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Biology

Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52428
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital
* These authors contributed equally

Abstract

La dégradation des protéines réglementé est crucial pour pratiquement toutes les fonctions cellulaires. Une grande partie de ce qui est connu sur les mécanismes moléculaires et génétiques exigences pour la dégradation des protéines eucaryotes a été initialement créé en Saccharomyces cerevisiae. Analyses classiques de la dégradation des protéines se sont appuyés sur pulse-chase et cycloheximide-chase méthodes biochimiques. Bien que ces techniques fournissent des moyens sensibles pour observer la dégradation des protéines, ils sont laborieux, de temps, et à faible débit. Ces approches ne sont pas aptes à la sélection rapide ou à grande échelle pour des mutations qui empêchent la dégradation des protéines. Ici, un test basé sur une croissance de la levure pour l'identification facile des exigences génétiques pour la dégradation des protéines est décrite. Dans ce dosage, une enzyme rapporteur nécessaire à la croissance dans des conditions sélectives spécifiques est fusionnée à une protéine instable. Les cellules dépourvues de l'enzyme rapporteur endogène mais qui expriment la protéine de fusion peut se développer sous sélective conditions que lorsque la protéine de fusion est stabilisé (lorsque la dégradation des protéines est compromise). Dans l'essai de croissance décrit ici, des dilutions en série de type sauvage et des cellules de levure mutantes qui hébergent un plasmide codant pour une protéine de fusion sont déposés sur un milieu sélectif et non-sélectif. Croissance dans des conditions sélectives est compatible avec la dégradation dépréciation par une mutation donnée. L'abondance de la protéine accrue devrait être confirmé biochimiquement. Procédé pour l'extraction rapide de protéines de levure sous une forme appropriée pour l'électrophorèse et transfert de Western est également démontrée. Une lecture basée sur la croissance pour la stabilité de la protéine, combinée avec un simple protocole d'extraction de protéines pour l'analyse biochimique, facilite l'identification rapide des exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Ces techniques peuvent être adaptées pour surveiller la dégradation d'une variété de protéines de courte durée. Dans l'exemple présenté, l'enzyme His3, qui est nécessaire pour la biosynthèse de l'histidine, a été fusionnéà DEG1 -Sec62. DEG1 -Sec62 est prévue pour dégradation après ce qu'il se engage aberrante le réticulum endoplasmique translocon. Cellules hébergeant DEG1 -Sec62-His3 sont capables de croître dans des conditions sélectives lorsque la protéine a été stabilisé.

Introduction

La dégradation sélective des protéines est essentielle à la vie eucaryote, et la dégradation de la protéine altérée contribue à un certain nombre de maladies, y compris plusieurs types de cancer, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, et la fibrose kystique 1-5. Le système ubiquitine-protéasome (UPS), qui catalyse la dégradation sélective des protéines, est une cible thérapeutique émergeant de ces conditions 6-10. ubiquitine ligases attachent de manière covalente des polymères de l'acide 76-ubiquitine aminés aux protéines 11. Les protéines qui ont été marqués avec des chaînes de polyubiquitine sont reconnus et protéolysée par les ~ 2,5 mégadaltons protéasome 26S 12. Études initiées dans l'organisme eucaryote modèle Saccharomyces cerevisiae (levure en herbe) ont été fondamental dans l'élucidation des mécanismes de dégradation des protéines dans les cellules eucaryotes. Le premier substrat physiologique démontré de l'onduleur était la levure répresseur transcriptionnel MATα2 13, 14, et de nombreux composants hautement conservées de la première UPS ont été identifiés ou caractérisés dans la levure (par exemple 15-26). Les découvertes faites dans cet organisme modèle polyvalent et génétiquement traitable sont susceptibles de continuer à fournir des informations importantes sur les mécanismes conservés de la dégradation des ubiquitine.

Reconnaissance et de la dégradation de la plupart des substrats UPS requièrent une action concertée de plusieurs protéines. Par conséquent, un objectif important dans la caractérisation de la dégradation régulée d'une protéine donnée est instable pour déterminer les exigences génétiques pour la protéolyse. Les approches classiques (par exemple pulse-chase et expériences cycloheximide-chase 27) pour surveiller la dégradation des protéines dans des cellules de mammifère ou de levure sont laborieuses et prennent du temps. Bien que ces types de méthodologie fournissent des moyens très sensibles pour détecter la dégradation des protéines, ils ne conviennent pas pour l'analyse rapide de la dégradation des protéines ou à grande échelle screening pour les mutations qui empêchent la dégradation des protéines. Ici, une analyse basée sur la croissance de la levure pour l'identification rapide des exigences génétiques pour la dégradation des protéines instables est présentée.

Dans la méthode de la croissance de la levure pour l'analyse de la dégradation des protéines, une protéine instable d'intérêt (ou un signal de dégradation) est fusionnée, en cadre, à une protéine qui est nécessaire pour la croissance de la levure dans des circonstances particulières. Le résultat est un substrat artificiel qui peut servir comme un outil puissant pour déterminer les exigences génétiques de la dégradation des protéines de la protéine d'intérêt instable. Idéalement, les souches de levure de laboratoire les plus couramment utilisés abritent un panel de mutations dans les gènes codant pour des enzymes métaboliques impliquées dans la biosynthèse de certains acides aminés ou de bases azotées (par exemple, 20,28-30). Ces enzymes sont essentiels pour la prolifération cellulaire en l'absence de métabolites dans exogène prévues dont la synthèse des enzymes participent. Telenzymes métaboliques peuvent ainsi fonctionner comme rapporteurs basées sur la croissance de la dégradation des protéines instables à laquelle ils sont fusionnés. Les exigences génétiques pour la dégradation des protéines peuvent être aisément élucidés, puisque des mutations qui empêchent la protéolyse permettront cellules hébergeant le reporter de dégradation de se développer dans des conditions sélectives.

Un avantage de croissance est une indication indirecte qu'une mutation particulier augmente l'abondance de la protéine d'intérêt. Cependant, l'analyse biochimique directe est nécessaire pour confirmer qu'une mutation permet la croissance à travers des niveaux accrus en protéines plutôt que par des causes indirectes ou artefacts. L'effet d'une mutation sur la protéine abondance peut être confirmée par analyse western blot des niveaux de protéines à l'état stable dans les cellules qui font et ne abritent la mutation particulière. Procédé pour l'extraction rapide et efficace de protéines de levure (incubation séquentielle de cellules de levure avec de l'hydroxyde de sodium et un tampon échantillon) sous une forme adaptéepour analyse par western blot est également présenté 31. Ensemble, ces expériences faciliter l'identification rapide des régulateurs de candidats de la dégradation des protéines.

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Protocol

1. levure croissance essai pour identifier des mutants candidats défectueux dans la dégradation des protéines

  1. Transform de type sauvage et des cellules de levure mutantes avec un plasmide codant pour une protéine fusionnée instable, en cadre, à une enzyme reporter métabolique.
  2. Ensemencer transformants dans 5 ml de synthèse défini (SD) de milieu minimal qui est sélectif pour les cellules portant des molécules plasmidiques. Incuber pendant une nuit à 30 ° C, en rotation.
  3. Mesurer la densité optique à 600 nm (DO600) de chaque culture d'une nuit.
    REMARQUE: Après incubation pendant une nuit, les cellules en culture peut être soit en phase de croissance logarithmique ou stationnaire, mais devrait avoir atteint une DO 600 de 0,2 minimal. Souches de levure à croissance très lente peuvent nécessiter des temps d'incubation plus d'une nuit, ou l'inoculation d'un plus grand nombre de cellules, tel que déterminé de manière empirique.
  4. Préparer six dilutions en série de cellules de levure transformées dans une plaque à 96 puits stériles, à partir de cellules diluées à unen DO600 de 0,2. Placez chaque transformant de levure à doser dans un enregistrement différent de la plaque de 96 puits.
    1. Pour chaque transformant, on calcule le volume de culture d'une nuit nécessaire pour diluer les cellules à une DO 600 de 0,2 dans un volume final de 200 ul. Ajouter ce volume de culture de la nuit à l'puits correspondant dans la colonne 1. Ajouter la quantité appropriée de l'eau stérile pour porter le volume à 200 pi.
    2. Pour chaque ligne de la levure, ajouter 125 pi d'eau stérile pour les puits dans les colonnes 2, 3 et 4.
      REMARQUE: des plaques à 96 puits stériles emballés individuellement peuvent être emballés avec des couvercles stériles. Les couvercles peuvent être utilisés comme réservoirs pour l'eau stérile qui est répartie dans cette étape. Ceci permet un transfert simultané de l'eau stérile à tous les puits dans une colonne donnée avec une pipette à canaux multiples.
    3. Mélanger le contenu de la première colonne (levure diluée jusqu'à une DO 600 de 0,2) par pipetage de haut en bas avec une pipette à canaux multiples.
    4. Transfer 25 pi de levure de la colonne 1 à la colonne 2, en utilisant une pipette multicanaux. Mélanger en pipetant. Transfert 25 ul de la colonne 2 à la colonne 3, et 25 pi de la colonne 3 à la colonne 4 (en mélangeant bien à chaque étape).
  5. Mélanger chaque échantillon avec une pipette multicanaux. Partant de la plus diluée pour diluer moins colonnes de levure, une pipette 4 pi de chaque échantillon sur deux plaques contenant le milieu sélectif approprié. Utilisez une plaque avec un milieu qui maintient sélection de plasmide (cette plaque sert de taches de levure et le contrôle de la croissance). Utiliser une seconde plaque avec un milieu qui sélectionne pour le maintien du plasmide et l'expression de la protéine instable fusionné à l'enzyme rapporteur. Parce que la levure se installer rapidement, mélanger les cellules par pipetage de haut en bas à intervalles réguliers.
    NOTE: Séchoir plaques seront plus facilement absorber le liquide que les plaques fraîchement préparés et sont donc recommandés pour ces expériences. Plaques humides peuvent être séchés par incubation à température ambiante dans lol'humidité w pour 1-2 jours ou incubations courtes dans une hotte à flux laminaire. Plaques peuvent sécher inégalement si le flux d'air laminaire est parallèle à la magistrature. Utilisation d'un gabarit, il est plus facile de repérer les cellules de levure à des distances régulières. Deux exemples de modèles sont fournis à la figure 1. Ceux-ci peuvent être imprimés, découpés et fixés à l'intérieur d'une boîte de Petri couvercle.
  6. Permettre aux plaques à sécher sur la paillasse.
  7. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 2-6 jours.
  8. Photographier chaque plaque après incubation.

Figure 1
Figure 1. Modèles pour repérer des cellules de levure sur des plaques d'agar de 100 mm. Ces modèles peuvent être utilisés pour faciliter repérer la levure à des distances régulières avec une pipette multicanaux. Les modèles peuvent être imprimés, découpés et fixés à l'intérieur d'une boîte de Petri couvercle. Placez boîte de Pétri avec la croissanceintérieur du couvercle moyenne avec modèle apposé. Les modèles sont marqués d'une encoche pour suivre l'orientation. Il est recommandé que les plaques utilisées dans des dosages de croissance être marqués de manière similaire avec une encoche pour suivre l'orientation. Modèles pour repérer quatre (A) ou cinq (B) des dilutions en série de cellules de levure sont fournis. Se il vous plaît cliquez ici pour afficher une version imprimable de ce chiffre avec 100 mm modèles.

2. Confirmation biochimique de croissance de la levure Assay

  1. La croissance des cellules de levure et d'extraction de protéines post-alcaline (modifiée du 31)
    1. Transform de type sauvage et des cellules de levure mutantes avec un plasmide codant pour la protéine instable.
    2. Ensemencer les transformants dans 5 ml de milieu SD qui est sélectif pour les cellules hébergeant molécules de plasmide. Incuber pendant une nuit à 30 ° C, en rotation.
    3. Mesurer la DO 600 de chaque cu nuitlture.
      REMARQUE: Après incubation pendant une nuit, les cellules peuvent être soit en phase de croissance logarithmique ou stationnaire, mais devrait avoir atteint une DO 600 qui permettra dilution jusqu'à une DO 600 de 0,2 à 10 ml de milieu sélectif frais (étape 2.1.4). Souches de levure à croissance très lente peuvent nécessiter des temps d'incubation plus d'une nuit, ou l'inoculation d'un plus grand nombre de cellules, tel que déterminé de manière empirique.
    4. Diluer les cellules de levure à une DO 600 de 0,2 à 10 ml de milieu sélectif frais.
    5. Continuer à incuber les cellules à 30 ° C, la rotation ou l'agitant, jusqu'à cultures atteignent une DO 600 entre 0,8 et 1,2 (ce est à dire sont en croissance mi-logarithmique).
      NOTE: Si la protéine d'intérêt est instable sous le contrôle d'un promoteur régulable, le moment optimal pour l'induction de l'expression de la protéine et la récolte des cellules peut varier selon les études antérieures ou des observations empiriques.
    6. Recueillir 2,5 OD 600 unités de la culture dans un 15 ml coniqueal tuyau par centrifugation à 5000 xg pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant par la pipette ou l'aspiration.
      REMARQUE: Un DO600 unité est définie comme la quantité de levure présente dans 1 ml de culture à DO 600 de 1,0. Le volume de la culture (en ml) nécessaire pour récolter 2,5 OD 600 unités (V) peut être déterminée en utilisant l'équation suivante: V = 2,5 unités DO 600 / DO mesurée 600
    7. Resuspendre les cellules dans 1 ml d'eau distillée. Transfert cellules en suspension dans un tube à centrifuger.
    8. Pellet les cellules par centrifugation à 6500 xg pendant 30 sec à température ambiante. Retirer le surnageant par la pipette ou l'aspiration.
    9. Resuspendre les cellules dans 100 pi d'eau distillée à la pipette de haut en bas ou de vortex, et ajouter 100 ul NaOH 0,2 M. Mélanger en pipetant. Incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante.
    10. cellules Pellet (dont la plupart ne ont pas encore libérés des protéines et sont encore viables) par centrifugation à 18 000 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant par la pipette ou l'aspiration.
    11. Remettre en suspension le culot dans 50 - 100 pi de tampon d'échantillon Laemmli 1x, qui lyser les cellules, par pipetage de haut en bas ou vortex.
      NOTE: L'élimination du surnageant alcalin après la centrifugation et remise en suspension ultérieure des cellules dans du tampon d'échantillon de Laemmli extrait de protéines à un pH compatible avec dodécylsulfate de sodium électrophorèse sur gel de sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) en utilisant un système tampon de roulement Tris-glycine et western blotting.
    12. Pour dénaturer complètement protéines, incuber les lysats à 95 ° C pendant 5 min.
      NOTE: Agrégation protéines-protéines exposées (par exemple avec plusieurs segments transmembranaires) peuvent devenir insolubles lorsqu'ils sont incubés à 95 ° C. Par conséquent, les lysats doivent être incubées à des températures plus basses (par exemple 37 ° C - 70 ° C) pendant 10 à 30 min, comme déterminé empiriquement, pour l'analyse de ces protéines.
    13. Lysats frais en le plaçant sur la glace pendant 5 min.
    14. Lysats centrifuger à 18 000 g pendant 1 min à température ambiante pour obtenir un culot insoluble. Séparer le surnageant (extrait de protéine solubilisée) par SDS-PAGE avant l'analyse western blot ultérieure (section 2.2). Alternativement, lysats de conserver à -20 ° C.
  2. Représentant Protocole Western Blot
    1. Charger le volume déterminé de manière empirique des lysats dans un gel de SDS-PAGE.
    2. Exécuter gel à 200 V jusqu'à ce que le colorant avant a atteint le fond du gel.
    3. Transfert de protéines à partir de gel de fluorure de polyvinylidène (PVDF) par transfert humide à 20 V pendant 60 à 90 min à 4 ° C.
    4. Bloquer membrane par incubation dans 5% de lait écrémé dans du Tris-solution saline tamponnée (TBS), bascule, pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
    5. Décanter la solution de blocage.
    6. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire spécifique pour la protéine d'intérêt (ou épitope tag de celui-ci) dans 1% de lait écrémé dans du TBS avec 0,1% de Tween-20 (TBS / T) pendant 1 h à la salle température, bascule.
    7. Décanter solution d'anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule.
    8. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore approprié dans 1% de lait écrémé dans du TBS / T pendant 1 heure à la température ambiante, à bascule.
      NOTE: En raison fluorophores sont sensibles à la lumière, des dilutions d'anticorps fluorophores conjugué doivent être préparés dans l'obscurité. En outre, l'incubation de membranes en présence d'anticorps conjugué à un fluorophore doit se produire dans des récipients étanches à la lumière. Ceci peut être réalisé en enroulant plateaux d'incubation dans de l'aluminium.
    9. Décanter solution d'anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule.
    10. Acquérir image de membrane en utilisant Li-Cor Odyssey CLx et logiciel Image Studio (ou de l'équipement d'imagerie comparables et logiciels), selon les recommandations du fabricant.
    11. Après l'imagerie membrane, incuber la membrane avec un anticorps primaire spécifique d'une chargeing protéine de contrôle dans 1% de lait écrémé dans du TBS / T pendant 1 heure à température ambiante, à bascule.
    12. Décanter solution d'anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule.
    13. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore approprié dans 1% de lait écrémé dans du TBS / T pendant 1 heure à la température ambiante, à bascule.
    14. Décanter solution d'anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule.
    15. Acquérir image de membrane en utilisant Li-Cor Odyssey CLx et logiciel Image Studio (ou de l'équipement d'imagerie comparables et logiciels), selon les recommandations du fabricant.

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Representative Results

Pour illustrer cette méthode, l'enzyme His3 a été fusionné à l'extrémité carboxy-terminale du modèle réticulum endoplasmique (RE) associée au gène de dégradation (ERAD) substrat, DEG1 -Sec62 (figure 2A) pour créer DEG1 -Sec62-His3 (Figure 3) . DEG1 -Sec62 représente un membre fondateur d'une nouvelle classe de substrats ERAD qui sont ciblées suivant, les association persistante aberrante avec le translocon, le canal principal responsable pour déplacer protéines à travers la membrane du RE 32-34. Ces protéines instables ont été provisoirement appelée ERAD-T (pour translocon-associé) substrats. Des études précédentes indiquent que, lors de l'engagement de translocation aberrante, DEG1 -Sec62 est ciblé pour la dégradation par l'ubiquitine ligase Hrd1 (figure 2B-D) 32, 34, 35. Les facteurs nécessaires à la dégradation d'autres substrats Hrd1 semblent être indispensables pour <em> la dégradation DEG1 -Sec62, suggérant un nouveau mécanisme de dégradation 32. Dans des conditions de conduite avec facultés liaison aux lipides et d'association de translocon prolongée, apolipoprotéine B, le composant protéique de mammifères lipoprotéines de basse densité, semble être dégradé par un mécanisme apparenté 36-38. Par conséquent, DEG1 -Sec62 peut fournir un modèle utile pour la dégradation des protéines de translocon associée médicalement pertinents.

Des cellules de type sauvage et hrd1Δ levure qui ne ont pas le gène HIS3 chromosomique ont été transformées avec un vecteur vide 39 ou d'un plasmide codant pour DEG1 -Sec62-His3 et déposés sur un milieu de croissance sélectif (figure 4). Pour confirmer que des nombres égaux de cellules de levure transformées ont été transférées à des plaques, les cellules ont été déposées sur un milieu dépourvu de tryptophane (qui sélectionne des cellules abritant le plasmide), mais contenant de l'histidine. Une croissance similaire a été observée pour toutes les cellules de levure transformées.Les cellules qui expriment DEG1 -Sec62-His3 on se attendait à croître en l'absence d'histidine uniquement lorsque la protéine de fusion est stabilisé (c.-à-DGAER lorsque T est compromise). En effet, hrd1Δ levure exprimant DEG1 -Sec62-His3 présentait un avantage par rapport à la croissance des cellules de type sauvage exprimant DEG1 -Sec62-His3 sur tryptophane manquant moyen et histidine. Cependant, la croissance marquée fusion protéine-dépendante en l'absence d'histidine a été observée même en présence de Hrd1. Afin d'augmenter la stringence de l'essai, un milieu dépourvu d'histidine a été additionné de 3-amino-1H-1,2,3-triazole (3-AT), un inhibiteur compétitif de l'enzyme His3 40. Levure exprimant Hrd1 a grandi très mal sur un milieu sans histidine supplémenté avec 1-2 mM 3-AT; lorsque HRD1 a été supprimée, la croissance cellulaire a été restauré. L'inclusion de 3-AT à une concentration de 3 mM considérablement inhibé la croissance de toutes les cellules, quelle que soit la présence ou l'absence de Hrd1. Ces res ULTS sont compatibles avec la dégradation de substrat Hrd1-dépendante.

Ensuite, l'abondance à l'état stable de la protéine DEG1 -Sec62-His3 dans la levure exprimant ou manque l'enzyme Hrd1 a été testé directement. Analyse Western blot a indiqué une augmentation comparable DEG1 -Sec62-His3 et de protéines DEG1 -Sec62 dans hrd1Δ levure par rapport aux cellules de type sauvage (figure 5). Cela confirme un rôle pour Hrd1 dans la régulation des niveaux des deux protéines. La dégradation Hrd1-dépendante de DEG1 -Sec62 procède après que la protéine aberrante engage translocon ER 32. Surtout, DEG1 -Sec62-His3 engage aberrante translocon d'une manière similaire (données non publiées), valider davantage l'utilisation de DEG1 -Sec62-His3 comme journaliste basé sur la croissance de la dégradation des DEG1 -Sec62 spécifiquement et protéines translocon associée en général.

s "> Figure 2
Figure 2:.. Modèle de la dégradation des DEG1 -Sec62 suivante engagement translocon aberrante (A) Représentation schématique du DEG1 -Sec62 DEG1 (les 67 acides aminés amino-terminale de MATα2) est suivie, dans l'ordre, par le drapeau (F) épitope , le 2-transmembranaire réticulum endoplasmique (ER) protéine sec62, et deux copies du S. aureus protéine A (PRA). Pour plus de clarté, la protéine de fusion est appelée DEG1 -Sec62. (B) Après l'insertion normale de ses deux segments transmembranaires dans la membrane du RE, l'interaction persistante de DEG1 -Sec62 avec la translocation anormale déclenche, DEG1 dépendante translocon engagement. Une portion de la queue amino-terminale cytosolique pénètre initialement et de manière aberrante probable reste dans-le translocon. (C) A la suite de engagemen translocon anormalest, Hrd1 reconnaît et ubiquitylates DEG1 -Sec62. Cercles rouges indiquent les molécules d'ubiquitine. (D) DEG1 -Sec62 est alors extrait à partir de la membrane du RE et dégradée par le protéasome, susceptible de soulager l'obstruction translocon.

Figure 3
Figure 3:. Représentation schématique du DEG1 -Sec62-His3 suivante engagement translocon aberrante DEG1 est suivie, dans l'ordre, par le drapeau (F) épitope, le 2-protéine transmembranaire ER sec62, deux copies de la S. aureus Protéine A (PrA), et l'enzyme de levure HIS3. Pour plus de clarté, la protéine de fusion est appelée DEG1 -Sec62-His3.

Figure 4
Figure 4: Alliant His3 à DEG1 (HRD1) et hrd1Δ levure transformée avec un vecteur vide ou d'un plasmide codant DEG1 -Sec62-His3 ont été repérés sur tryptophane milieu dépourvu, moyen tryptophane manquant et l'histidine et un milieu dépourvu de tryptophane et l'histidine supplémenté avec 3-amino-1H-1,2,3-triazole (3-AT), un inhibiteur compétitif de His3, aux concentrations indiquées. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Figure 5
Figure 5:. Augmentation abondance de DEG1 -Sec62 et DEG1 -Sec62-His3 dans des cellules dépourvues Hrd1 extraits protéiques ont été préparés à partir de type sauvage (+) et hrd1Δ(Δ) levure exprimant DEG1 -Sec62 ou DEG1 -Sec62-His3. Les protéines (équivalant à 0,125 unités DO 600) ont été séparées par SDS-PAGE, suivi par Western blot avec des anticorps secondaires de lapin anti-souris, qui se lient directement les épitopes de la protéine A des protéines de fusion. Après Western blot avec des anticorps spécifiques à PGK1 fournit un contrôle de chargement.

Tableau 1: Solutions et tampons utilisés dans cette étude.

Solution Composants Commentaires
Défini synthétique (SD) Minimal levure moyen 2% de dextrose, 0,67% de base azotée de levure sans acides aminés, 0,002% d'adénine, 0,004% d'uracile, de 0,002% d'arginine, 0,001% d'histidine, 0,006% d'isoleucine, 0,006% de leucine, 0,004% de lysine, 0,001% de methionine, 0,006% de la phénylalanine, 0,005 thréonine%, 0,004% de tryptophane. Pour solide (plaque) moyen, notamment 2% d'agar. 1. Milieu sélectif est préparé en omettant apappro- acide aminé (s) ou les bases azotées.
2. Pour plus de commodité, ces ingrédients peuvent être maintenues sous forme de solutions mères concentrées de la manière suivante. Les acides aminés peuvent être maintenues que solution mère 100X contenant tous les acides aminés souhaités. Base azotée de levure peut être maintenue dans une solution 20X de stock (13,4%). Le dextrose peut être maintenue dans une solution mère à 40%. Adénine et uracile peuvent être maintenues que 1% des solutions d'achat d'actions dans NaOH 0,1 M.
3. Stériliser à l'autoclave.
1X Laemmli Sample Buffer 2% de SDS, 10% de glycérol, 5% β-mercaptoéthanol, 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,008% de bleu de bromophénol 1. tampon d'échantillon 1X est souvent préparé en diluant un (par exemple 5X) stocks plus concentrée.
2. Le bleu de bromophénol de colorant peut être ajouté à l'intensité souhaitée. A "pincement" (très petite quantité taraudé depuis le bord d'une spatule) est généralement suffisante.
0,2 M d'hydroxyde de sodium Préparer dans l'eau. hydroxyde de sodium réagit avec le verre. Par conséquent, pour le stockage à long terme, 0,2 M d'hydroxyde de sodium doit être maintenu dans des récipients en plastique.
Courir tampon Laemmli (5X) 125 mM de Tris, glycine 960 mM, 0,5% de SDS Pour préparer 1 L de Laemmli 1X Courir tampon, diluer 1: 5 en DH 2 O
Tris Acétate-SDS Transfert Buffer (5X) 125 mM Tris acétate (pH 8,8), la glycine 960 mM, SDS à 0,05% Pour préparer 20 L de Tris 1X Acétate-SDS Transfert tampon, mélanger 4 L de 5X actions, 4 L de méthanol et 12 L de dH 2 O
10X Tris-solution saline tamponnée (SCT) 500 mM de Tris, 1,5 M de NaCl; pH ajusté à 7,5 Pour préparer 1 L de 1X SCT, diluer 1:10 en DH 2 O. TBS 1X peut être complétée avec le détergent Tween-20 et le lait écrémé en poudre, selon le cas.
<td> leu2-3,112
Strain Nom Alias Génotype pertinentes Figures Source
VJY6 MHY500 MATa 4 et 5 Chen et al., 1993
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY10 MATa 4 et 5 Cette étude
his3- Δ 200
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1 :: kanMX4

Tableau 2: levure. Souches utilisées dans cette étude Détails de construction sont disponibles sur demande.

Le plasmide Nombre Nom complet plasmide Figure Source
pVJ30 pRS414-P MET25 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA 5 Rubenstein et al., 2012
pVJ121 pRS414-P MET25 (vecteur vide avec le promoteur MET25) 4 Mumberg et al., 1994
pVJ467 pRS414-P MET25 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA-His3 5 Cette étude
pVJ477 pRS414-P GAL4 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA-His3 4 Cette étude

Tableau 3:. Les plasmides utilisés dans cette étude est à noter que tous les plasmides contiennent un centromère de levure pour permettre la réplication dans des cellules de levure, le gène TRP1 pour une sélection dans des cellules de levure, et le gène AmpR pour l'entretien dans des cellules bactériennes. Cartes plasmide, les séquences et les détails de construction sont disponibles sur demande.

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Discussion

La méthodologie présentée ici permet la détermination rapide et confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans des cellules de levure. Ces expériences mettent en évidence l'utilité et la puissance de la levure comme modèle organisme eucaryote (plusieurs excellentes critiques de levure biologie et compilations de protocoles pour la manipulation, le stockage et la manipulation de cellules de levure (par exemple 41-44) sont disponibles pour les enquêteurs de nouveaux à l'organisme). Ces techniques peuvent facilement être appliquées pour étudier la dégradation et de l'abondance d'une variété de classes de protéines. Par exemple, d'autres ont recours à cette stratégie de caractériser les mécanismes de cytosolique instable, nucléaire, et ER luminale et des protéines transmembranaires 45-49 dégradation.

Quelques facteurs doivent être considérés dans le choix de l'enzyme métabolique pour fondre à une protéine instable. Premièrement, il est essentiel qu'une version fonctionnelle du gène codant pour l'enzyme nonêtre présent dans le génome de l'hôte. Pour réduire au minimum les résultats faussement positifs (ce est à dire une croissance dans des conditions sélectives lorsque la protéine est en fait instable dégradé), il est recommandé de travailler avec des souches abritant non réversible allèles mutants du gène rapporteur (de préférence des deletions de gènes complets) 50. Une autre considération pour le choix de l'enzyme rapporteur est la disponibilité des inhibiteurs compétitifs, qui peuvent être inclus dans le milieu de croissance sélectif pour réduire la croissance d'arrière-plan et d'améliorer dosage stringence. Cela peut être utile en cas de protéines avec des taux de rotation relativement faibles, même en présence des mécanismes de dégradation entièrement fonctionnels. Dans les expériences représentatives présentées ici, l'inclusion de 3-AT, qui inhibe de façon compétitive l'enzyme His3, réduit la croissance d'arrière-plan 40. De même, le composé 6-aza-uracile Ura3 inhibe, une enzyme requise pour la biosynthèse de l'uracile 51. La concentration en inhibiteur à laquelle la croissance a lieu à une dégradation-d, mais de type sauvage efective pas, les cellules doit être déterminée de manière empirique. Certaines enzymes métaboliques peuvent également être contre-contre-sélectionnées. Dans des conditions de contre-sélectif, les cellules peuvent croître que lorsque la protéine est instable dégradé (et l'enzyme métabolique condensé ne est pas présente). Par exemple, Ura3 convertit l'acide 5-fluoroorotique composé (5-FOA) en composé toxique, le 5-fluorouracile 52. Les cellules exprimant une protéine de fusion Ura3 ne fera que croître en présence de 5-FOA si la protéine de fusion est dégradé Ura3. De même, l'acide 5-fluoroanthranilique composé (5-FAA) est toxique pour les cellules avec une voie de biosynthèse du tryptophane fonctionnelle. 5 FAA peut ainsi être utilisée pour contre-sélectionner des cellules exprimant des protéines de fusion Trp1-53. Stratégies de contre-sélection peuvent être utiles pour l'identification des suppresseurs de mutations de dégradation invalidant.

Le promoteur utilisé pour diriger l'expression d'un journaliste de dégradation doit aussi être choisie avec soin. Comme faibles niveaux de BIOSYNTHétique enzymes peuvent être suffisantes pour soutenir la croissance en l'absence de métabolite fourni de manière exogène, un promoteur faible est recommandé 54. Dans les expériences représentatives présentées ici, le promoteur GAL4, qui est réprimée en présence de glucose 55, est utilisé pour promouvoir la transcription d'DEG1 -Sec62-His3. Expression basale de cette protéine de fusion dans des conditions de répression (par exemple 2% de glucose) est suffisante pour soutenir la croissance dans des conditions sélectives (par exemple absence d'histidine et de la présence de 1 à 2 mM de 3-AT) lorsque le mécanisme de dégradation est désactivé. Cependant, les niveaux de protéines suffisantes pour soutenir la croissance dans des conditions sélectives sont susceptibles d'être en dessous du seuil de détection par transfert de Western. Par conséquent, il peut être nécessaire de commander l'expression avec un promoteur faible pour le dosage de croissance et d'un promoteur fort pour confirmation biochimique. Dans le cas de DEG1 -Sec62 (avec ou sans la fusion His3), une plus Robust promoteur (ici, le promoteur MET25 39) est nécessaire pour la visualisation des protéines par analyse de Western.

Comme décrit ici, le test de croissance à base de levure peut être effectuée sur une approche fondée sur le candidat-petite échelle. Des dilutions en série de cellules de levure sont préparés dans une plaque à 96 puits et transférés à la pipette dans un milieu de croissance solide; une autre méthode pour le transfert efficace et reproductible de suspensions de cellules de levure sur un milieu solide dilué est l'utilisation d'un réplicateur à broches multiples, couramment appelée une "frogger" 56. Le moment idéal pour photographier les plaques varient en fonction des souches de levure et conditions. Il est recommandé de photographier une plaque donnée lorsque les colonies de la culture la plus forte croissance premier deviennent visibles à l'endroit le plus dilué. Ce est typiquement le point où les différences de taux de croissance entre les échantillons sont les plus évidentes. Il peut être judicieux de prendre des photos sur plusieurs jours, en particulier dans le cas de la levureprésentant un large éventail de taux de croissance.

Le dosage rapporteur basée sur la croissance peut également être adapté pour des analyses à grande échelle. Par exemple, un journaliste de la dégradation peut être introduit dans une bibliothèque disponible dans le commerce de ~ 5000 souches haploïdes de délétion du gène de levure viables utilisant synthétique tableau génétique (SGA) 46,57 technologie. Dans cette technique, une souche de levure haploïde avec une protéine reporter métabolique de fusion chromosomiquement intégré est associé à chaque souche de la bibliothèque de délétion du gène. Les cellules diploïdes résultantes sont amenés à sporuler (subir une méiose) et soumises à une sélection de la descendance haploïde méiotique hébergeant à la fois le reporter métabolique et deletions de gènes individuels. Ces souches sont alors transférés en masse de milieu sélectif pour les cellules dans lesquelles la protéine a été stabilisés. En ce qui concerne les analyses à petite échelle, si un gène jouant un rôle dans la dégradation des protéines est supprimée, la protéine de fusion sera stabilisé, et la croissance des cellules sera renforcée. Un niveau comparablepproches ont été conçus qui permettent la transformation simultanée d'une grande collection de souches avec des extra-chromosomique plasmides entretenus; cette stratégie évite intégration chromosomique, l'accouplement, la sporulation et la sélection de la méiose 54.

Lorsqu'une mutation se trouve à conférer un avantage de croissance à des cellules abritant un journaliste métabolique, il est nécessaire de confirmer que biochimiquement la mutation augmente l'abondance de la protéine d'intérêt. Une procédure de levure lyse rapide et fiable, étroitement adapté de la méthode de Kuhsnirov 31, est présenté. Ce protocole permet l'extraction des protéines sous une forme directement adaptée à l'analyse par transfert de Western. Pour l'analyse d'une protéine donnée, la quantité de lysat pour être chargé par puits, les propriétés du gel d'acrylamide, le choix de la membrane, les anticorps utilisés et des dilutions de celui-ci, et un procédé de détection doit être déterminée empiriquement. Le protocole western blot représentant a décrit utilizes anticorps secondaires conjugués à des colorants fluorescents; d'autres protocoles couramment utilisés se appuient sur ​​des enzymes dépendant d'anticorps conjugué 58 chimioluminescence. Comme décrit ici, la membrane utilisée pour détecter la protéine d'intérêt peut être directement sondé avec un anticorps pour une protéine de contrôle du chargement. Si les anticorps primaires utilisés pour détecter la protéine d'intérêt et une protéine de contrôle de charge ont été exprimées à partir de la même espèce, reprobing la membrane est possible tant que les bandes issues de ces protéines ne est pas le co-migrent. Si, toutefois, les anticorps primaires utilisés pour détecter la protéine d'intérêt et une protéine de contrôle du chargement ont été exprimées à partir d'espèces différentes, la même membrane peut être séquentiellement sondé, même si les bandes co-migrent, si les anticorps secondaires ont été conjugués à des fluorophores avec différentes longueurs d'onde d'émission. Dans le cas où la protéine d'intérêt et le contrôle de chargement de protéines co-migrent et les anticorps primaires respectifs ont été raised de la même espèce, les échantillons peuvent être réglés sur deux gels SDS-PAGE, transférés sur une membrane PVDF, et sondées séparément avec des anticorps spécifiques pour la protéine d'intérêt et contrôle de chargement de protéines. Alternativement, la cohérence chargement peut être jugé par l'incubation de membranes avec des taches de protéines non spécifiques (par exemple Coomassie ou Ponceau S). En outre, le protocole Western blot représentatif assume une protéine ou un epitope qui est détectée par incubation séquentielle des anticorps primaires et secondaires, comme cela est typique. Les protéines de fusion analysés dans les résultats représentatifs contiennent deux epitopes dérivés de la protéine A de Staphylococcus aureus (PRA dans les figures 2 et 3). La protéine A se lie directement à des immunoglobulines de mammifère et peut donc être détecté en utilisant un anticorps secondaire seul (ce est à dire sans étape d'incubation d'anticorps primaire est nécessaire) 59. Il est possible que la fusion d'une enzyme rapporteur peut influencer ou protéine abondancedégradation. Il est donc conseillé de confirmer biochimiquement les résultats en utilisant une version du substrat inutilisé par la protéine rapporteur. Enfin, les deux essais décrits ici se appuient sur des différences dans les niveaux de protéines à l'état stationnaire comme un proxy des différences dans la stabilité des protéines. Parce abondance des protéines reflète l'intégration des taux de la synthèse des protéines et la dégradation, outre l'analyse biochimique (p.ex. cycloheximide expériences de chasse ou de poursuite d'impulsion) doit être employée pour analyser directement profil de dégradation dynamique d'une protéine.

Les résultats représentatifs établir une nouvelle application de ce protocole pour la détermination des exigences génétiques pour la dégradation d'une protéine qui se engage de façon aberrante translocon ER. DEG1 -Sec62-His3 conférait un avantage de croissance de la levure dans des conditions sélectives lorsque la voie de dégradation a été inactivé (ce est à dire dans l'absence de l'ubiquitine ligase Hrd1). Une protéine ex rapide et fiableProcédé de traction suivie par transfert de Western a confirmé une augmentation de l'abondance de DEG1 -Sec62 (avec ou sans His3) en l'absence de Hrd1. Des études précédentes indiquent que le mécanisme de dégradation Hrd1 dépendant des protéines associées translocon diffère de ceux d'autres luminales ou transmembranaires Hrd1 ER 32 substrats. Les travaux futurs emploiera la protéine de fusion DEG1 -Sec62-His3 dans les écrans génétiques à grande échelle pour identifier de nouveaux gènes nécessaires à ce mécanisme de dégradation unique.

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Disclosures

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions les membres actuels et anciens du laboratoire Rubenstein pour fournir un environnement de recherche et enthousiaste. Nous remercions Ryan T. Gibson pour l'assistance dans l'optimisation de protocole. Nous remercions Mark Hochstrasser (Université de Yale) et Dieter Wolf (Universität Stuttgart) pour les souches de levures et plasmides. Nous remercions nos lecteurs anonymes pour leur aide dans l'amélioration de la clarté et l'utilité de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche de la section de l'Université Ball State de Sigma Xi à SGW, un National Institutes of Health subvention (R15 GM111713) au DME, une bourse de recherche de Ball State University aspirent à DME, et les fonds de l'Université Ball State Bureau du prévôt et Département de biologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
 
 
 

 
Name Company Catalog Number Comments
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

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