Abstract
La criptococosis es una infección potencialmente mortal causada por hongos patógenos del género Cryptococcus. La infección se produce después de la inhalación de las esporas, que son capaces de replicar en el pulmón profundo. La fagocitosis por los macrófagos de Cryptococcus es una de las formas en que la enfermedad es capaz de propagarse en el sistema nervioso central para causar meningoencefalitis letal. Por lo tanto, el estudio de la asociación entre Cryptococcus y macrófagos es importante para entender la progresión de la infección. El presente estudio describe un protocolo de paso a paso para estudiar la infectividad de macrófagos por C. neoformans in vitro. El uso de este protocolo, se estudia el papel de los esteroles de acogida en las interacciones huésped-patógeno. Diferentes concentraciones de metil - ciclodextrina (MCD) se utilizaron para suprimir el colesterol de murino sarcoma retículo-macrófago línea celular J774A.1. El agotamiento de colesterol se confirmó y cuantificó usando tanto un dis comercialmentekit de cuantificación de colesterol e y cromatografía en capa fina. Células de colesterol empobrecido se activaron usando lipopolisacárido (LPS) y el interferón gamma (IFN) y se infectaron con Cryptococcus neoformans anticuerpos opsonizado de tipo salvaje células H99 en una relación de efector a diana de 1: 1. Las células infectadas fueron monitorizados después de 2 h de incubación con C. se calculó neoformans y su índice de fagocitosis. Agotamiento de colesterol dio lugar a una reducción significativa en el índice de fagocitosis. Los protocolos presentados ofrecen un método conveniente para imitar la iniciación del proceso de infección en un entorno de laboratorio y estudiar el papel de la composición de lípidos de acogida sobre la infectividad.
Introduction
La fagocitosis es un proceso por el cual las entidades extracelulares son internalizados por las células huésped. Es un arma clave en el arsenal del sistema inmune para defenderse contra agentes patógenos, pero el proceso a menudo puede ser subvertido por patógenos para permitir la internalización y la difusión a través del cuerpo 1. La fagocitosis está mediada por varios eventos de señalización que resultan en la unión y la inmersión a través de reordenamientos de citoesqueleto de la célula huésped. Fagocitos "profesional" son capaces de reconocer y unirse a opsoninas en la superficie del patógeno invasor a la señal para la unión y la formación de lamelipodios, que sobresalgan del patógeno y formar un fagosoma 2. Entre los llamados fagocitos "profesionales" son los macrófagos. Los macrófagos son células altamente especializadas que realizan funciones de protección que incluyen la búsqueda y eliminación de agentes causantes de enfermedades, la reparación de los tejidos dañados, y la mediación de la inflamación, la mayoría deéstos a través del proceso de la fagocitosis 1,2.
Cryptococcus neoformans es una especie de levadura patógena que causa una enfermedad grave conocida como criptococosis. Cryptococcus esporas son inhaladas por el anfitrión y dan lugar a una infección pulmonar que suele ser asintomática. Se cree que la exposición es muy frecuente; una muestra de 61 niños de las Enfermedades Infecciosas Pediátricas Clínica en el Hospital Centro de Bronx-Lebanon encontró que todos los encuestados tenían anticuerpos contra el polisacárido glucuronoxylomanan criptocócica y otros estudios han demostrado la prevalencia tanto en el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) no infectado y adultos infectados 3, 4. Los macrófagos alveolares son la primera línea de la respuesta a la infección pulmonar y en la mayoría de los casos con éxito claro el patógeno. Sin embargo, en individuos inmunodeprimidos (pacientes por ejemplo, VIH y SIDA), la levadura es capaz de sobrevivir dentro de los macrófagos. En estosde los casos, los macrófagos pueden servir como un nicho para la replicación del patógeno y pueden facilitar su difusión en el sistema nervioso central (CNS), donde la enfermedad se vuelve mortal 5-8. Se cree que los macrófagos pueden incluso ofrecer la levadura directamente en las meninges, ayudando a la levadura para cruzar la barrera de sangre del cerebro a través del modelo "caballo de Troya" 3,9 - 11. Por lo tanto, es importante entender el proceso de fagocitosis y los factores que la afectan, especialmente en infecciones por criptococos.
El trabajo previo en otros sistemas de patógenos apuntan a colesterol y lípidos balsas formadas por colesterol como teniendo un papel importante que desempeñar en la fagocitosis 12-15. El colesterol es la especie de lípidos más abundantes en las células de mamífero y comprende 25 - 50% de la membrana de células de mamíferos 16. Se ha encontrado a desempeñar un papel en la modulación de la BIOPpropiedades ÍSICA de membranas cambiando su rigidez 17. El colesterol y esfingolípidos juntos forman microdominios lipídicos dentro de la membrana conocida como balsas lipídicas. Se ha encontrado que las balsas de lípidos estar involucrado en la formación de caveolas, así como proporcionar un dominio aislado para ciertos tipos de señalización 16-18. Debido a su pequeño tamaño, es difícil de estudiar las balsas de lípidos in vivo. Una forma útil para estudiar el papel de las balsas lipídicas es alterar sus electores. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) es un compuesto que se ha encontrado para agotar el colesterol de las membranas de mamíferos y se utiliza comúnmente para estudiar el papel de las balsas de lípidos 18.
En este protocolo, se presenta un método para agotar el colesterol de las membranas de la célula huésped y cuantificar el efecto de la disminución en la capacidad de las células huésped para fagocitar C. neoformans in vitro. Este procedimiento hace uso de cultivo celular techniqUES en un macrófago como línea celular inmortalizada (J774A.1) como un modelo para la infección. Agotamiento de colesterol se llevó a cabo por la exposición a MβCD, que tiene un núcleo hidrófobo específico para el tamaño de los esteroles y es capaz de actuar como un sumidero para el colesterol para dibujar hacia fuera de la membrana 19. Agotamiento de colesterol se midió cuantitativamente usando un kit disponible comercialmente y cualitativamente utilizando una extracción de lípidos Bligh-Dyer modificada seguido por cromatografía en capa fina (TLC) 20. . La fagocitosis se midió mediante la infección de la línea celular con un cultivo de levadura opsonizado mezclado con un cóctel de interferón-γ y lipopolisacárido para la activación de los macrófagos Cryptococcus se opsonizó utilizando un glucuronoxylomanan (GXM) de anticuerpos 21-23. Tinción y experimentos de microscopía permitido para la visualización de las células y el cálculo del índice de fagocitosis para evaluar el grado de fagocitosis. En conjunto, este protocolo dEscribes un método básico que integra la alteración de la composición de lípidos con un proceso fisiológico.
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Protocol
1. El colesterol agotamiento de las células J774A.1 con MβCD
- En una cabina de bioseguridad estéril, de semillas 10 5 J774A.1 células de tipo macrófago por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos en 200 l de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 O / N.
- Retire el medio de la monocapa de células y se lavan las células dos veces con fosfato 1x solución salina tamponada (PBS) que ha sido filtrada o tratada en autoclave.
- Añadir 200 l de solución de MβCD a la concentración deseada (10 mM o 30 mM en PBS) o 1x PBS como control y se incuba durante 30 min a 37 ° C con agitación. Eliminar el sobrenadante y reserva a RT para el análisis cuantitativo con el kit comercialmente disponible inmediatamente después del procedimiento.
- Lavar las células dos o tres veces con PBS 1x o DMEM sin suero y continuar con infección o lisar células por pipetting de dos a tres veces con H2O desionizada para el análisis con cromatografía de capa fina o con un kit.
NOTA: Tras el agotamiento de colesterol un kit de cuantificación de colesterol disponible comercialmente se puede utilizar. Vea la sección de materiales para los detalles. Siga las instrucciones del fabricante como está escrito.
2. Observación de colesterol contenido cromatografía en capa fina (TLC)
- Lavar un tanque de TLC dos veces con acetona y una vez con una solución de éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 en volumen). Saturar el tanque con el éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 en volumen) solución y dejar O / N.
NOTA: Orgánica disolventes siempre se deben utilizar bajo una campana de humos para evitar la inhalación de los vapores. Guantes y bata de laboratorio deben ser usados en todo momento. El ácido acético es un ácido fuerte y se debe utilizar con precaución. - En un gabinete de bioseguridad estéril, semillas 10 6 J774A.1 como los macrófagos-células por pocillo en un ce 6 pocillosll placa de cultivo en un volumen de 5 ml de DMEM caliente suplementado con 10% de FBS y 1% P / S. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N.
- Agotan los macrófagos de colesterol siguiendo los pasos 1.2 a 1.4, sustituyendo 1 ml para 200 l en su caso para tener en cuenta el tamaño bien grande.
- Añadir 500 l de Tripsina-EDTA a cada pocillo, se incuba durante 3 min a 37 ° C, y raspar suavemente las células con un raspador de células.
- Transferir a un tubo de microcentrífuga y añadir un adicional de 500 l de DMEM caliente suplementado con 10% de FBS y 1% P / S.
- Girar las células durante 5 min a 300 xg y eliminar el sobrenadante.
- Añadir un adicional de 500 l de DMEM caliente suplementado con 10% de FBS y 1% P / S al sedimento celular y resuspender cuidadosamente por pipeteando arriba y abajo.
- Retire 10 l de células y contar las células en un hemocitómetro. Normalizar las concentraciones de células de cada muestra y añadir un número igual de células a tubos de vidrio.
NOTA: En este paso, se puedeelegir combinar las células de los mismos grupos de tratamiento para obtener un extracto final de lípidos más concentrada. - Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y eliminar los medios de comunicación.
- Añadir 2 ml de metanol y vórtice. A continuación, añadir 1 ml de cloroformo y agitar. Compruebe el estado de fase para asegurarse de que la solución en monofásico.
NOTA: Los tubos se puede almacenar a 4 ° CO / N. - Centrifugar a 1700 xg durante 10 min a TA y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo
- Añadir un adicional de 1 ml de cloroformo, seguido de 1 ml de dH 2 O. Vortex dos veces durante 30 segundos. Centrifugar a 1700 xg durante 5 min a TA.
- Pesar un tubo de vidrio en un equilibrio sensible y utilizar una pipeta Pasteur de vidrio para transferir la fase inferior en el tubo de vidrio de peso conocido.
- Seque los lípidos en un evaporador centrífugo hasta que se seque (aproximadamente 2 horas). Pesar tubo con lípidos secos y calcular el peso de lípido seco.
NOTA: los lípidos secos se puede almacenar en -20 ° C hasta que esté listo para realizar TLC. - Diluir lípidos secos en suficiente cloroformo para normalizar la concentración de lípido (normalmente 20 - 50 l) y la carga de 20 l de la lípido diluido en una placa de TLC de sílice. Cargar 20 g de colesterol diluido en 20 l de cloroformo como un estándar.
- Añadir placa de TLC se secó al tanque de TLC saturado y permitir disolvente para migrar hasta 1 cm antes de borde de la placa. Retire la placa de TLC en el tanque y deje que se seque unos 5 min.
- Visualice los lípidos mediante la colocación de un tanque de vapor de yodo para comprobar la migración. Retirar y permiten manchas a desaparecer durante unos 10-15 min bajo el capó.
NOTA: El yodo es un riesgo de inhalación. Utilice siempre bajo una campana de humos. - Preparar una solución para la tinción de lípidos neutros mediante la combinación de 60 ml de metanol con 60 ml de H2O desionizada, 4 ml de ácido sulfúrico, y 630 mg de cloruro de manganeso.
- Con cuidado y lentamente sumergir la placa de TLC en la solución de tinción de lípidos neutros en una bandeja y quitar sin desprendimiento de la l de síliceayer.
NOTA: La solución de tinción lípido neutro puede ser reutilizado varias veces y por lo que puede ser recuperada de la bandeja y se coloca de nuevo en una botella para su uso posterior. - Deje que la placa se seque bajo el capó a TA hasta que todas las burbujas ha desaparecido. Calentar la placa de TLC en un conjunto de bloque de calor a 160 ° C y Char al color deseado.
NOTA: Un programa de densitometría como Vision Works LS puede utilizarse para cuantificar las bandas carbonizados para comparar muestras de lípidos.
3. La infección de macrófagos con C. neoformans (H99)
- En una cabina de bioseguridad estéril, semilla de 10 células 5 macrófagos como por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos en 200 l de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% P / S. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2, 5% de CO 2 O / N.
NOTA: La infección también se puede hacer de fondo de cristal platos confocal para formación de imágenes más fácil; todas las cantidades siguen siendo los mismos. - Cultivar una cultura de C. neoformans (H99)mediante la inoculación de 10 ml de YNB con una colonia obtenida a partir de una placa golpeado e incubando que O / N a 30 ° C con agitación.
- Lave y contar C. neoformans células (H99).
- Centrífuga C. cultura neoformans O / N a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Retire el medio y desechar. Lavar las células con 5 ml de PBS 1x. Centrifugar a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Retirar PBS y se lava con 5 ml de PBS 1x filtrada. Centrifugar a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este paso 2 veces más.
- Retirar PBS y resuspender en 5 ml de PBS 1x.
- Hacer una dilución en serie en PBS para obtener una dilución 1: 500 de la cultura lavado.
- Añadir 100 l de la muestra original para 900 l de 1x PBS para obtener una dilución 1:10.
- Añadir 100 l de muestra diluida 1:10 a 900 l de 1x PBS para obtener una dilución 1: 100.
- Añadir 200 l de la 1: 100 muestra diluida a 800 l de PBS 1x para obtener un 1: diluti 500en
- Tomar 10 l de 1: 500 dilución y contar con hemocitómetro para calcular el número de células.
- Preparar la solución de trabajo para la activación de los macrófagos y opsonizantes C. neoformans.
- Diluir LPS y IFN 100x de soluciones madre añadiendo 10 l hasta 990 l.
NOTA: LPS y IFN se utilizan para mejorar la absorción fagocítica pero no son necesarios para la fagocitosis. Si hay un interés en la actividad fungicida de los macrófagos, realizar la activación O / N a 37 ° C con agitación antes de la infección. - Por muestra combinar 7,5 l de LPS diluidos, 1,25 l de IFN diluido, 1,25 l de anticuerpo GXM y el volumen de la C. cultura neoformans que da 1,25 x 10 5 células. Llevar el volumen hasta 250 l multiplicado por el número de muestras con DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% P / S.
- Vortex e incubar la solución durante 20 min a 37 ° C con agitación.
NOTA:Agotamiento de colesterol (pasos 1.2 hasta 1.4) se puede hacer simultáneamente con la etapa de opsonización. Asegúrese de tratar los macrófagos antes de la combinación de la solución de trabajo, ya que las células opsonizadas óptimamente se deben utilizar no más de 20 minutos después de la incubación paso 3.4.3.
- Diluir LPS y IFN 100x de soluciones madre añadiendo 10 l hasta 990 l.
- Infectar a los macrófagos
- Macrófagos Lavar dos veces con DMEM libre de suero y añadir 200 l de opsonizado C. neoformans solución de trabajo a cada pocillo.
- Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
- Fijar y teñir las células
- Retire el medio y lavar las células 2 veces con DMEM.
- Aire seco en la monocapa de células durante 10 min y añadir 200 l de metanol enfriado con hielo para fijar las células.
- Incubar durante 15 min a TA y eliminar cualquier metanol restante.
- Añadir 200 l de 10x Giemsa y se incuba durante 5 min a TA.
- Lave 2 - 3 veces con agua desionizada y se seca O / N con la gorra.
NOTA: Imaging se puede hacer al día siguiente o hasta una semana followitinción ng.
- Visualizar y Conde
- Usando un microscopio, contar 300 células por punto de datos (si hay 2 de el mismo trato contar 150 por pocillo) y anote el número de macrófagos infectados y el número de células Cryptococcus envueltos.
NOTA: Para garantizar incluso el muestreo por uso punto de datos 2 placas por condición, elija 3 áreas que no se solapan por placa y recuento de 50 células por área. - Calcular el índice fagocítico multiplicando el porcentaje de macrófagos infectados por el número medio de C. neoformans por macrófago. Normalizar índice fagocítico expresando los valores como porcentaje de la PBS 1x tratada control. Después de varios ensayos calcular el valor medio y la desviación estándar de la media para determinar las tendencias en el índice de fagocitosis. Utilice estudiante t-test para determinar la significación.
- Tome micrografías de células en 1.000X o ampliación de 400X.
- Usando un microscopio, contar 300 células por punto de datos (si hay 2 de el mismo trato contar 150 por pocillo) y anote el número de macrófagos infectados y el número de células Cryptococcus envueltos.
4. Ensayo de azul de tripano
- En una cabina de bioseguridad estéril, las semillas 10 6 células de tipo macrófago por pocillo en una placa de cultivo celular de 6 pocillos en un volumen de 5 ml de medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina / estreptomicina . Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N.
- Agotan los macrófagos de colesterol siguiendo los pasos 1.2 a 1.4 sustituyendo 2 ml para 200 l en su caso para tener en cuenta el tamaño bien grande.
NOTA: Asegúrese de incluir un control tratado con 1x PBS, así como un control que se raspa antes de cualquier tratamiento. - Añadir 500 l de 1x PBS a cada pocillo y raspar suavemente las células con un raspador de células. Traslado en un tubo de microcentrífuga y suspender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Retire 10 l de células y tinción con 1 l de 4% de azul de tripano.
- Contar las células en un hemocitómetro y la viabilidad calcular utilizando la siguiente ecuación:% de viabilidad = [1 - (células azules / células totales)]x 100. Normalizar los valores al control que no fue tratada. Después de varios ensayos calcular el valor medio y la desviación estándar para determinar las tendencias en la viabilidad. Utilice estudiante t-test para determinar la significación.
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Representative Results
El agotamiento Colesterol
Análisis del sobrenadante reservado en el paso 1.3 del protocolo, siguiendo las instrucciones del fabricante en el kit de ensayo de colesterol de Amplex Red produce una concentración elevada de colesterol en la muestra MβCD tratado en comparación con el control PBS 1x. Dependiendo del tipo de célula y el agotamiento de colesterol concentración MβCD utilizado puede variar. Para J774 tratados con 10 mM MβCD, se observó una disminución de aproximadamente el 50%. El agotamiento se puede calcular usando los valores obtenidos a partir del sobrenadante y lisado celular recogido en el paso 1.4 (Figura 1).
El lisado celular analizados mediante TLC muestra una marcada disminución en la tinción de colesterol en las células tratadas con una concentración creciente de MβCD (Figura 2A). Densitometría análisis del TLC muestra una tendencia similar al ensayo cuantitativo (Figura 2B). El método de Bligh-Dyer da una ext crudoract de lípidos totales y es esencial para permitir la separación adecuada de los lípidos con el fin de identificar la banda correcta utilizando el estándar de colesterol.
Infección
Después de seguir el procedimiento de infección, las células permanecen adheridas e intactas. La morfología celular se mantiene sin cambios entre los grupos de tratamiento. Un grupo de control que no ha sido expuesto a C. neoformans sirve como un punto de control (Figura 3). Es posible obtener resultados subóptimos y puede manifestarse como la lisis de las células y otras morfologías anormales. La causa más probable es la contaminación de la línea celular o de los reactivos utilizados en el procedimiento. Las micrografías de las células infectadas de forma óptima muestran claramente C. neoformans envuelto dentro de las células de mamíferos. Las diferencias en el número de levadura fagocitado pueden ser notados por la observación entre los grupos de tratamiento (Figura 4). Después de calcular el índice de fagocitosis de 300 células de macrófagos por grupo de tratamiento unareducción en el índice de fagocitosis se encuentra en colesterol empobrecido células (Figura 5). La reducción en el índice de fagocitosis no parece ser dependiente de las posibles diferencias en la activación de macrófagos, aunque pueden ocurrir. Realización de la infección en ausencia de activadores de macrófagos, pero después del tratamiento con resultados MCD en una reducción similar de índice fagocítico (datos no mostrados).
Azul de tripano
Tinción de azul de tripano se utiliza para evaluar la viabilidad de las células después de la depleción del colesterol. No se observa ningún cambio en la viabilidad entre tratados con PBS 10 mM y MCD células tratadas. Viabilidad parece dejar poco después del tratamiento con 30 mM MCD, que puede ser esperado debido a la disminución de aproximadamente 75% en el colesterol (un lípido esencial) observado en el análisis de densitometría (Figura 6 y la Figura 2B).
Figura 1. El contenido de colesterol de sobrenadante después del tratamiento. La cuantificación de colesterol en el sobrenadante recogido de las células tratadas muestra el enriquecimiento en MCD en comparación con 1x PBS. Agotamiento de colesterol es 50 ± 5% calculado a partir de colesterol total en PBS 1x (sobrenadante + lisado celular). Las barras de error muestran la desviación estándar (n = 5).
Figura 2. TLC de colesterol en lisado celular y densitometría. Imagen de la placa de TLC desarrollado visualizado con MnCl2 carbonización. Una marcada disminución en el colesterol se ve después del tratamiento MβCD (A). Análisis de densitometría de las bandas en comparación con el de control tratados con PBS (mostrado como 100%) confirma tendencia encontrada en el ensayo de cuantificación del colesterol (B Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. micrografías de control no infectadas de macrófagos J774 tratados. Imágenes de células J774 no infectadas tomadas con una ampliación de 200X. La barra de escala es de 50 micras. 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B), y 30 mM MβCD (C) células tratadas no muestran cambios. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La infección de macrófagos J774 conSe muestran ampliación C. neoformans Imágenes de células J774 infectadas tomadas a 400X (fila superior A.1 - - C.1). Y 1.000 x (C.2 fila inferior A.2). Internalizada C. neoformans células aparecen como esferas azul-violeta con un anillo más ligero que los rodea. Las células tratadas con 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B), y 30 mM MβCD (C) muestran diferencias en C. neoformans de absorción. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. fagocítica índice. El índice de fagocitosis se muestra con respecto al grupo de control que se trató con PBS (marcado en 100 para la comparación). El índice de fagocitosis se redujo en un 25% en 10mM MβCD tratamiento y en casi un 55% por tratamiento de 30 mM. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media (n = 4).
Figura 6. La viabilidad celular. Las variaciones en la viabilidad celular mediante el ensayo de azul de tripano muestran poca variación al comparar los tres grupos de tratamiento. Hay una ligera caída en la viabilidad en el grupo de tratamiento 30 mM MβCD, que se puede esperar de agotamiento de un componente tan importante de la membrana. Las barras de error muestran la desviación estándar (n = 4).
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Discussion
En el trabajo con este protocolo es importante para obtener recuentos de células precisos cuando chapado en células de mamíferos y opsonizantes C. células neoformans. Esto minimiza la variación entre los ensayos y asegura una precisa 1: 1 de destino para la proporción de efector durante todo el estudio. También es fundamental para coordinar la temporización de la depleción de colesterol y para prevenir la infección las células de levadura o células opsonizadas macrófagos tratados de reposo a temperatura ambiente entre los procedimientos. Largos períodos de espera podrían conducir a la pérdida de Opsonización o la reposición de colesterol agotada antes de iniciar la infección. Si los experimentos se hacen con precisión el análisis de datos permite conclusiones a discernir sobre el papel del colesterol en la fagocitosis.
Las limitaciones de la técnica impiden conclusiones sobre el mecanismo específico por el cual el agotamiento de colesterol disminuye el índice de fagocitosis de los macrófagos como las células, y no está claro si el effect es directamente debido al colesterol o debido a un mecanismo secundario. Además de trabajo a lo largo de esta línea investiga otros constituyentes de las balsas de lípidos, tales como esfingolípidos o proteínas conocidas para funcionar en la fagocitosis tales como el receptor Fc gamma y el receptor del complemento 3 2. La modificación de esta técnica para usar el anticuerpo o complementar la opsonización por sí sola podría ayudar a distinguir un papel para colesterol en una o ambas de estas vías conocidas. También es importante recordar que MβCD extrae el colesterol en base a su hidrofobicidad y tamaño, por lo que los esteroles de un tamaño similar también se pueden agotar y migrarán a una tasa similar a la del colesterol en un TLC. También es importante tener en cuenta que el agotamiento de colesterol pueden afectar parcialmente la activación de macrófagos, esto es poco probable que sea responsable de la diferencia observada en la absorción como la realización de la infección en ausencia de IFN-y LPS muestra la misma reducción en la absorción de C. neoformans (datos no mostrados), but es de interés cuando se modifica esta técnica para estudiar las actividades antifúngicas de los macrófagos y el papel de la activación. Este método también no nos permite discernir si el agotamiento de colesterol tiene ningún implicaciones terapéuticas en la infección por hongos. Además trabajo en vivo con fármacos reductores del colesterol y estudios epidemiológicos de los pacientes que utilizan medicamentos para reducir el colesterol podría dilucidar el papel de agotamiento de colesterol en el tratamiento de la enfermedad y puede ofrecer una manera más selectiva para inhibir la acumulación de colesterol.
Este procedimiento puede ser fácilmente utilizado para estudiar la captación de otros patógenos o partículas sólidas (es decir, perlas de vidrio) siendo fagocitadas y permiten el estudio de la biología básica de la fagocitosis. Las modificaciones podrían permitir para el estudio de otros aspectos de la fagocitosis por tratamiento de las células de macrófagos con las enzimas para degradar selectivamente otros componentes de la membrana o varios fármacos e inhibidores que pueden ser de interest. También hay que señalar que la citometría de flujo puede presentar una forma más precisa y cuantitativa para caracterizar la fagocitosis y podría ser utilizado para reemplazar el conteo microscópico directo 24. En total, esta es una técnica bastante simple que se puede utilizar como punto de partida para más estudios en profundidad que responder a las preguntas acerca de cómo lípidos pueden desempeñar un papel importante en la infección y la respuesta inmune.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas del NIH AI56168, AI71142, AI87541 y AI100631 de MDP. Maurizio Del Poeta es Burroughs Wellcome Investigador en Enfermedades Infecciosas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations |
| Orbital shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S meaures down to 0.1 mg | |
| Glass Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass bottom confocal dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
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