида натрия должна поддерживаться в пластиковых контейнерах. | |||
| Laemmli рабочего буфера (5X) | 125 мМ Трис, 960 мМ глицина, 0,5% SDS | Чтобы приготовить 1 л 1X Laemmli рабочего буфера, разбавленных 1: 5 в дН 2 O | ||
| Трис ацетата-ДСН буфера переноса (5X) | 125 мМ Трис ацетата (рН 8,8), 960 мМ глицина, 0,05% ДСН | Для приготовления 20 л 1X Трис этилацетат-SDS буфера переноса, объединить 4 л 5X наличии, 4 л метанола и 12 л дН 2 O | ||
| 10X трис-буферный солевой раствор (TBS) | 500 мМ Трис, 1,5 М NaCl; рН доводили до 7,5 | Для приготовления 1 л 1X TBS, развести 1:10 в дН 2 O. 1X TBS может быть дополнена моющего средства Tween-20 и порошкообразного обезжиренного молока, в зависимости от обстоятельств. |
| Процедить Имя | Псевдоним | Соответствующий Генотип | Фигуры | Источник |
| VJY6 | MHY500 | MATa | 4 и 5 | Чен и др., 1993 |
| his3-Δ200 | ||||
| leu2-3,112 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| VJY10 | MATa | 4 и 5 | Это исследование | |
| his3- Δ 200 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| hrd1 :: kanMX4 |
Таблица 2:. Штаммов дрожжей, используемых в данном исследовании детали конструкции доступны по запросу.
| Плазмиды Количество | Полный плазмиды Имя | Фигура | Источник |
| pVJ30 | pRS414-P МЕТ25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA | 5 | Рубинштейн и др., 2012 |
| pVJ121 | pRS414-P МЕТ25 (пустой вектор с МЕТ25 промотора) | 4 | Mumberg и др., 1994 |
| pVJ467 | pRS414-P МЕТ25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-his3 | 5 | Это исследование |
| pVJ477 | pRS414-P GAL4 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-his3 | 4 | Это исследование |
Таблица 3:. Плазмиды, используемые в данном исследовании, Обратите внимание, что все плазмиды содержат дрожжевой центромеры, чтобы позволить репликацию в клетках дрожжей, ген TRP1 для отбора в клетках дрожжей, и ген AmpR для поддержания в бактериальных клетках. Плазмидные карты, последовательности и детали конструкции доступны по запросу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методология, представленные здесь позволяет для быстрого определения и биохимического подтверждения генетических требований к деградации белков в дрожжевых клетках. Эти эксперименты выделить полезность и власть дрожжей в качестве модели эукариотических организмов (несколько отличные отзывы дрожжей биологии и сборники протоколов для обработки, хранения и манипулирования дрожжевых клеток (например, 41-44) доступны для исследователей новых для организма). Методы могут быть легко применены для исследования деградации и обилие различных классов белков. Например, другие использовали эту стратегию, чтобы охарактеризовать механизмы деградации нестабильной цитозольным, ядерной и ER просвета и трансмембранных белков 45-49.
Несколько факторов, должны быть рассмотрены при выборе метаболического фермента предохранитель к нестабильной белка. Во-первых, очень важно, чтобы это функциональный вариант гена, кодирующего фермент, неприсутствовать в геном хозяина. Чтобы свести к минимуму ложные положительные результаты (т.е. рост в селективных условиях, когда неустойчивое белок фактически деградирует), рекомендуется, чтобы работать со штаммами, которые укрывают необратимая мутантные аллели гена-репортера (предпочтительно полные генные делеции) 50. Другое соображение для выбора фермент-репортер является наличие конкурентных ингибиторов, которые могут быть включены в селективной среде роста, чтобы уменьшить рост фона и повышения жесткости анализа. Это может быть полезно в случаях белков с относительно низкой скорости оборота даже в присутствии полностью функциональных механизмов деградации. В представительных экспериментов, представленных здесь, включение 3-AT, который конкурентно ингибирует фермент HIS3, уменьшает рост фона 40. Кроме того, соединение 6 ингибирует azauracil-URA3, фермента, необходимого для биосинтеза урацила 51. Определяют концентрацию ингибитора, при которой рост происходит в деградации-Defective, но не дикого типа, клетки должны быть определены эмпирически. Некоторые метаболические ферменты могут быть также против выбран против. Под противоположных селективных условиях, клетки могут расти только при нестабильным белок разрушается (а конденсированный метаболического фермента нет). Например, URA3 преобразует соединение 5-fluoroorotic кислоту (5-FOA) к токсичным соединением, 5-фторурацил 52. Клетки, экспрессирующие белок URA3-слитый будет расти только в присутствии 5-FOA, если слитый белок URA3 ухудшается. Аналогичным образом, соединение 5-fluoroanthranilic кислоты (5-АВС) является токсичным для клеток с функциональной биосинтеза триптофана. 5-FAA Таким образом, можно использовать для борьбы с терроризмом, выберите клеток, экспрессирующих TRP1-слитые белки 53. Стратегии борьбы с отбора могут быть полезны для идентификации супрессоров деградации, затрудняющего мутаций.
Используемый промотор для управления экспрессией разложения, репортер также должен быть тщательно отобраны. Как низкий уровень biosynthEtic ферменты могут быть достаточным, чтобы поддерживать рост в отсутствие экзогенно метаболита, слабый промотор рекомендуется 54. В представительных экспериментов, представленных здесь, GAL4, промотор, который подавляется в присутствии глюкозы 55, используется, чтобы способствовать транскрипции Deg1 -Sec62-HIS3. Базальная экспрессия этого слитого белка под репрессирующих условиях (т.е. 2% глюкозы) достаточно, чтобы поддержать рост в селективных условиях (т.е. отсутствие гистидина и наличия +1 - 2 мм 3-АТ), когда механизм деградации отключена. Тем не менее, уровень белка, достаточных для поддержания роста в селективных условиях, скорее всего, будет ниже порога обнаружения по вестерн-блоттинга. Таким образом, это может быть необходимо для управления экспрессией со слабым промотором для анализа роста и более сильного промотора для биохимического подтверждения. В случае Deg1 -Sec62 (с или без слияния his3), более Robusт промотор (здесь, промотор МЕТ25 39) требуется для визуализации белка с помощью Вестерн-анализа.
Как описано здесь, дрожжи основе анализа роста может быть выполнена на малой, кандидата подхода. Серийные разведения клеток дрожжей получают в 96-луночный планшет с и передается с помощью пипетки на твердой среде для выращивания; Альтернативный способ для эффективного и воспроизводимого передачи разбавленных суспензий дрожжевых клеток на твердой среде является использование нескольких контактный репликатор в, обычно называют как "Frogger" 56. Идеальное время, чтобы сфотографировать пластины будут меняться в зависимости от деформаций и условий дрожжей. Рекомендуется, чтобы сфотографировать данную пластину, когда колонии из наиболее быстро растущих культуры сначала становятся видимыми на самом разбавленной месте. Это, как правило, точка, в которой различия в темпах роста среди образцов наиболее очевидны. Это может быть целесообразным, чтобы сфотографировать на нескольких дней, особенно в случае дрожжейвыставляется широкий диапазон скоростей роста.
Рост журналистом анализ также может быть адаптирована для крупномасштабных анализов. Например, ухудшение репортер может быть введен в коммерчески доступной библиотеки ~ 5000 жизнеспособных штаммов гаплоидный геном дрожжей с делецией с использованием синтетических Генетический Массив (СЕО) технологии 46,57. В этой технике, гаплоидный штамм дрожжей с хромосомой комплексного метаболического белка репортер слитого соединяется с каждого штамма библиотеки делеции гена. Полученные диплоидные клетки привлечен к образуют споры (пройти мейоз) и подвергали отбора на гаплоидный мейоза потомства укрывательство как метаболический репортер и индивидуальные удаления гена. Эти штаммы затем переносили в массе до средней селективным в отношении клеток, в которых этот белок был стабилизирован. Что касается малого масштаба анализа, если ген с роли в деградации белка удаляется, слитый белок будет стабилизирована и рост клеток будет усилена. Сопоставимыеpproaches были разработаны, которые позволяют одновременно трансформации большой коллекции штаммов с экстра-хромосомном поддерживается плазмид; Эта стратегия позволяет избежать хромосомной интеграции, спаривание, образование спор и мейоза выбор 54.
При мутации найдены, чтобы придать преимущество роста в клетки, несущие метаболически репортер, необходимо подтвердить, что биохимически мутация увеличивает обилие белка, представляющего интерес. Быстрый и надежный порядок дрожжи лизис, лучше адаптирована из метода Kuhsnirov 31, представлен. Этот протокол позволяет для извлечения белков в виде непосредственно пригодной для анализа с помощью Вестерн-блоттинга. Для анализа данного белка, количество лизата должны быть загружены на лунку, свойства акриламида гель, выбор мембраны, антител, используемых и их разведений, и способ обнаружения должны быть определены эмпирически. Представитель Вестерн-блоттинга протокол, описанный утilizes вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентных красителей; другие часто используемые протоколы полагаться на зависимость от антител, конъюгированного ферментов 58 хемилюминесценции. Как описано здесь, мембрана используется для обнаружения белка, представляющего интерес, могут быть непосредственно повторно зондировали с антителом белок управления загрузкой. Если первичные антитела, используемые для обнаружения белка, представляющего интерес белка и управления загрузки были подняты из того же вида, reprobing мембрану можно тех пор, пока полосы, возникающие из этих белков не мигрируют совместно. Если, однако, первичные антитела, используемые для обнаружения белка, представляющего интерес белка и управления загрузки были подняты из различных видов, так же мембрана может быть последовательно зондируют, даже если полосы совместно мигрируют, если вторичные антитела были конъюгированы с флуорофоров с различные длины волн излучения. В случае, когда представляющий интерес белок и белок управления загрузкой совместно мигрируют и соответствующих первичных антител были раиСЭД из того же вида, то пробы могут быть решен на двух гелей SDS-PAGE, переданных PVDF мембрану и зондировали отдельно с использованием антител, специфических для белка, представляющего интерес, и управления загрузкой белка. С другой стороны, загрузка последовательность может быть оценен путем инкубации мембраны с неспецифических белковых пятен (например Кумасси или Ponceau S). Кроме того, представитель протокол Вестерн-блоттинга предполагает белок или эпитоп, который обнаруживается путем последовательной инкубации первичных и вторичных антител, как это характерно. Слитые белки, проанализированные в представительных результатов содержит два эпитопы, полученные из золотистого стафилококка протеина А (АФР на рисунках 2 и 3). Белок соединяется непосредственно с иммуноглобулинов млекопитающих и, следовательно, могут быть обнаружены с помощью одиночку (т.е. не первичное антитело инкубации шаг не требуется) 59 вторичного антитела. Вполне возможно, что слияние с фермент-репортер может влиять белка изобилие илидеградация. Поэтому желательно, чтобы биохимически подтвердить результаты, используя версию подложки неизрасходованного-репортер белка. Наконец, оба анализы, описанные здесь, полагаются на различия в уровнях стационарных белка в качестве прокси для различий в стабильности белка. Поскольку белок обилие отражает интеграцию скоростей синтеза белка и деградации, дальнейшего биохимического анализа (например, циклогексимид Chase или импульсный Chase экспериментах) должны быть использованы для анализа непосредственно динамический профиль деградации белка.
Представительные результаты устанавливают новый применение этого протокола для определения генетических требований к деградации белка, который аберрантно входит в зацепление с ER транслокон. Deg1 -Sec62-his3 присвоено преимущество в росте дрожжей в селективных условиях, когда путь деградации инактивируют (например, в отсутствие убиквитинлигазы Hrd1). Быстрый и надежный экс белокМетод тяги с последующим вестерн-блоттинга подтвердил увеличение обилия Deg1 -Sec62 (с или без his3) в отсутствие Hrd1. Предыдущие исследования показали, что механизм Hrd1-зависимой деградации транслокона белков, ассоциированных отличается от других Hrd1 ER просвета или трансмембранных подложек 32. Будущая работа будет использовать гибридный белок Deg1 -Sec62-his3 в крупномасштабных генетических экранов для идентификации новых генов, необходимых для этого уникального механизма деградации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим нынешних и бывших членов лаборатории Рубинштейн для обеспечения благоприятных и энтузиазма исследовательскую среду. Мы благодарим Райана Т. Гибсон за помощь в оптимизации протокола. Мы благодарим Отметить Хохштрассер (Йельский университет) и Дитер Вольф (Universität Stuttgart) для штаммов дрожжей и плазмид. Мы благодарим наших рецензентов за их помощь в улучшении ясности и полезности этой рукописи. Эта работа была поддержана научным награду от главы Ball State University Сигма Кси к SGW, Национальный институт гранта здравоохранения (R15 GM111713), чтобы ЭМИ, исследования награда Ball State University стремиться к ЭМИ, а также средства от Ball State University Управление приорство и биологический факультет.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs. |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer. |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes. |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) | Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
References
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
- Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
- Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11 (2007).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
- Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
- Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
- Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
- Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
- Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
- Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
- Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
- Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
- Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
- Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
- Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
- Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
- Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
- Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
- Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093 (2012).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
- Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
- Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
- Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
- Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
- Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
- Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
- Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
- Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
- Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
- Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
- Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
- Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
- Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
- Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
- Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
- Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791 (2012).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
- Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).
Tags
Молекулярная биология выпуск 96 система Ubiquitin протеасомной,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
