Abstract
隐球菌是一种威胁生命的感染引起的属隐球菌的致病性真菌。发生感染时吸入孢子，这是能够在肺部深处复制的。 隐球菌的巨噬细胞吞噬是，该疾病是能够传播到中枢神经系统以引起致死性脑膜脑炎的方法之一。因此， 隐球菌和巨噬细胞之间的关联的研究是非常重要的，以了解感染的进展。本研究描述了一个一步一步的协议，由C.研究巨噬细胞感染隐球菌体外 。使用该协议，主机固醇对宿主 - 病原体相互作用的作用进行了研究。不同浓度的甲基 - 环糊精（MCD）用于消耗来自鼠网肉瘤巨噬细胞样细胞系J774A.1胆固醇。胆固醇耗竭进行确认和定量同时使用市售availablË胆固醇定量试剂盒和薄层色谱法。用脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFNγ）胆固醇耗竭细胞被激活，并感染抗体调理隐球菌野生型H99细胞以1的效应-目标：1的比例。 2小时温育与C之后感染的细胞进行了监测新型隐球菌及吞噬指数计算。胆固醇耗竭导致一显著降低的吞噬指数。所提出的协议，提供了一个方便的方法，以模仿感染过程的开始在实验室环境中，研究宿主脂质组合物对感染性的作用。
Introduction
吞噬作用是由细胞外的实体是由宿主细胞内化的过程。它是在免疫系统中的武器库，以对抗病原体保卫一个关键武器，但该过程可以经常由病原体被颠覆，以允许内化和整个主体1传播。吞噬作用是由导致通过宿主细胞的细胞骨架的重排附着和吞噬几个信号传导事件介导的。职业“吞噬细胞能够识别和结合调理素的入侵病原体的表面上的信号用于附着和形成片状伪足的，其吞噬的病原体，并形成吞噬体2。其中所谓的'专业'吞噬细胞巨噬细胞是。巨噬细胞是高度特化的细胞即进行保护的功能包括寻找和消除致病剂，修复受损的组织，并介导的炎症，大多数的这些通过吞噬1,2的过程。
新生隐球菌是一个物种致病酵母导致称为隐球菌一个严重的疾病。 隐球菌孢子由主机吸入并导致肺部感染，通常是无症状的。据认为，曝光是极为普遍;对61名儿童从儿科传染病诊所在布朗克斯-黎巴嫩医院中心发现，所有的受访者有抗体的隐球菌多糖glucuronoxylomannan和其他研究的样本表明患病率在人类免疫缺陷病毒（HIV）感染和感染的成人3， 4。肺泡巨噬细胞是响应于肺部感染，并且在大多数情况下，成功地明确病原体的第一道防线。然而，在免疫受损的个体（ 例如，HIV和AIDS患者）的酵母是能够在巨噬细胞内生存。在这些的情况下，巨噬细胞可以作为利基病原体的复制，并且可以促进其传 播到中枢神经系统（CNS），其中该疾病成为致命5 - 8。据认为，巨噬细胞可能甚至直接传递到酵母脑膜，帮助酵母通过“木马”的模式3,9穿过血脑屏障- 11。因此，为了理解吞噬的过程和影响它，特别是在隐球菌感染的因素是很重要的。
以前的工作在其它病原体系统指向由胆固醇作为具有重要作用，吞噬12发挥形成胆固醇和脂质筏- 15。胆固醇是最丰富的脂类物质在哺乳动物细胞中，并包括25 -哺乳动物细胞膜16的50％。已经发现，以在调节BIOP发挥作用膜通过改变其刚性物质环境的17性质。胆固醇和鞘脂在一起形成被称为脂筏在膜中的脂质微区。脂筏已经发现涉及在地层中的小窝，以及提供一个分离的结构域对某些类型的信号16 - 18。由于它们的尺寸小，它是很难研究脂质筏体内 。研究脂筏的作用的一个有用的方法是改变他们的选民。甲基β环糊精（MβCD）是已被发现从哺乳动物细胞膜耗尽胆固醇，通常用于研究脂质筏18的作用的化合物。
在这个协议中，我们提出了一个方法，以消耗从宿主细胞膜胆固醇并量化对宿主细胞的吞噬C的能力的耗尽的效果隐球菌体外 。此过程使用了细胞培养techniqUE的像细胞（J774A.1）作为模型感染的巨噬细胞的永生。胆固醇耗竭被完成通过暴露于MβCD，其具有特定的甾醇的尺寸的疏水性芯，并且能够充当胆固醇绘制出来的膜19的一个接收器。定量用市售试剂盒和定性使用改良的Bligh-Dyer的脂质提取，随后用薄层色谱法（TLC）20胆固醇耗竭进行测定。 23 -吞噬被感染与调理的酵母与干扰素γ和脂多糖的鸡尾酒激活巨噬细胞混合培养的细胞系测量隐球菌是使用glucuronoxylomannan（GXM）抗体21调理。染色和显微镜实验允许的细胞可视化和吞噬指数的计算，以评估细胞吞噬的程度。综上所述，该协议ðescribes集成脂质组合物具有的生理过程的改变的基本方法。
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Protocol
J774A.1细胞MβCD1.胆固醇消耗
- 在无菌生物安全柜，种子10 5 J774A.1巨噬细胞样细胞每孔在96孔细胞培养板中加入200μlDulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM）中的补充有10％胎牛血清（FBS）和1％的青霉素/链霉素（P / S）。在37℃和5％CO 2的O / N。
- 从细胞单层除去介质并用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中已被过滤或高压灭菌洗细胞两次。
- 加入200微升MβCD溶液在所需浓度（10毫米或30毫米的PBS）或1x PBS作为对照，孵育30分钟，在37℃振荡。与市售试剂盒中取出上清液和储备在室温进行定量分析，立即过程如下。
- 用1×PBS或无血清DMEM洗涤细胞两到三倍，并继续与感染或裂解细胞通过pipetti纳克的两到三倍，用去离子H 2 O代表的分析用薄层色谱或用的试剂盒。
注：按照胆固醇耗竭市售胆固醇定量试剂盒可以使用。详情请参阅材料部分。按照制造商的说明进行写入。
2.观察胆固醇含量薄层色谱（TLC）
- （体积比1 65：30），用石油醚中的溶液洗TLC罐两次用丙酮和一次：：乙醚乙酸。饱和罐用石油醚：乙醚：乙酸（65：30：1，体积比）溶液并离开O / N。
注：有机溶剂应始终在通风橱中使用，防止吸入蒸汽。手套和白大褂应该在任何时候都可以穿。乙酸是一种强酸，应谨慎使用。 - 在无菌生物安全柜，种子10 6 J774A.1巨噬细胞样，每孔的细胞在6孔策LL培养板在5毫升温暖的DMEM补充有10％FBS和1％P / S的体积。孵育在37℃，5％的CO 2 O / N。
- 1.4，200微升，其中适用于占较大以及大小代1毫升 - 通过以下步骤1.2耗尽胆固醇的巨噬细胞。
- 加入500μl胰蛋白酶EDTA至各孔中，孵育3分钟，在37℃，轻轻刮去细胞用细胞刮刀破碎。
- 转移到一个离心管中，并添加另外500微升温暖的DMEM补充有10％FBS和1％P / S的。
- 旋转细胞5分钟，在300×g离心并去除上清。
- 增加一个额外的500微升温暖的DMEM补充有10％FBS和1％P / S的细胞沉淀，并通过上下抽吸小心重悬。
- 去除10微升细胞，并在血细胞计数器计数细胞。正常化从每个样品中的细胞浓度和添加相等数目细胞的玻璃管。
注：在这一步骤中，可以选择组合的细胞来自相同的治疗组，以获得更集中的最终脂质提取物。 - 离心机细胞在300 XG 5分钟在室温和删除介质。
- 加入2毫升的甲醇和漩涡。然后，加入1毫升氯仿并涡旋。检查相状态，以确保在单相的解决方案。
注：管可存放在4°CO / N。 - 离心在1700 xg离心在RT 10分钟，将上清转移到新的管
- 添加额外的1毫升氯仿接着1毫升卫生署2 O的涡旋两次30秒。离心在1700×g离心5分钟，在室温。
- 权衡上的敏感平衡的玻璃管，并使用玻璃巴斯德吸管向下层相转移到已知重量的玻璃管中。
- 干倒在离心蒸发器脂类至干（约2小时）。称取管干血脂，并计算干脂肪重量。
注：干脂质可以储存在-20℃，直至准备好执行TLC。 - 稀干燥脂类在足够氯仿正常化脂质的浓度（通常为20 - 50微升）和负载20微升在硅胶TLC板上稀释的脂质。负载20胆固醇稀释在20μl的氯仿作为标准的微克。
- 加入干薄层板上，以饱和TLC坦克，并允许溶剂可达1厘米迁移板边之前。从罐中取出TLC板，并让其干燥约5分钟。
- 通过放置在碘蒸气罐，检查移民可视化脂类。删除并允许斑点褪色约10 - 引擎盖下15分钟。
注：碘是吸入危害。在通风橱中始终使用。 - 通过组合60mL甲醇用60ml去离子H 2 O为4毫升硫酸，和630毫克的氯化锰制备用于中性脂质染色的溶液。
- 小心缓慢地浸TLC板变成一个托盘中的中性脂肪染色解决方案，并删除不塌掉二氧化硅升艾尔。
注：中性脂质染色溶液可以重复使用好几次，因此它可以从托盘进行检索和放回瓶供以后使用。 - 允许板引擎盖下干在室温，直到所有的泡沫已经消失了。加热TLC板上加热块设定为160℃和焦炭到所需的颜色。
注：光密度测定程序，如视觉作品LS可以用来量化烧焦频带进行比较的脂质样品。
3.感染C.巨噬细胞新型隐球菌 （H99）
- 在无菌生物安全柜，每孔在96孔细胞培养板在200μlDMEM中的种子10 5巨噬细胞样细胞在补充有10％FBS和1％P / S。孵育在37℃，5％CO 2，5％的CO 2 O / N。
注：感染，也可在玻璃完成有底为了便于成像的共焦碟子;所有金额保持不变。 - C.成长的文化新型隐球菌 （H99）接种10毫升YNB与从击打板获得的一个菌落，并与摇动孵育它O / N在30℃。
- 洗和计数C.新型隐球菌 （H99）细胞。
- 离心机C.新型隐球菌 O / N培养在1700 XG为4℃10分钟。
- 取出介质并丢弃。用5ml的1×PBS洗细胞。离心机在1700×g离心在4℃下10分钟。
- 除去PBS中，洗涤用5ml过滤的1×PBS。离心机在1700×g离心在4℃下10分钟。重复此步骤2次以上。
- 除去PBS，重悬在5毫升1X PBS的。
- 使在PBS中系列稀释，得到1：500稀释洗涤培养物。
- 添加100微升原始样品至900微升的1×PBS，得到1:10稀释。
- 加入100微升1时10稀释样品至900微升1×PBS中，得到1：100的稀释。
- 加入200微升1：100稀释的样品到800微升1×PBS中，得到1：500 diluti上
- 取10微升的1:500稀释并指望血球计算细胞的数目。
- 准备工作液激活巨噬细胞和opsonizing C.新型隐球菌。
- 加入10微升至990微升稀释LPS和IFNγ100倍的股票解决方案。
注：LPS和IFNγ用于增强巨噬细胞吞噬，但不是必须为吞噬作用。如果有兴趣的巨噬细胞的杀真菌活性，执行激活O / N在37℃下与在感染前晃动。 - 每个样品结合7.5微升稀释毒素，1.25微升稀释IFNγ，1.25微升GXM抗体和C的量隐球菌培养，让1.25×10 5个细胞。带体积达到250微升乘以用DMEM样品补充有10％FBS和1％P / S的数量。
- 涡旋孵育溶液中20分钟，在37℃振荡。
注意：胆固醇耗竭（步骤1.2 - 1.4）可以同时与调理步骤来完成。一定要善待之前，结合工作液的巨噬细胞，作为调理细胞应优化使用时间不超过20分钟以下步骤3.4.3孵化。
- 加入10微升至990微升稀释LPS和IFNγ100倍的股票解决方案。
- 巨噬细胞感染
- 巨噬细胞洗两次无血清DMEM，并添加200微升调理的C.隐球菌工作液到每个孔中。
- 孵育2小时，在37℃。
- 修复和细胞染色
- 删除媒体和DMEM洗涤细胞2次。
- 空气干燥该细胞单层10分钟，并加入200微升冰冷的甲醇中以固定细胞。
- 孵育15分钟，在RT和除去任何剩余的甲醇。
- 加入200微升10×吉姆萨孵育5分钟，在室温。
- 用去离子水和干O / N 3次盖帽关 - 洗2。
注：成像可以做到第二天或最多一周followi吴染色。
- 可视化和计数
- 使用显微镜，计数每个数据点300细胞（如果有相同的治疗2计数150每孔），并注意感染的巨噬细胞的吞噬隐球菌细胞的数目和次数。
注：为了确保甚至每个条件采样每个数据点使用2片，选3每盘不重叠的区域和计数单位面积50个细胞。 - 通过C的平均数乘以受感染的巨噬细胞的百分比计算吞噬指数每巨噬细胞隐球菌 。通过表达值作为1×PBS中的百分比处理的对照正常化吞噬指数。经过多次试验计算平均值和平均值的标准偏差，以确定在吞噬指数趋势。使用学生t检验，以确定显着性。
- 就拿细胞的显微照片在1,000倍或400倍的放大倍率。
- 使用显微镜，计数每个数据点300细胞（如果有相同的治疗2计数150每孔），并注意感染的巨噬细胞的吞噬隐球菌细胞的数目和次数。
4.台盼蓝测定
- 在无菌生物安全柜，种子10 6巨噬细胞样细胞，每孔在6孔细胞培养板中的体积5mL的Dulbecco补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素最小基本培养基（DMEM）中的。孵育在37℃，5％的CO 2 O / N。
- 1.4为200μl的在适用于占较大以及大小代2毫升 - 通过以下步骤1.2耗尽胆固醇的巨噬细胞。
注：一定要包括与1X PBS以及之前的任何处理被刮掉控制处理的对照。 - 加入500微升的1×PBS的每个孔中，轻轻刮去细胞用细胞刮刀破碎。转移到一个离心管中，并轻轻吹打上下悬浮细胞。
- 去除10微升细胞和染色用1微升4％台盼蓝。
- 计数细胞在血细胞计数器，并使用以下等式计算存活率：％存活率= [1 - （蓝色细胞/总细胞）]×100标准化值，这是未经处理的控制。经过多次试验计算的平均值和标准偏差，以确定在存活力的趋势。使用学生t检验，以确定显着性。
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Representative Results
胆固醇消耗
相比于1×PBS对照由以下中的Amplex红胆固醇测定试剂盒制造商的说明在协议的步骤1.3保留上清液的分析产生一个升高的浓度的胆固醇在MβCD处理过的样品。取决于细胞类型和MβCD浓度使用胆固醇耗竭可能会发生变化。对于J774用10mMMβCD处理后，观察到大约50％的损耗。耗尽可以使用从收集在步骤1.4（ 图1）的上清液和细胞裂解物获得的值来计算。
用TLC分析细胞裂解物示于胆固醇染色的显着降低与增加MβCD（ 图2A）的浓度处理的细胞。薄层的光密度分析显示出类似的趋势，以定量测定（ 图2B）。在布莱 - 代尔方法给出粗转总脂质RACT，因此有必要以允许脂质，以识别利用胆固醇标准的正确频带充分分开。
感染
以下感染步骤后，将细胞保持粘附和完好。细胞形态保持治疗组之间不变。尚未暴露于℃。对照组新型隐球菌作为一个检查点（ 图3）。所以能够得到不理想的结果，并可能表现为细胞和其他异常形态的裂解。最可能的原因是，在过程中使用的细胞系或试剂的污染。最佳地感染细胞的显微照片清楚地显示C.新型隐球菌的哺乳动物细胞内吞噬。在吞噬的酵母的数量的差异可以注意到通过治疗组之间观察（ 图4）。计算吞噬指数从每个治疗组300巨噬细胞后，减少吞噬指数在胆固醇耗竭细胞（ 图5）中找到。在吞噬指数的减少似乎不依赖于巨噬细胞活化的潜在差异，尽管它们可能会发生。在进行感染在没有巨噬细胞活化剂，但与MCD的结果的类似减少吞噬指数的处理之后（数据未显示）。
台盼蓝
台盼蓝染色用于胆固醇耗竭后，以评估细胞的生存力。在生存能力没有变化观察之间PBS治疗，10毫MCD处理的细胞。生存能力似乎处理之后稍微降低了与30毫MCD，这可能是由于预期中的胆固醇的约75％的消耗（一种必需的脂质）的光密度分析（ 图6和图2B）观察到。
上清液后治疗。胆固醇在从处理过的细胞中收集的上清液定量图1.胆固醇含量示富集MCD相比1倍PBS中。胆固醇耗竭是在1×PBS中（上清液+细胞裂解物）的总胆固醇计算50±5％。误差条显示标准偏差（n = 5）。
图2. TLC胆固醇在细胞裂解液和密度。开发薄层板上，以可视化的MnCl 2炭化的图像。胆固醇显着下降MβCD处理（A）后看到。频带相比，PBS处理的对照（显示为100％）的光密度分析证实趋势中的胆固醇的定量测定发现（ 乙 请点击此处查看该图的放大版本。
图J774处理的巨噬细胞3.未感染控制的显微照片。在200X的放大倍率拍摄未受感染的细胞J774的图像。比例尺为50微米。 1X PBS（A），10毫米MβCD（B），30毫米MβCD（C）处理的细胞显示没有变化。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. J774感染的巨噬细胞隐球菌在400X采取感染J774细胞图像（上排A.1 - C.1）和1,000倍（下排A.2 - C.2）放大倍率显示。内化C.新型隐球菌细胞出现蓝紫色球体与他们周围打火机环。与1X PBS（A），10毫米MβCD（B），30毫米MβCD（C）的C.显示差异处理的细胞新型隐球菌摄取。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.吞噬指数。吞噬指数示出相对于该用PBS处理的对照组（标记为100用于比较）。吞噬指数减少了25％，由10毫米MβCD处理和近55％的30 mM的治疗。误差棒显示平均值的标准偏差（n = 4）。
图6.细胞活力，细胞存活率变化由台盼蓝实验表明几乎没有变化比较所有三个治疗组的时候。有在生存能力轻微掉落的30mMMβCD治疗组，它可以从该膜的这种主要组分的耗尽可以预期在。误差条显示标准偏差（n = 4）。
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Discussion
在这个协议的工作是电镀时哺乳动物细胞和opsonizing C.获得准确的细胞计数是非常重要的新型隐球菌细胞。该试验间差异最小化，并保证准确的1：整个研究1目标效应比。这也是至关重要的协调胆固醇枯竭和感染的时间，以防止调理的酵母细胞或巨噬细胞处理细胞在RT中的过程之间的休息。漫长的等待时间可能会导致损失抗体的调理作用或贫胆固醇补给之前感染就可以开始。如果实验精度进行数据分析允许结论可以看出端倪关于胆固醇的吞噬作用。
该技术的局限性防止任何结论，由胆固醇消耗降低了巨噬细胞样细胞的吞噬指数的具体机制，目前还不清楚是否有EFFECT是直接由于胆固醇或由于二次机制。沿着这一思路的进一步调查工作脂筏的其他成分 如吞噬已知函数鞘脂类或蛋白质，如Fcγ受体和补体受体3 2。修改这项技术为使用抗体的调理作用或单独补充可以帮助区分的作用胆固醇在一种这些已知的途径或两者。同样重要的是要记住，MβCD提取基于其疏水性和尺寸，由此一类似大小的甾醇也可被耗尽，将迁移以相似的速率为胆固醇在TLC胆固醇。同样重要的是要注意，胆固醇耗竭可部分影响巨噬细胞活化，这是不太可能负责在摄取观察到在没有IFN-和脂多糖进行感染的差值显示了相同的减少C的摄取新型隐球菌 （数据未示出），卜吨它是感兴趣修改这种技术时，研究巨噬细胞的抗真菌活性和活化的作用。这种方法也不允许我们辨别胆固醇枯竭是否有真菌感染任何治疗意义。 在体内与降胆固醇药物和使用的降胆固醇药物可以进一步阐明用于在疾病的治疗中胆固醇耗竭作用并且可以提供一个更具选择性的方法来抑制胆固醇积累的病人的流行病学研究的进一步工作。
这个程序可以很容易地用于研究其他病原体或固体颗粒的吸收（ 即玻璃珠）被吞噬，并允许吞噬的基础生物学的研究。修改可以允许对吞噬的其他方面的研究通过用酶处理的巨噬细胞，以选择性地降解其它膜部件或各种药物和抑制剂可以是帧间的EST。还应当注意的是，流式细胞仪可以呈现一个更精确和定量的方式来表征吞噬作用和可以用来代替直接显微计数24。总之，这是一个相当简单的技术，可以在深入研究该回答关于如何脂类可能在感染和免疫反应的一个重要部分的问题作为出发点以上。
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Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院资助AI56168，AI71142，AI87541和AI100631到MDP支持。莫里吉奥德尔Poeta的是宝来惠康研究员在传染病。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations |
| Orbital shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S meaures down to 0.1 mg | |
| Glass Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass bottom confocal dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
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