This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.
Деградация Регулируемый белок имеет решающее значение практически для каждого клеточной функции. Многое из того, что известно о молекулярных механизмах и генетических требований к деградации эукариотической белка была первоначально создана в Saccharomyces CEREVISIAE. Классические анализ деградации белков полагались на биохимические импульсно-Чейз и циклогексимид погони методологий. Хотя эти методы обеспечивают чувствительные средства для наблюдения деградации белка, они являются трудоемкими, отнимающим много времени, и низкая пропускная способность. Эти подходы не поддаются быстрому или крупномасштабного скрининга мутаций, которые предотвращают деградацию белка. Здесь дрожжи роста на основе анализа для поспешном идентификации генетических требований к деградации белков описано. В этом анализе, фермент-репортер требуется для роста в конкретных условиях селективного слит с неустойчивой белка. Клетки, не имеющие эндогенного фермента-репортера, но, экспрессирующие слитый белок может расти в СелеCTIVE условия только тогда, когда слитый белок стабилизируют (т.е. при деградации белка нарушена). В анализе роста, описанного здесь, серийные разведения дикого типа и мутантных клеток дрожжей, несущих плазмиду, кодирующую слитый белок, наносили на селективной и неселективной среды. Рост в селективных условиях в соответствии с обесценение деградации данного мутации. Увеличение белка обилие должны быть биохимически подтверждено. Способ быстрого извлечения дрожжевых белков в форме, подходящей для электрофореза и Вестерн-блоттинга также продемонстрировал. Считывание рост на основе стабильности белка, в сочетании с простым протоколом для экстракции белка для биохимического анализа, облегчает быструю идентификацию генетических требований к деградации белка. Эти методы могут быть адаптированы для мониторинга деградации различных короткоживущих белков. В примере, представленном фермент HIS3, который необходим для биосинтеза гистидина, был слитв Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 предназначен для деградации после аномально занимается эндоплазматической сети транслокон. Клетки, несущие Deg1 -Sec62-his3 удалось вырастить в селективных условиях, когда белок был стабилизирован.
Селективный деградации белка имеет важное значение для эукариотической жизни, и деградация измененный белок способствует ряда заболеваний, в том числе некоторых видов рака, нейродегенеративных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, и кистозный фиброз 1-5. Система убиквитин-протеасомный (ИБП), который катализирует селективное разрушение белка, является новым терапевтической мишенью для этих условий 6-10. Убиквитин-лигазы ковалентно присоединить полимеры убиквитина 76-аминокислота белков 11. Белки, которые были отмечены с полиубиквитиновый цепей признаются и proteolyzed по ~ 2,5 megadalton 26S протеасом 12. Исследования, начатые в модели эукариотических организмов Saccharomyces Cerevisiae (почкованием дрожжей) были основополагающими в выяснении механизмов деградации белка в эукариотических клетках. Впервые продемонстрирована физиологический субстрат ИБП был дрожжи транскрипции репрессор MATα2 13, 14, и многие высоко консервативные компоненты ИБП впервые были определены или отличающийся тем, дрожжей (например, 15-26). Открытия, сделанные в этом универсальном и генетически послушный модельного организма, скорее всего, продолжит оказывать важную информацию консервативных механизмов убиквитин-опосредованной деградации.
Признание и деградация большинства субстратов ИБП требуют совместных действий нескольких белков. Таким образом, важной задачей при характеристике регулируемого деградации данного нестабильной белка, чтобы определить генетические требования для протеолиза. Классические методы (например, импульсно-чейз и циклогексимид-чейз-эксперименты 27) для мониторинга деградации белка в млекопитающих или дрожжевые клетки трудоемким и занимает много времени. В то время как эти типы методологии обеспечивают высоко чувствительные средства для детектирования деградацию белков, они не подходят для быстрого анализа деградации белка или крупномасштабного screeniнг для мутаций, которые предотвращают деградацию белка. Здесь дрожжи роста на основе тест для быстрой идентификации генетических требований к деградации неустойчивых белков представлены.
В дрожжей на основе экономического роста метод анализа деградации белка, неустойчивый интерес белок (или деградации сигнала) сливают, в рамке, с белком, который необходим для роста дрожжей при определенных обстоятельствах. Результатом является искусственный субстрат, который может служить в качестве мощного инструмента для определения генетического требованиям деградации белков нестабильной белка. Удобно, наиболее часто используемые дрожжевые штаммы лаборатории укрывает панель мутаций в генах, кодирующих метаболические ферменты, участвующие в биосинтезе определенных аминокислот или азотистых оснований (например, 20,28-30). Эти ферменты имеют важное значение для клеточной пролиферации в отсутствие экзогенно предоставленных метаболитов в которых синтез ферменты участвуют. Такиеметаболические ферменты могут, таким образом, функционировать в качестве роста на основе репортеры за деградацию нестабильных белков, к которым они слиты. Генетические требования к деградации белков могут быть легко объяснены, так как мутации, которые предотвращают протеолиз позволит клетки, несущие деградации репортер расти при селективных условиях.
Преимущество рост косвенным свидетельством того, что особенности мутация увеличивает изобилие белка. Тем не менее, прямой биохимический анализ необходим, чтобы подтвердить, что мутация позволяет рост за счет увеличения содержания белка, а не через косвенные или артефактом причин. Эффект мутации на белковой изобилии, может быть подтверждено с помощью Вестерн-блот анализа уровней стационарных белка в клетках, что делать, и не питают особого мутацию. Способ быстрого и эффективного извлечения дрожжевых белков (последовательной инкубацией клеток дрожжей с помощью гидроксида натрия и образец буфера) в форме, пригоднойдля анализа с помощью Вестерн-блоттинга также представлены 31. Вместе, эти эксперименты содействия скорейшей идентификации регуляторов кандидатов деградации белка.
Методология, представленные здесь позволяет для быстрого определения и биохимического подтверждения генетических требований к деградации белков в дрожжевых клетках. Эти эксперименты выделить полезность и власть дрожжей в качестве модели эукариотических организмов (несколько отли?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим нынешних и бывших членов лаборатории Рубинштейн для обеспечения благоприятных и энтузиазма исследовательскую среду. Мы благодарим Райана Т. Гибсон за помощь в оптимизации протокола. Мы благодарим Отметить Хохштрассер (Йельский университет) и Дитер Вольф (Universität Stuttgart) для штаммов дрожжей и плазмид. Мы благодарим наших рецензентов за их помощь в улучшении ясности и полезности этой рукописи. Эта работа была поддержана научным награду от главы Ball State University Сигма Кси к SGW, Национальный институт гранта здравоохранения (R15 GM111713), чтобы ЭМИ, исследования награда Ball State University стремиться к ЭМИ, а также средства от Ball State University Управление приорство и биологический факультет.
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs |
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer |
Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers |
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) |
Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |