Abstract
Cryptokokkose is een levensbedreigende infectie veroorzaakt door ziekteverwekkende schimmels van het geslacht Cryptococcus. Infectie gebeurt bij inhalatie van sporen die kunnen repliceren in de diepe long zijn. Fagocytose van Cryptococcus door macrofagen is een van de manieren waarop de ziekte kan verspreiden in het centrale zenuwstelsel dodelijke hersenvliesontsteking veroorzaken. Daarom is onderzoek naar de associatie tussen Cryptococcus en macrofagen is belangrijk voor het begrijpen van de progressie van de infectie. De onderhavige studie beschrijft stap voor stap protocol macrofaag infectiviteit bestuderen door C. neoformans in vitro. Met behulp van dit protocol, wordt de rol van gastheer sterolen op gastheer-pathogeen interacties bestudeerd. Verschillende concentraties van methyl - cyclodextrine (MCD) gebruikt om cholesterol uit muizen reticulum sarcoom macrofaag cellijn J774A.1 afbreken. Cholesterol uitputting werd bevestigd en gekwantificeerd met behulp van zowel een commercieel beschike cholesterol kwantificering kit en dunnelaagchromatografie. Cholesterol uitgeputte cellen geactiveerd met lipopolysaccharide (LPS) en interferon gamma (IFNy) en geïnfecteerd met antilichaam opsonized Cryptococcus neoformans wildtype H99 cellen bij een effector-tot-doel-verhouding van 1: 1. Geïnfecteerde cellen werden gevolgd na 2 uur incubatie met C. neoformans en de fagocytose index werd berekend. Cholesterol depletie resulteerde in een significante vermindering van de fagocytose index. De gepresenteerde protocollen bieden een handige methode om de inleiding van de infectie proces na te bootsen in een laboratoriumomgeving en bestuderen van de rol van gastheer lipidesamenstelling op besmettelijkheid.
Introduction
Fagocytose is een proces waarbij extracellulaire entiteiten worden geïnternaliseerd door gastheercellen. Het is een belangrijk wapen in het arsenaal van het immuunsysteem om te beschermen tegen pathogenen, maar het proces kan vaak worden ondermijnd door pathogenen te zorgen voor internalisatie en verspreidt zich door het lichaam 1. Fagocytose wordt gemedieerd door verschillende signalering gebeurtenissen die de hechting en afblazen via herschikkingen van het cytoskelet gastheercel. 'Professionele fagocyten kunnen herkennen en binden opsoninen op het oppervlak van de pathogeen te signaleren bevestigen van de vorming van lamellipodia die de pathogeen overspoelen en vormen een phagosome 2. Onder de zogenaamde 'professionele' fagocyten zijn macrofagen. Macrofagen zijn zeer gespecialiseerde cellen die het uitvoeren van beschermende functies die onder andere het zoeken naar en het elimineren van ziekteverwekkers, het repareren van beschadigde weefsels, en het bemiddelen ontsteking, het grootste deel vandeze door het proces van fagocytose 1,2.
Cryptococcus neoformans is een species van pathogene gist die een ernstige ziekte bekend als Cryptokokkose veroorzaakt. Cryptococcus sporen worden ingeademd door de gastheer en resulteren in een longinfectie die meestal asymptomatisch. Men denkt dat de blootstelling zeer gangbaar; Een monster van 61 kinderen uit de Pediatric Infectious Diseases Clinic bij het Bronx Lebanon Hospital Center gevonden dat alle ondervraagde antilichamen tegen de cryptococcal polysaccharide glucuronoxylomannan en andere studies hebben aangetoond prevalentie in zowel menselijke immunodeficiëntievirus (HIV) geïnfecteerde en geïnfecteerde volwassenen 3, 4. alveolaire macrofagen zijn de eerste regel van het antwoord op de longinfectie en in de meeste gevallen met succes duidelijk de ziekteverwekker. In immuungecompromitteerde personen (bijvoorbeeld HIV en AIDS patiënten) de gist kan overleven in macrofagen. In dezegevallen kan de macrofagen dienen als een niche voor de replicatie van het pathogeen en kan de verspreiding ervan naar het centrale zenuwstelsel (CZS) wanneer de ziekte wordt fatale 5 vergemakkelijken - 8. Er wordt gedacht dat macrofagen ook de gist kan leveren direct in de hersenvliezen, waardoor de gist de bloedhersenbarrière passeren via de "Trojaans paard" model 3,9 - 11. Het is dus belangrijk om het proces van fagocytose en de factoren die van invloed zijn, vooral in cryptococcal infecties begrijpen.
Vorige werk in andere pathogeen systemen wijzen op cholesterol en rafts gevormd door cholesterol als het hebben een belangrijke rol te spelen in fagocytose 12-15. Cholesterol is de meest voorkomende soorten lipiden in zoogdiercellen en omvat 25 - 50% van de zoogdiercel membraan 16. Gevonden een rol spelen bij het moduleren van Biophysical eigenschappen van membranen door het veranderen van hun starheid 17. Cholesterol en sfingolipiden samen lipiden microdomeinen binnen het membraan bekend als lipide rafts. Lipide rafts zijn gevonden betrokken te zijn bij de vorming van caveolae, alsmede het verschaffen van een geïsoleerd domein voor bepaalde signalering 16-18. Door hun kleine formaat, is het moeilijk om lipide rafts in in vivo. Een handige manier om de rol van lipide rafts bestuderen is hun bestanddelen veranderen. Methyl-β-cyclodextrine (MβCD) een verbinding die is gevonden om cholesterol afbreken van zoogdieren membranen en wordt vaak gebruikt om de rol van rafts 18 bestuderen.
In dit protocol presenteren we een methode om cholesterol uit gastcelmembranen afbreken en kwantificeren van het effect van de uitputting van het vermogen van de gastheercellen fagocyteren C. neoformans in vitro. Deze procedure maakt gebruik van celkweek techniqUES op een onsterfelijk macrofaagachtige cellijn (J774A.1) als model voor infectie. Cholesterol depletie werd bewerkstelligd door blootstelling aan MβCD die een hydrofobe kern specifiek de grootte van sterolen heeft en kan fungeren als een gootsteen voor cholesterol te trekken uit het membraan 19. Cholesterol depletie werd gemeten kwantitatief behulp van een commercieel verkrijgbare kit en kwalitatief toepassing van een gemodificeerde Bligh-Dyer lipide extractie gevolgd door dunnelaagchromatografie (TLC) 20. . Fagocytose werd gemeten door het infecteren van de cellijn met een cultuur van opsonized gist gemengd met een cocktail van interferon-γ en lipopolysaccharide voor het activeren van macrofagen Cryptococcus werd geopsoniseerd met een glucuronoxylomannan (GXM) antilichaam 21-23. Kleuring en microscopie experimenten termijn voor visualisatie van de cellen en de berekening van de fagocytose index van de mate van fagocytose beoordelen. Bij elkaar genomen, dit protocol describes een basismethode dat de wijziging van lipide samenstelling met een fysiologisch proces integreert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cholesterol Uitputting van J774A.1 Cellen met MβCD
- In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 5 J774A.1 macrofaag-achtige cellen per putje op een 96-well celkweek plaat in 200 pl Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S). Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 O / N.
- Verwijder media uit de celmonolaag en was de cellen tweemaal met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die is gefilterd en geautoclaveerd.
- Voeg 200 ul van MβCD oplossing in de gewenste concentratie (10 mM of 30 mM in PBS) of 1x PBS als controle en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder schudden. Verwijder supernatant en reserve bij RT voor de kwantitatieve analyse met in de handel verkrijgbare kit onmiddellijk na de procedure.
- Was de cellen twee tot drie keer met 1x PBS en serumvrije DMEM en verder met infectie of lyseren cellen door pipetting 2-3 maal met gedeïoniseerd H2O voor analyse met dunne laag chromatografie of met een kit.
OPMERKING: Na cholesterol uitputting een in de handel verkrijgbaar cholesterol kwantificering kit kan worden gebruikt. Zie materialen sectie voor details. Volg de instructies van de fabrikant als geschreven.
2. Observatie van cholesterolgehalte met dunnelaagchromatografie (TLC)
- Was een TLC-tank tweemaal met aceton en eenmaal met een oplossing van petroleumether: diethylether: azijnzuur (65: 30: 1 in volume). Verzadig de bak met petroleumether: diethylether: azijnzuur (65: 30: 1 in volume) oplossing en laat O / N.
OPMERKING: Organische oplosmiddelen moeten altijd onder een afzuigkap gebruikt worden om inademing van dampen te vermijden. Handschoenen en een laboratoriumjas te worden gedragen ten alle tijden. Azijnzuur is een sterk zuur en moet met voorzichtigheid worden gebruikt. - In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 6 J774A.1 macrofaag-achtige cellen per putje op een 6-well cell kweekplaat in een volume van 5 ml warme DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
- Afbrekende macrofagen van cholesterol door de stappen 1,2-1,4, het vervangen van 1 ml voor 200 ul indien van toepassing rekening te houden met het grotere goed formaat.
- Voeg 500 pi van trypsine-EDTA aan elk putje, incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C en voorzichtig schrapen cellen met een cel schraper.
- Breng in een microcentrifugebuis en voeg nog eens 500 pl warm DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S.
- Draai de cellen gedurende 5 minuten bij 300 g en verwijder het supernatant.
- Voeg een extra 500 pl warm DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S de celpellet en resuspenderen door en neer te pipetteren.
- Breng 10 pl van cellen en cellen tellen op een hemocytometer. Normaliseren van de cel concentratie van elk monster en een gelijk aantal cellen glazen buizen.
LET OP: Bij deze stap, één meikiezen cellen combineren van dezelfde behandelingsgroepen een meer geconcentreerde uiteindelijke lipide extract te verkrijgen. - Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijdert media.
- Voeg 2 ml methanol en vortex. Dan, voeg 1 ml chloroform en vortex. Controleer de fase-status te zorgen dat de oplossing in monofasische maken.
OPMERKING: buizen kunnen bij 4 ° CO / N opgeslagen. - Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en breng de supernatant naar een nieuwe buis
- Voeg een extra 1 ml chloroform gevolgd door 1 ml dH 2 O. Vortex tweemaal gedurende 30 sec. Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Weeg een glazen buis op een gevoelige balans en gebruik een glazen Pasteur pipet om de onderste fase over in de glazen buis van bekend gewicht.
- Drogen neer lipiden in een centrifugale verdamper tot het droog is (ongeveer 2 uur). Weeg buis met gedroogde lipiden en bereken de droge lipide gewicht.
OPMERKING: Droog lipiden kunnen worden opgeslagen in -20 ° C tot klaar om TLC voeren. - Verdun gedroogde lipiden in chloroform voldoende om de concentratie van lipiden normaliseren (meestal 20-50 pi) en de belasting 20 ul van de verdunde lipide op een silica TLC-plaat. Load 20 ug cholesterol verdund in 20 pi chloroform als een standaard.
- Voeg gedroogd TLC plaat om de verzadigde TLC tank en laat oplosmiddel migreren tot 1 cm voor plaatrand. Verwijder TLC-plaat uit de tank en laat ze drogen ongeveer 5 min.
- Visualiseer lipiden door het plaatsen in een jodiumdampen tank om migratie te controleren. Te verwijderen en vlekken te vervagen voor ongeveer 10-15 min onder de motorkap.
OPMERKING: Jodium is geen gevaar voor inademen. Gebruik altijd onder een afzuigkap. - Bereid een oplossing van neutrale lipiden kleuring door het combineren van 60 ml methanol met 60 ml gedeïoniseerd H2O, 4 ml zwavelzuur en 630 mg mangaan chloride.
- Voorzichtig en langzaam dompel de TLC-plaat in de neutrale lipiden kleuroplossing in een lade en verwijderen zonder afstoot silica layer.
OPMERKING: De neutrale lipide kleuroplossing kan meerdere keren worden hergebruikt en zodat het kan worden opgehaald uit de bak en in een fles voor later gebruik teruggeplaatst. - Laat de plaat drogen onder de motorkap bij KT totdat alle bellen verdwenen. Verwarm de DLC-plaat op een warmte-blok set tot 160 ° C en char om de gewenste kleur.
OPMERKING: Een densitometrie programma zoals Vision Works LS kan worden gebruikt om de verkoolde banden te kwantificeren lipide monsters te vergelijken.
3. Infectie van macrofagen met C. neoformans (H99)
- In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 5 macrofaag-achtige cellen per putje op een 96-well celkweek plaat in 200 ui DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2, 5% CO 2 O / N.
OPMERKING: Infectie kan ook worden gedaan in een glazen bodem confocale gerechten voor eenvoudiger beeldvorming; alle bedragen blijven hetzelfde. - Grow een cultuur van C. neoformans (H99)door inoculeren van 10 ml YNB één kolonie verkregen uit een geslagen plaat en incuberen O / N bij 30 ° C onder schudden.
- Wassen en tel C. neoformans (H99) cellen.
- Centrifuge C. neoformans O / N kweek bij 1700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder media en gooi ze weg. Was de cellen met 5 ml 1x PBS. Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder PBS en was met 5 ml gefiltreerd 1x PBS. Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Herhaal deze stap nog 2 keer.
- Verwijder PBS en resuspendeer in 5 ml 1X PBS.
- Voeg een seriële verdunning in PBS tot een 1 verkregen: 500 verdunning van de kweek gewassen.
- Voeg 100 ul van het oorspronkelijke monster 900 ul van 1 x PBS tot een 1:10 verdunning te verkrijgen.
- Voeg 100 ul van 1:10 verdunde monster tot 900 ul van 1x PBS om een 1 te verkrijgen: 100 verdunning.
- Voeg 200 ul van de 1: 100 verdunde monster 800 ul van 1 x PBS om 1 te verkrijgen: 500 dilutiop
- Neem 10 pi van 1: 500 verdunning en rekenen hemocytometer om het aantal cellen te berekenen.
- Bereid werkoplossing voor het activeren van macrofagen en opsoniserende C. neoformans.
- Verdunnen LPS en IFNy 100x uit voorraad oplossingen door het toevoegen van 10 pi tot 990 ul.
OPMERKING: LPS en IFNy worden gebruikt fagocytische opname vergroten, maar zijn niet vereist voor fagocytose. Als er belangstelling fungicide activiteit van macrofagen, uitvoeren activatie O / N bij 37 ° C onder schudden voor infectie. - Per monster combineren 7,5 gl verdunde LPS, 1,25 gl verdunde IFNy, 1.25 ui GXM antilichaam en het volume van de C. neoformans cultuur die 1,25 x 10 5 cellen geeft. Breng volume 250 pi maal aantal monsters met DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S.
- Vortex en incubeer oplossing gedurende 20 minuten bij 37 ° C onder schudden.
OPMERKING:Cholesterol uitputting (stappen 1,2-1,4) kan gelijktijdig worden uitgevoerd met de opsonisatie stap. Zorg ervoor dat macrofagen vóór het mengen van de werkoplossing te behandelen, aangezien de geopsoniseerde cellen optimaal niet langer gebruikt worden dan 20 min na stap 3.4.3 incubatie.
- Verdunnen LPS en IFNy 100x uit voorraad oplossingen door het toevoegen van 10 pi tot 990 ul.
- Infecteren macrofagen
- Wassen macrofagen tweemaal met serumvrij DMEM en voeg 200 pl opsonized C. neoformans werkoplossing aan elk putje.
- Incubeer 2 uur bij 37 ° C.
- Fix en Stain Cellen
- Verwijder de media en was cellen 2 keer met DMEM.
- Lucht drogen de celmonolaag gedurende 10 min en voeg 200 pl ijskoude methanol om de cellen te repareren.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en verwijder eventueel overgebleven methanol.
- Voeg 200 ul van 10x Giemsa en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was 2 - 3 keer met gedemineraliseerd water en droog O / N met dop eraf.
OPMERKING: Imaging kunnen de volgende dag worden gedaan of tot een week following vlekken.
- Visualiseren en Graaf
- Met behulp van een microscoop, tel 300 cellen per datapunt (als er 2 van dezelfde behandeling rekenen 150 per putje) en noteer het aantal geïnfecteerde macrofagen en het aantal overspoeld Cryptococcus cellen.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen zelfs bemonstering per datapunt gebruik 2 platen per staat, kiest u 3 niet-overlappende gebieden per plaat en tel 50 cellen per gebied. - Bereken fagocytose index met het percentage van geïnfecteerde macrofagen vermenigvuldigen met het gemiddelde aantal C. neoformans per macrofaag. Normaliseren fagocytische index expressie waarden als percentage van de 1x PBS behandelde controlegroep. Na verschillende tests berekent het gemiddelde en de standaarddeviatie van de gemiddelde trends in fagocytische index te bepalen. Gebruik student t-test voor significantie te bepalen.
- Neem microfoto van cellen op 1000x of 400X vergroting.
- Met behulp van een microscoop, tel 300 cellen per datapunt (als er 2 van dezelfde behandeling rekenen 150 per putje) en noteer het aantal geïnfecteerde macrofagen en het aantal overspoeld Cryptococcus cellen.
4. trypaanblauw Assay
- In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 6 macrofaag-achtige cellen per putje van een 6-well celcultuur plaat in een volume van 5 ml Dulbecco's minimaal essentieel medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine . Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
- Afbrekende macrofagen van cholesterol door de stappen 1,2-1,4 vervangen van 2 ml voor 200 ul indien van toepassing rekening te houden met het grotere goed formaat.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u een controle behandelde met 1x PBS, evenals een controle dat voorafgaand aan elke behandeling wordt geschraapt bevatten. - Voeg 500 ul 1X PBS aan elk putje en voorzichtig schrapen cellen met een cel schraper. Breng in een microcentrifugebuis en schorsen cellen door voorzichtig en neer te pipetteren.
- Breng 10 pl van cellen en vlek met 1 ui 4% trypan blauw.
- Tellen cellen op een hemocytometer en de levensvatbaarheid berekenen met de volgende formule:% levensvatbaarheid = [1 - (Blue cellen / totaal cellen)]x 100. normaliseren waarden van de controle die onbehandeld was. Na een aantal proeven te berekenen de gemiddelde waarde en de standaarddeviatie om trends vast te stellen van de levensvatbaarheid. Gebruik student t-test voor significantie te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cholesterol Uitputting
Analyse van het supernatans gereserveerd stap 1.3 van het protocol volgens de instructies van de fabrikant in de Amplex Red Cholesterol Assay kit levert een verhoogd cholesterolgehalte in MβCD behandelde monster vergeleken met de 1x PBS controle. Afhankelijk van celtype en MβCD gebruikte concentratie cholesterol depletie kan variëren. Voor J774 behandeld met 10 mM MβCD, werd een afname van ongeveer 50% waargenomen. Uitputting kan worden berekend met waarden verkregen uit het supernatant en cellysaat in stap 1.4 (figuur 1) verzameld.
Cellysaat geanalyseerd middels TLC toont een duidelijke afname in kleuring van cholesterol in cellen behandeld met toenemende concentratie van MβCD (figuur 2A). Densitometrische analyse van de TLC toont een soortgelijke trend met de kwantitatieve assay (figuur 2B). De Bligh-Dyer methode geeft een ruwe extract totale lipiden en het is essentieel om voor adequate scheiding van lipiden om de juiste band gebruikmaking cholesterol standaard identificeren.
Infectie
Na het volgen van de infectie procedure, blijven de cellen gehandeld en intact. Celmorfologie ongewijzigd tussen behandelingsgroepen. Een controlegroep die niet is blootgesteld aan C. neoformans dient als controlepunt (figuur 3). Het is mogelijk om suboptimale resultaten en zich uit in lysis van cellen en andere abnormale morfologie. De meest waarschijnlijke oorzaak van besmetting van de cellijn of reagentia die bij de procedure. Microfoto van optimaal geïnfecteerde cellen laten duidelijk C. neoformans overspoelde in zoogdiercellen. Verschillen in aantal phagocytized gist kan worden opgemerkt door waarneming tussen behandelingsgroepen (Figuur 4). Na het berekenen van fagocytose index van 300 macrofaagcellen per behandelgroep eendaling fagocytische index wordt gevonden in cholesterol uitgeputte cellen (Figuur 5). De verlaging van de fagocytose index niet weergegeven afhankelijk mogelijke verschillen in activering van macrofagen, hoewel ze kunnen optreden. Het uitvoeren van de infectie in afwezigheid van macrofagen activatoren, maar na behandeling met MCD leidt tot een overeenkomstige vermindering van fagocytische index (gegevens niet getoond).
Trypaanblauw
Trypan Blue kleuring wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van de cellen te evalueren na cholesterol uitputting. Geen verandering in levensvatbaarheid wordt waargenomen tussen PBS behandeld en 10 mM MCD behandelde cellen. Levensvatbaarheid lijkt iets af na behandeling met 30 mM MCD, die verschuldigd kunnen worden verwacht dat het ongeveer 75% afname in cholesterol (een essentieel lipide) waargenomen in de densitometrie analyse (Figuur 6 en Figuur 2B).
Figuur 1. cholesterolgehalte van supernatant na behandeling. Kwantificatie van cholesterol in de vanuit behandelde cellen supernatant toont verrijking MCD vergelijking met 1x PBS. Cholesterol lediging 50 ± 5%, berekend op het totale cholesterol in 1x PBS (supernatant + cellysaat). Foutbalken tonen standaarddeviatie (n = 5).
Figuur 2. TLC van cholesterol in cellysaat en densitometry. Afbeelding van de ontwikkelde TLC-plaat gevisualiseerd met MnCl2 verkolen. Een sterke verlaging van de cholesterol wordt gezien na MβCD behandeling (A). Densitometrische analyse bands vergeleken met de PBS-behandelde controle (weergegeven als 100%) bevestigt trend in Cholesterol kwantificering assay (B Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. geïnfecteerde controle microfoto van behandelde J774 macrofagen. Afbeeldingen van geïnfecteerde J774 cellen genomen bij 200X vergroting. Schaal bar is 50 micrometer. 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B), en 30 mM MβCD (C) behandelde cellen vertonen geen verandering. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Infectie van J774 macrofagen metC. neoformans afbeeldingen van geïnfecteerde J774 cellen genomen op 400X (bovenste rij A.1 - C.1). En 1000x (onderste rij A.2 - C.2) vergroting worden getoond. Geïnternaliseerde C. neoformans cellen verschijnen als blauw-violet bollen met een lichtere ring rondom hen. Cellen behandeld met 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B) en 30 mM MβCD (C) vertonen verschillen in C. neoformans opname. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Fagocytische index. Fagocytische index wordt getoond ten opzichte van de controlegroep die was behandeld met PBS (aangeduid bij 100 voor vergelijking). Fagocytische index werd verminderd met 25% tegen 10mM MβCD behandeling en met bijna 55% met 30 mM behandeling. Foutenbalken tonen de standaarddeviatie van het gemiddelde (n = 4).
Figuur 6. levensvatbaarheid van de cellen. Variaties in de levensvatbaarheid van de cellen door trypaanblauw assay tonen weinig variatie bij het vergelijken van alle drie de behandelingsgroepen. Er is een lichte daling off levensvatbaarheid in 30 mM MβCD behandelingsgroep, die kunnen worden verwacht van uitputting van dergelijke belangrijke component van het membraan. Foutbalken tonen standaarddeviatie (n = 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij het werken met dit protocol is het belangrijk om nauwkeurige celtellingen wanneer plating zoogdiercellen en opsoniserende C. verkrijgen neoformans-cellen. Dit minimaliseert de variatie tussen onderzoeken en zeer nauwkeurig 1: 1 tot doel effectorverhouding gedurende de studie. Het is ook kritisch om de timing van de cholesterol uitputting en infectie coördineren voorkomen opsonized gistcellen of behandelde macrofaag cellen uit rusten bij kamertemperatuur tussen de procedures. Periodes lange wachttijden kan leiden tot verlies van Opsonisatie of het aanvullen van verarmd cholesterol vóór infectie kan beginnen. Als experimenten worden uitgevoerd nauwkeurig de gegevensanalyse maakt conclusies te onderscheiden over de rol van cholesterol in fagocytose.
De beperkingen van de techniek voorkomen conclusies tot de specifieke mechanisme waarmee cholesterol uitputting verlaagt de fagocytose index van macrofaagachtige cellen, en het is onduidelijk of de effect is direct te wijten aan cholesterol of te wijten aan een secundaire mechanisme. Verdere werkzaamheden langs deze ader onderzoekt andere bestanddelen van rafts zoals sphingolipiden of eiwitten bekend om de functie in fagocytose zoals de Fcy-receptor en het complement receptor 3 2. Deze techniek wijzigen om ofwel Opsonisatie gebruiken of aan te vullen alleen kon helpen onderscheid een rol voor cholesterol in één van deze bekende routes of beide. Het is ook belangrijk om te onthouden dat MβCD extracten cholesterol op basis van zijn hydrofobiciteit en grootte, zodat sterolen van een vergelijkbare grootte kan ook worden uitgeput en migreren met een vergelijkbaar percentage cholesterol op een TLC. Het is ook belangrijk op te merken dat cholesterol depletie kan gedeeltelijk invloed macrofaag activatie, dit waarschijnlijk verantwoordelijk voor het geconstateerde verschil in opname het uitvoeren van de infectie in de afwezigheid van IFN-y en LPS worden toont dezelfde verlaging van de opname van C. neoformans (gegevens niet getoond), but is van belang bij het wijzigen van deze techniek om de antischimmel activiteiten van macrofagen en de rol van de activering bestuderen. Deze methode is ook niet ons toelaten om te onderscheiden of cholesterol uitputting heeft geen therapeutische implicaties in schimmelinfectie. Verdere werkzaamheden in vivo met cholesterolverlagende medicijnen en epidemiologische studies van patiënten die cholesterolverlagende geneesmiddelen kan verder verduidelijken een rol van cholesterol depletie in de behandeling van de aandoening en kan een meer selectief cholesterol accumulatie remmen bieden.
Deze procedure kan gemakkelijk worden toegepast om opname van andere pathogenen of vaste deeltjes studie (dwz glasparels) is phagocytized en zorgen voor de studie van fundamentele biologie van fagocytose. Modificaties kunnen zorgen voor de studie van andere aspecten van fagocytose door behandeling van de macrofaag-cellen met enzymen andere membraan componenten of diverse drugs en remmers welke inter kunnen selectief afbrekenest. Ook moet worden opgemerkt dat flowcytometrie een nauwkeuriger en kwantitatief fagocytose karakteriseren kunnen opleveren en kan worden gebruikt om de directe microscopische telling 24 vervangen. Al met al is dit een vrij eenvoudige techniek die kan worden gebruikt als uitgangspunt voor meer diepgaande studies die vragen over lipiden een belangrijke rol in infectie en immuunrespons speelt beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies AI56168, AI71142, AI87541 en AI100631 te MDP. Maurizio Del Poeta is Burroughs Wellcome Investigator in Infectieziekten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations |
| Orbital shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S meaures down to 0.1 mg | |
| Glass Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass bottom confocal dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
- Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
- Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
- Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
- Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
- Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
- Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
- Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
- García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
- Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).
- Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
- Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
- Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
- Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
- Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
- Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
- Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
- Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).
