Abstract
Cryptococcosis ist eine lebensbedrohende Infektion, die von pathogenen Pilzen der Gattung Cryptococcus verursacht. Die Infektion erfolgt beim Einatmen von Sporen, die in der Lage, in die tiefe Lunge replizieren. Phagozytose von Cryptococcus durch Makrophagen ist eine der Möglichkeiten, dass die Krankheit in der Lage, in das zentrale Nervensystem verteilt, um letale Meningoenzephalitis führen. Daher ist die Lehre der Assoziation zwischen Cryptococcus und Makrophagen wichtig für das Verständnis des Fortschreitens der Infektion. Die vorliegende Studie beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll, um Makrophagen-Infektiosität von C. studieren neoformans in vitro. Mit diesem Protokoll wird die Rolle des Gastgebers Sterole auf Wirt-Pathogen-Interaktionen untersucht. Verschiedene Konzentrationen von Methyl - Cyclodextrin (MCD) wurden verwendet, um Cholesterin aus murinen Retikulum Sarkom Makrophagen-ähnlichen Zellinie J774A.1 abzureichern. Cholesterinabbau bestätigt und quantifiziert unter Verwendung sowohl einer handels verfügbe Cholesterinquantifizierung Kit und Dünnschicht-Chromatographie. Cholesterin verarmte Zellen wurden unter Verwendung Lipopolysacharide (LPS) und Interferon gamma (IFN & gamma;) aktiviert und mit Antikörper-opsonisiertes Cryptococcus neoformans Wildtyp H99 Zellen bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 1 infiziert: 1. Infizierte Zellen wurden nach 2 h Inkubation mit C. wachten neoformans und ihre phagozytische Index wurde berechnet. Cholesterinabbau führte zu einer signifikanten Reduktion der phagozytische Index. Die vorgestellten Protokolle bieten eine bequeme Methode, um die Einleitung des Infektionsprozesses in einer Laborumgebung nachzuahmen und Studium der Rolle von Wirtslipidzusammensetzung auf die Infektiosität.
Introduction
Phagozytose ist ein Prozess, durch den extrazellulären Instanzen durch Wirtszellen internalisiert. Es ist eine wichtige Waffe im Arsenal des Immunsystems, gegen Krankheitserreger zu verteidigen, aber der Prozess kann oft von Krankheitserregern unterlaufen werden, um für die Internalisierung und Verbreitung im ganzen Körper 1 zu ermöglichen. Die Phagozytose wird durch mehrere Signalwege, die im Anhang und Einwirkung über Umlagerungen von Zytoskelett der Wirtszelle führen vermittelt. Professional "Phagocyten können sich auf der Oberfläche des eindringenden Pathogens erkennen und binden an Opsonine zur Anbringung und die Bildung der Lamellipodia, die den Krankheitserreger zu verschlingen und bilden eine phagosome 2 zu signalisieren. Unter den so genannten "professionellen" Fresszellen sind Makrophagen. Makrophagen sind hoch spezialisierte Zellen, die durchführen, Schutzfunktionen, die die Suche nach und Beseitigung von Krankheitserregern, die Reparatur beschädigter Gewebe und Vermittlung Entzündung, die meisten schließendiese durch den Vorgang der Phagozytose 1,2.
Cryptococcus neoformans ist eine Art von pathogenen Hefe, die eine schwere Krankheit wie Kryptokokkose bekannt verursacht. Cryptococcus Sporen werden durch den Host Einatmen und führen zu einer Lungeninfektion, die in der Regel asymptomatisch ist. Es wird vermutet, dass die Exposition ist extrem weit verbreitet; eine Stichprobe von 61 Kindern aus den Pediatric Infectious Diseases Clinic am Bronx-Lebanon Hospital Center stellte fest, dass alle Befragten hatten Antikörper gegen das Cryptococcus Polysaccharid glucuronoxylomannan und andere Studien haben Prävalenz sowohl in humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten und infizierten Erwachsenen 3 gezeigt, 4. Alveolarmakrophagen sind in der ersten Zeile als Reaktion auf die Lungeninfektion und in den meisten Fällen erfolgreich klare Erregers. , Bei immungeschwächten Personen (zB HIV und AIDS-Patienten), die Hefe jedoch in der Lage, innerhalb der Makrophagen zu überleben. In diesenFällen können die Makrophagen als Nischen für die Replikation des Pathogens dienen und ihrer Weitergabe an das zentrale Nervensystem (ZNS), wobei die Krankheit tödlich 5 erleichtern - 8. Es wird vermutet, dass Makrophagen sogar die Hefe liefern direkt in die Hirnhäute und hilft, die Hefe, um die Blut-Hirnschranke über die "Trojanisches Pferd" Modell 3,9 überqueren - 11. Somit ist es wichtig, den Prozess der Phagozytose und die Faktoren, die es beeinflussen, insbesondere in Kryptokokkeninfektionen verstehen.
Frühere Arbeiten in anderen Erreger-Systeme weisen auf Cholesterin und Lipid Rafts von Cholesterin eine wichtige Rolle bei der Phagozytose 12 spielen gebildet - 15. Cholesterin ist die am häufigsten vorkommende Lipidspezies in Säugetierzellen und umfasst 25 - 50% der Säugerzelle Membran 16. Es wurde festgestellt, um eine Rolle bei der Modulation der BioP spielenhysical Eigenschaften von Membranen durch Veränderung ihrer Steifigkeit 17. Cholesterin und Sphingolipiden bilden Lipidmikrodomänen innerhalb der Membran als Lipid Rafts bekannt. Lipidflößen gefunden worden, um die Bildung von Caveolae, sowie Bereitstellen einer isolierten Domäne für bestimmte Typen von Signalisierungs 16 beteiligt - 18. Aufgrund ihrer geringen Größe, ist es schwierig, Lipidflößen in vivo zu studieren. Ein nützlicher Weg, um die Rolle von Lipidflößen zu untersuchen ist, um ihre Bestandteile zu verändern. Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) ist eine Verbindung, die gefunden wurde, um Cholesterin aus Säugetiermembranen führen und wird häufig verwendet, um die Rolle von Lipidflößen 18 zu studieren.
In diesem Protokoll wird eine Methode, um Cholesterin aus Wirtszellmembranen abzureichern und Quantifizierung der Wirkung der Abreicherung von der Fähigkeit der Wirtszellen, um C. phagozytieren neoformans in vitro. Dieses Verfahren macht Gebrauch von Zellkultur techniques auf einer immortalisierten Makrophagen-Zelllinie (J774A.1) als Modell für die Infektion. Cholesterinabbau durch Einwirkung MßCD, die einen hydrophoben Kern spezifisch an die Größe von Sterolen hat und in der Lage ist, um als Senke für Cholesterin, um es aus der Membran 19 zu ziehen handeln bewerkstelligt. Cholesterinabbau wurde quantitativ unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits und qualitativ mit einer modifizierten Bligh-Dyer Lipidextraktion, gefolgt von Dünnschichtchromatographie (TLC) 20 gemessen. . 23 - Phagozytose wurde durch Infizieren der Zelllinie mit einer Kultur der opsonisierten Hefe mit einem Cocktail von Interferon-γ und Lipopolysaccharid zur Aktivierung der Makrophagen gemischt gemessen Cryptococcus wurde mit einem glucuronoxylomannan (GXM) Antikörper 21 opsonisierten. Färbung und Mikroskopie Experimente zur Sichtbarmachung der Zellen und zur Berechnung der phagozytische Index erlaubt, den Grad der Phagozytose zu beurteilen. Zusammengenommen dieses Protokoll describes eine grundlegende Methode, die die Veränderung der Lipid-Zusammensetzung mit einem physiologischen Prozess integriert.
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Protocol
1. Cholesterin Depletion von J774A.1 Zellen mit MßCD
- In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 5 J774A.1-Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Well auf einer 96-well-Zellkulturplatte in 200 ul Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S). Bei 37 ° C und 5% CO & sub2; O / N.
- Medium entfernt von der Zellmonoschicht und die Zellen werden zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die gefiltert und autoklavierbar ist.
- Fügen Sie 200 ul MßCD Lösung in der gewünschten Konzentration (10 mM oder 30 mM in PBS) oder 1x PBS als Kontrolle und Inkubation für 30 min bei 37 ° C unter Schütteln. Überstand entfernen und Reserve bei RT für die quantitative Analyse mit im Handel erhältlichen Kits unmittelbar nach dem Eingriff.
- Mit 1x PBS oder serumfreiem DMEM Waschen Sie die Zellen zwei bis drei Mal und fahren Sie mit Infektion oder Lyse von Zellen pipetting zwei bis drei Mal mit deionisiertem H 2 O für die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie oder mit einem Kit.
HINWEIS: Nach Cholesterinabbau ein kommerziell erhält Cholesterin Quantifizierung Kit kann verwendet werden. Siehe Materialien Abschnitt. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers geschrieben.
2. Beobachtung von Cholesterin Inhalt von Dünnschicht-Chromatographie (TLC)
- Zweimal mit Aceton und einmal zu waschen eine TLC-Tank mit einer Lösung von Petrolether: Diethylether: Essigsäure (65: 30: 1 nach Volumen). Sättigen den Tank mit dem Petrolether: Diethylether: Essigsäure (65: 30: 1 nach Volumen) Lösung und lassen O / N.
HINWEIS: Organische Lösemittel sollten immer unter einer Abzugshaube verwendet werden, um das Einatmen von Dämpfen zu verhindern. Handschuhe und Labormantel müssen immer getragen werden. Essigsäure ist eine starke Säure und sollte mit Vorsicht verwendet werden. - In einer sterilen Biosicherheitswerkbank, Samen 10 6 J774A.1 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Vertiefung auf einer 6-Well-cell Kulturplatte in einem Volumen von 5 ml warmem DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt. Bei 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
- Abbau Makrophagen von Cholesterin durch folgende Schritte 1,2 bis 1,4, und ersetzen Sie 1 ml für 200 & mgr; gegebenenfalls für die größeren und Größe zu berücksichtigen.
- Fügen Sie 500 ul Trypsin-EDTA in jedes Loch, Inkubation für 3 min bei 37 ° C, und sanft kratzen Zellen mit einem Zellschaber.
- Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und zusätzlich 500 ul warmem DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt.
- Drehen Sie die Zellen für 5 min bei 300 g und Überstand.
- Fügen Sie eine zusätzliche 500 ul warmes DMEM mit 10% FBS und 1% P / S zu dem Zellpellet ergänzt und sorgfältig resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren.
- Entfernen Sie 10 ul der Zellen und zählen Zellen auf einem Hämozytometer. Normalisieren die Zellkonzentrationen von jeder Probe, und fügen Sie die gleiche Anzahl von Zellen auf Glasröhren.
HINWEIS: Bei diesem Schritt ist, kann manwählen, um Zellen, die aus den gleichen Behandlungsgruppen zu kombinieren, um eine stärker konzentrierte endgültige Lipidextrakt zu erhalten. - Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei RT inkubiert und das Medium entfernt.
- 2 ml Methanol und Wirbel. Dann fügen Sie 1 ml Chloroform und Wirbel. Überprüfen Sie die Phasenlage um sicherzustellen, dass die Lösung in einphasigen machen.
HINWEIS: Die Schläuche können bei 4 ° CO / N gespeichert werden. - Zentrifuge bei 1.700 xg für 10 min bei RT und den Überstand in ein neues Röhrchen
- Fügen Sie eine zusätzliche 1 ml Chloroform, gefolgt von 1 ml dH 2 O Vortex zweimal für 30 Sekunden. Zentrifuge bei 1.700 xg für 5 Minuten bei RT.
- Wiege eine Glasröhre auf einem empfindlichen Gleichgewicht und einen Glas-Pasteur-Pipette, um die Unterphase in das Glasrohr mit bekanntem Gewicht zu übertragen.
- Trocknen Sie nach unten Lipiden in einer Zentrifugalverdampfer bis trocken (ca. 2 h). Wiegen Rohr mit getrockneten Lipide und berechnen Sie die trockene Lipidgewicht.
HINWEIS: Dry Lipide können in -20 ° C bis zu seiner TLC führen gespeichert werden. - Verdünne getrockneten Lipide in Chloroform ausreichend, um die Konzentration von Lipid zu normalisieren (üblicherweise 20-50 ul) und der Last 20 ul der verdünnten Lipid auf eine Kieselgel-DC-Platte. Last 20 ug Cholesterin in 20 ul Chloroform als Standard verdünnt.
- Fügen getrocknet DC-Platte auf den gesättigten TLC Tank und lassen Sie Lösungsmittel für die Migration von bis zu 1 cm vor der Plattenkante. Entfernen DC-Platte aus dem Tank und lassen Sie es ca. 5 Minuten trocknen lassen.
- Visualisieren Lipide, indem in einem Joddampf Tank Migration überprüfen. Entfernen Sie und lassen Sie Flecken auf etwa 10 verblassen - 15 Minuten unter der Haube.
HINWEIS: Jod ist ein Inhalationsrisiko. Verwenden Sie immer unter einer Abzugshaube. - Es wird eine Lösung für die Neutrallipid-Anfärbung durch Kombinieren von 60 ml Methanol mit 60 ml entionisiertem H 2 O, 4 ml Schwefelsäure und 630 mg Manganchlorid.
- Die DC-Platte vorsichtig und langsam tauchen in das neutrale Lipid Farblösung in einer Schale und ohne Abgleitens der Kieselsäure l entfernenayer.
ANMERKUNG: Das neutrale Lipid Färbelösung kann mehrere Male wiederverwendet werden, und so kann sie aus dem Fach abgerufen und in einer Flasche zur späteren Verwendung zurück gelegt. - Lassen Sie die Platte unter die Haube bei RT trocknen, bis alle Blasen verschwunden. Erhitzen Sie die DC-Platte auf einem Heizblock Satz bis 160 ° C und Saibling auf die gewünschte Farbe.
HINWEIS: Eine Dichtemessung Programm wie Sehen funktioniert LS kann zur Quantifizierung der verkohlten Bands Lipidproben zu vergleichen.
3. Die Infektion von Makrophagen mit C. neoformans (H99)
- In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 5 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Well auf einer 96-well-Zellkulturplatte in 200 & mgr; l DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% P / S. Bei 37 ° C, 5% CO 2, 5% CO 2 O / N.
HINWEIS: Die Infektion kann auch in Glas ausgeführt werden Talsohle konfokalen Gerichte für einfachere Bild; Alle Beträge bleiben gleich. - Wachsen einer Kultur der C. neoformans (H99)durch Inokulation von 10 ml YNB mit einer Kolonie von einem geschlagen Platte erhalten und Inkubation O / N bei 30 ° C unter Schütteln.
- Waschen Sie und zählen C. neoformans (H99) Zellen.
- Centrifuge C. neoformans O / N-Kultur bei 1700 × g für 10 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie das Medium und entsorgen. Wash-Zellen mit 5 ml 1x PBS. Zentrifuge bei 1.700 × g für 10 min bei 4 ° C.
- PBS entfernen und wäscht mit 5 ml gefiltert 1x PBS. Zentrifuge bei 1.700 × g für 10 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male.
- Entfernen PBS und Resuspendieren in 5 ml 1x PBS.
- Stellen Sie eine serielle Verdünnung in PBS, um eine 1 zu erhalten: 500 Verdünnung der Kultur gewaschen.
- Füge 100 ul der ursprünglichen Probe zu 900 ul 1x PBS, um eine Verdünnung von 1:10 zu erhalten.
- 100 l 1:10 verdünnten Probe zu 900 ul 1X PBS, um eine 1 zu erhalten: 100-Verdünnung.
- Gib 200 ul der 1: 100 verdünnt Probe auf 800 & mgr; l 1x PBS, um eine 1 zu erhalten: 500 dilutiauf
- Nehmen Sie 10 ul einer 1: 500-Verdünnung und zählen auf Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen zu berechnen.
- Bereiten Sie Arbeitslösung für die Aktivierung von Makrophagen und opsonisierenden C. neoformans.
- Verdünnen LPS und IFN 100x aus Stammlösungen durch Zugabe von 10 ul bis 990 ul.
HINWEIS: LPS und IFN & ggr; werden verwendet, um Phagozytose zu verbessern, sind jedoch nicht für die Phagozytose erforderlich. Wenn es ein Interesse an der fungiziden Aktivität von Makrophagen, führen Aktivierungs O / N bei 37 ° C mit Schütteln vor der Infektion. - Pro Probe kombinieren 7,5 ul verdünnt LPS, 1,25 & mgr; l verdünnt IFNy, 1,25 ul GXM Antikörper und das Volumen des C. neoformans Kultur, die 1,25 x 10 5 Zellen gibt. Bringen Volumen bis zu 250 & mgr; l multipliziert mit der Anzahl von Proben mit DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt.
- Vortex und Inkubation Lösung für 20 min bei 37 ° C unter Schütteln.
HINWEIS:Cholesterinabbau (Schritte von 1,2 bis 1,4) kann gleichzeitig mit der Opsonisierung Schritt erfolgen. Achten Sie darauf, Makrophagen vor dem Kombinieren der Arbeitslösung zu behandeln, da die opsonisierte Zellen sind optimal zu nicht mehr als 20 min nach dem Schritt 3.4.3 Inkubation verwendet werden.
- Verdünnen LPS und IFN 100x aus Stammlösungen durch Zugabe von 10 ul bis 990 ul.
- Infizieren Makrophagen
- Wash Makrophagen zweimal mit serumfreiem DMEM und fügen Sie 200 ul opsonisierten C. neoformans Arbeitslösung in jede Vertiefung.
- Inkubieren für 2 h bei 37 ° C.
- Fix und Stain Cells
- Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 2 mal mit DMEM.
- Luft trocknen die Zellmonoschicht für 10 Minuten und mit 200 ul eiskaltem Methanol, um die Zellen zu fixieren.
- Inkubieren für 15 min bei RT und entfernen Sie alle verbleibenden Methanol.
- Fügen Sie 200 ul von 10x Giemsa und Inkubation für 5 min bei RT.
- Mit VE-Wasser und trocken O / N mit Kappe aus 3 mal - Waschen 2.
HINWEIS: Imaging können am nächsten Tag bis zu einer Woche followi erfolgen oder bisng-Färbung.
- Visualisieren und Graf
- Mit einem Mikroskop, zählen 300 Zellen pro Datenpunkt (bei 2 von der gleichen Behandlung zählen 150 pro Vertiefung), und notieren Sie die Anzahl der infizierten Makrophagen und Anzahl der verschlungen Cryptococcus Zellen.
HINWEIS: Wenn Sie auch sicher, Probenahme pro Datenpunkt Einsatz 2 Platten pro Bedingung, wählen Sie 3 nicht überlappende Bereiche pro Platte und zähle 50 Zellen pro Fläche. - Berechnen phagozytischen Index, indem der Prozentsatz der infizierten Makrophagen durch die mittlere Anzahl von C neoformans pro Makrophagen. Normalisieren phagozytischen Index ausdrückt Werte als ein Prozentsatz des 1x PBS behandelten Kontroll. Nach mehreren Versuchen berechnet den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts, um Trends in phagozytischen Index zu bestimmen. Verwenden Student t-Test auf Signifikanz zu bestimmen.
- Nehmen Sie Aufnahmen von Zellen bei 1,000x oder 400-facher Vergrößerung.
- Mit einem Mikroskop, zählen 300 Zellen pro Datenpunkt (bei 2 von der gleichen Behandlung zählen 150 pro Vertiefung), und notieren Sie die Anzahl der infizierten Makrophagen und Anzahl der verschlungen Cryptococcus Zellen.
4. Trypanblau-Assay
- In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 6 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Vertiefung auf einer 6-Well-Zellkultur-Platte in einem Volumen von 5 ml Dulbecco-Minimal-Essential-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt . Bei 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
- Abbau Makrophagen von Cholesterin durch folgende Schritte 1,2-1,4 daß 2 ml für 200 & mgr; gegebenenfalls für die größeren und Größe zu berücksichtigen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, eine Steuerung mit 1x PBS sowie eine Steuerung, die vor jeder Behandlung gekratzt behandelt sind. - Gib 500 ul 1x PBS in jede Vertiefung und sanft kratzen Zellen mit einem Zellschaber. Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und die Zellen zu suspendieren durch leichtes Auf- und Abpipettieren.
- Entfernen Sie 10 ul der Zellen und Fleck mit 1 ul 4% Trypanblau.
- Zählen von Zellen an einem Hämozytometer und berechnen die Lebensfähigkeit unter Verwendung der folgenden Gleichung:% Lebensfähigkeit = [1 - (blaue Zellen / Gesamtzellen)]x 100. Normalisieren Werte an die Steuerung, die unbehandelt war. Nach mehreren Versuchen berechnet den Mittelwert und die Standardabweichung zu Trends in der Lebensfähigkeit zu bestimmen. Verwenden Student t-Test auf Signifikanz zu bestimmen.
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Representative Results
Cholesterin Depletion
Analyse des Überstands in Stufe 1.3 des Protokolls durch folgende Anweisungen des Herstellers im Amplex Red Cholesterol Assay Kit vorbehalten ergibt eine erhöhte Konzentration von Cholesterin in MßCD behandelten Probe im Vergleich zu der 1x PBS-Kontrolle. Je nach Zelltyp und MßCD Konzentration verwendet Cholesterinabbau kann variieren. Für J774 mit 10 mM MßCD behandelt wurde eine Abreicherung von ca. 50% beobachtet. Depletion kann mit aus dem Überstand und Zelllysat in Schritt 1.4 (Figur 1) gesammelt erhaltenen Werte berechnet werden.
Zelllysat mittels TLC analysiert zeigt eine deutliche Abnahme der Färbung von Cholesterin in den Zellen mit zunehmender Konzentration des MßCD (2A) behandelt. Densitometrie-Analyse des TLC zeigt eine ähnliche Tendenz zu der quantitative Assay (2B). Die Bligh-Dyer Methode gibt eine grobe extract der Gesamtlipide und es ist wesentlich, um eine ausreichende Trennung von Lipiden, um die richtige Band Verwendung des Cholesterin-Standard identifizieren lassen.
Infektion
Nach dem Anschluss an die Infektion Verfahren Zellen haften zu bleiben und intakt. Zellmorphologie bleibt unverändert zwischen den Behandlungsgruppen. Eine Kontrollgruppe, die nicht mit C ausgesetzt wurde, neoformans dient als Kontrollpunkt (Abbildung 3). Es ist möglich, ein suboptimales Ergebnis erhalten, und kann so die Lyse von Zellen und anderen abnormalen Morphologien manifestieren. Die häufigste Ursache ist eine Kontamination der Zelllinie oder Reagenzien in dem Verfahren verwendet. Aufnahmen von optimal infizierten Zellen zeigen deutlich, C. neoformans versenkt innerhalb der Säugerzellen. Unterschiede in der Anzahl der phagozytierten Hefe kann durch Beobachtung zwischen den Behandlungsgruppen (4), zu vermerken. Nach der Berechnung phagozytischen Index aus 300 Makrophagen pro Behandlungsgruppe einVerringerung phagozytischen Index in Cholesterin verarmte Zellen (5) zu entnehmen. Die Verringerung der phagozytischen Index nicht erscheint abhängig vom Potentialunterschiede in der Makrophagenaktivierung zu sein, auch wenn sie auftreten. Ausführen der Infektion in Abwesenheit von Makrophagenaktivatoren, aber nach der Behandlung mit MCD ergibt eine ähnliche Reduktion der phagozytischen Index (Daten nicht gezeigt).
Trypanblau
Trypan-Blau-Färbung verwendet wird, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Cholesterinabbau zu bewerten. Keine Veränderung der Lebensfähigkeit beobachtet zwischen PBS behandelt und 10 mM MCD behandelten Zellen. Die Lebensfähigkeit wird mit 30 mM MCD, die aufgrund der etwa 75% Abbau von Cholesterin erwartet werden kann (ein wesentlicher Lipid) in der densitometrischen Auswertung (Figur 6 und Figur 2B) beobachtet etwas abfallen nach der Behandlung.
Abbildung 1. Cholesteringehalt des Überstands nach der Behandlung. Die Quantifizierung von Cholesterin in der aus behandelten Zellen gesammelt Stand zeigt Anreicherung MCD im Vergleich zu PBS 1x. Cholesterin Abbau beträgt 50 ± 5% von Gesamtcholesterin in 1x PBS (Überstand + Zelllysat) berechnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n = 5).
Abbildung 2. TLC von Cholesterin im Zelllysat und Densitometrie. Bild von entwickelten DC-Platte mit MnCl2 Verkohlung visualisiert. Eine deutliche Abnahme der Cholesterin nach MßCD Behandlung (A) gesehen. Densitometrie-Analyse der Banden im Vergleich zu der PBS-behandelten (als 100% dargestellt) Steuer bestätigt Trend in Cholesterol Quantifizierungsassay gefunden (B Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Nicht infizierte Kontroll Aufnahmen von behandelten J774 Makrophagen. Bilder von nicht infizierten J774-Zellen bei 200-facher Vergrößerung. Maßstabsbalken ist 50 um. 1x PBS (A), 10 mM MßCD (B) und 30 mM MßCD (C) behandelten Zellen zeigen keine Veränderung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Die Infektion von J774 Makrophagen, die mitC. neoformans Bilder von infizierten J774-Zellen bei 400X aufgenommen (obere Reihe A.1 - C.1). Und 1,000x (untere Reihe A.2 - C.2) Vergrößerung gezeigt. Verinnerlichten C. neoformans Zellen erscheinen als blau-violetten Kugeln mit einem Feuerzeug Ring um sie herum. Zellen mit 1x PBS (A), 10 mM MßCD (B) und 30 mM MßCD (C) zeigen Unterschiede in C behandelt neoformans Aufnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Phagocytose-Index. Phagocytose-Index in Bezug auf die Kontrollgruppe, die mit PBS behandelt wurde (bei 100 zum Vergleich markiert) dargestellt. Phagozytische Index wurde um 25% bis 10 reduziertmM MßCD Behandlung und um fast 55% von 30 mM Behandlung. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung des Mittelwerts (n = 4).
Abbildung 6. Die Zelllebensfähigkeit. Variationen in der Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Assay zeigen eine geringe Variation bei einem Vergleich aller drei Behandlungsgruppen. Es gibt einen leichten Abfall der Lebensfähigkeit in der 30 mM MßCD Behandlungsgruppe, die von Erschöpfung der wie eine Hauptkomponente der Membran zu erwarten sind. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n = 4).
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Discussion
Bei der Arbeit mit diesem Protokoll ist es wichtig, genaue Zellzählungen beim Plattieren Säugetierzellen und opsonisierenden C erhalten neoformans Zellen. Dies minimiert die Unterschiede zwischen Studien und gewährleistet eine exakte 1: 1-Ziel-Effektor-Verhältnis während der gesamten Studie. Es ist auch wichtig, um das Timing des Cholesterinabbau und Infektion zu koordinieren, um die opsonisierten Hefezellen oder behandelten Makrophagen aus ruhenden bei RT zwischen den Verfahren zu verhindern. Lange Wartezeiten könnte zum Verlust der Antikörper-Opsonisierung oder der Ergänzungs von abgereichertem Cholesterin führen vor der Infektion begonnen werden kann. Wenn Experimente mit Genauigkeit erfolgen die Datenanalyse erlaubt Rückschlüsse auf die Rolle des Cholesterins in Phagozytose erkennbar.
Die Grenzen der Technik verhindern, dass Rückschlüsse auf die spezifischen Mechanismus, durch den Cholesterinabbau senkt die phagozytische Makrophagen-Index von ähnlichen Zellen, und es ist unklar, ob die ef istfekt ist unmittelbar auf Cholesterin oder auf Grund einer sekundären Mechanismus. Weitere Arbeiten zu dieser Richtung untersucht, andere Bestandteile des Lipidflößen wie Sphingolipide oder Proteinen wie den Fcy-Rezeptors und der Komplement-Rezeptor Funktion in Phagozytose bekannt 3 2. Ändern dieser Technik entweder Opsonisierung verwenden oder alleine ergänzen könnten unterscheiden helfen eine Rolle Cholesterin in einem oder beiden dieser bekannten Wegen. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass MßCD extrahiert Cholesterin auf der Grundlage ihrer Hydrophobizität und Größe, damit Sterole von ähnlicher Größe kann auch abgereichert werden und wird in einem ähnlichen Ausmaß wie Cholesterol auf TLC migrieren. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Cholesterin Verarmungs partiell beeinflussen Makrophagenaktivierung, ist dies wahrscheinlich nicht für die in die Aufnahme als Durchführen der Infektion in Abwesenheit von IFN- und LPS beobachtet Unterschied verantwortlich zeigt die gleiche Verringerung der Aufnahme von C. neoformans (Daten nicht gezeigt), but es von Interesse ist, wenn die Änderung dieser Technik, um die Anti-Pilz-Aktivitäten von Makrophagen und die Rolle der Aktivierung zu untersuchen. Auch dieses Verfahren erlaubt uns nicht, zu erkennen, ob Cholesterin-Depletion irgendwelche therapeutischen Implikationen in Pilzinfektion. Weitere Arbeiten in vivo mit Cholesterin senkenden Arzneimitteln und epidemiologische Studien von Patienten, die cholesterinsenkende Medikamente könnten weiteren Aufklärung eine Rolle für den Cholesterinabbau in der Behandlung der Krankheit und kann ein selektiver Weise den Cholesterinakkumulation hemmen bieten.
Dieses Verfahren könnte leicht verwendet werden, um die Aufnahme von anderen Krankheitserregern oder feste Partikel zu untersuchen (dh Glasperlen), die Phagozytose und ermöglichen das Studium der biologischen Grundlagen der Phagozytose. Modifikationen können für die Untersuchung anderer Aspekte der Phagozytose durch eine Behandlung der Makrophagen mit Enzymen zu ermöglichen, um andere Membrankomponenten oder verschiedene Medikamente und Inhibitoren der inter sein kann selektiv abbauenest. Es sollte auch beachtet werden, dass die Durchflusszytometrie kann eine genauere und quantitativ zu charakterisieren Phagozytose darzustellen und könnte verwendet werden, um die direkte mikroskopische Zählung 24 ersetzen. Insgesamt ist dies eine recht einfache Technik, die als Ausgangspunkt für die mehr in die Tiefe Studien, die Frage, wie Lipide können eine wichtige Rolle bei der Infektion und Immunantwort spielen beantworten genutzt werden kann.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse AI56168, AI71142, AI87541 und AI100631 zu MDP unterstützt. Maurizio del Poeta ist Burroughs Wellcome Investigator in Infectious Diseases.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations |
| Orbital shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S meaures down to 0.1 mg | |
| Glass Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass bottom confocal dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
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