In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.
Cryptococcosis er en livstruende infeksjon forårsaket av patogene sopper av slekten Cryptococcus. Infeksjon oppstår ved inhalering av sporer, som er i stand til å replikere i den dype lungen. Fagocytose av Cryptococcus av makrofager er en av de måter som sykdommen er i stand til å spre seg inn i det sentrale nervesystemet å forårsake letale Meningoencefalitt. Derfor er studiet av sammenhengen mellom Cryptococcus og makrofager viktig for å forstå utviklingen av infeksjonen. Denne studien beskriver en steg-for-steg-protokollen for å studere makrofag smittsomhet av C. neoformans in vitro. Ved hjelp av denne protokollen, er rollen som verts steroler på verts-patogen interaksjoner studert. Forskjellige konsentrasjoner av metyl – cyklodekstrin (MCD) ble anvendt for å utarme kolesterol fra murin sarkom retikulum-makrofag-lignende cellelinje J774A.1. Kolesterol uttømming ble bekreftet og kvantifiseres både et allment tilgjengeligee kolesterol kvantifisering kit og tynnsjiktskromatografi. Kolesterol utarmet celler ble aktivert med Lipopolysacharide (LPS) og Interferon gamma (IFNy) og infisert med antistoff-opsonisert Cryptococcus neoformans villtype H99-celler ved en effektor-til-mål-forhold på 1: 1. Infiserte celler ble overvåket etter 2 timer inkubasjon med C. neoformans og deres fagocytisk indeks ble beregnet. Kolesterol uttømming resulterte i en signifikant reduksjon i den fagocytisk indeks. De presenterte protokoller gi en hensiktsmessig metode for å etterligne initieringen av infeksjonsprosessen i laboratorieomgivelser og studere rollen til verten lipidsammensetningen på infektiviteten.
Fagocytose er en prosess ved hvilken ekstracellulære enheter blir internalisert av vertsceller. Det er et viktig redskap i immunsystemet arsenal å forsvare seg mot patogener, men prosessen kan ofte undergravd av patogener for å tillate internalisering og sprer seg over hele legemet 1. Fagocytose er mediert ved flere signaleringshendelser som resulterer i festing og engulfment via rearrangementer av vertscellen er cytoskjelettet. "Profesjonell" phagocytes er i stand til å gjenkjenne og binde seg til opsoniner på overflaten av invaderende patogen å signalisere for tilknytning og dannelsen av lamellipodia, som sluker patogenet og danne en phagosome to. Blant de såkalte "profesjonelle" fagocytter er makrofager. Makrofager er høyt spesialiserte celler som utfører beskyttelsesfunksjoner som inkluderer søker ut og eliminere sykdomsfremkallende stoffer, reparere skadet vev, og formidling av betennelse, de fleste avdisse gjennom prosessen med fagocytose 1,2.
Cryptococcus neoformans er en art av patogene gjær som forårsaker en alvorlig sykdom som er kjent som Cryptococcosis. Cryptococcus sporer blir inhalert av verten, og resultere i en lungeinfeksjon som vanligvis er asymptomatiske. Det er antatt at eksponeringen er svært utbredt; et utvalg på 61 barn fra Pediatric Infectious Diseases Clinic ved Bronx-Libanon Hospital Center funnet at alle de spurte hadde antistoffer mot cryptococcal polysakkarid glucuronoxylomannan og andre studier har vist utbredelse i både humant immunsviktvirus (HIV) infisert og infiserte voksne 3, 4. alveolære makrofager er den første linjen i respons til lungeinfeksjon og i de fleste tilfeller med hell klart patogenet. Men i immunsupprimerte individer (f.eks, HIV og AIDS pasienter) gjæren er i stand til å overleve innenfor makrofager. I dissetilfeller kan de makrofager tjene som en nisje for replikering av organismen og kan legge til rette for sin formidling til sentralnervesystemet (CNS) der sykdommen blir fatal 5-8. Det er antatt at makrofager kan selv levere gjær direkte inn i hjernehinnene, hjelper gjær å krysse blod-hjerne barrieren via "trojansk hest" modell 3,9 – 11. Således er det viktig å forstå prosessen med fagocytose og de faktorer som påvirker den, spesielt i cryptococcal infeksjoner.
Tidligere arbeid i andre patogen systemer peker på kolesterol og lipid flåter dannet av kolesterol som å ha en viktig rolle å spille i fagocytose 12-15. Kolesterol er de mest tallrike fettarter i pattedyrceller, og omfatter 25 – 50% av pattedyrcellemembran 16. Det har vist seg å spille en rolle i modulering av biophysical egenskaper av membraner ved å endre sin stivhet 17. Kolesterol og sfingolipider sammen danner lipid mikroområder innenfor membranen kjent som lipid flåter. Lipid flåter har blitt funnet å være involvert i dannelsen av caveolae, samt gi et isolert domene for visse typer signale 16-18. På grunn av deres lille størrelse, er det vanskelig å undersøke lipid flåter in vivo. En nyttig metode for å studere rollen til lipid flåter er å endre sine bestanddeler. Metyl-β-syklodekstrin (MβCD) er en forbindelse som har blitt funnet å utarme kolesterol fra pattedyrmembraner og er vanlig brukt for å studere rollen til lipid flåter 18.
I denne protokollen presenterer vi en fremgangsmåte for å utarme kolesterol fra vertscellemembraner og kvantifisere effekten av utarming på evnen av vertscellene til fagocyttere C. neoformans in vitro. Denne fremgangsmåten gjør bruk av cellekultur techniques på en udødelig makrofag som cellelinje (J774A.1) som en modell for infeksjon. Kolesterol uttømming ble utført ved eksponering for MβCD, som har en hydrofob kjerne bestemt av størrelsen av steroler og er i stand til å virke som et sluk for kolesterol for å trekke den ut av membranen 19. Kolesterol uttømming ble målt kvantitativt ved å bruke et kommersielt tilgjengelig kit og kvalitativt ved hjelp av en modifisert Bligh-Dyer lipid ekstraksjon fulgt ved tynnsjiktskromatografi (TLC): 20. . Fagocytose ble målt ved å infisere cellelinje med en kultur av opsonisert gjær blandet med en cocktail av interferon-γ og lipopolysakkarid for aktivering av makrofager Cryptococcus ble opsonisert ved hjelp av en glucuronoxylomannan (GXM) antistoff 21-23. Farging og mikroskopi eksperimenter tillatt for visualisering av cellene og beregning av fagocytisk indeks for å bedømme graden av fagocytose. Til sammen denne protokollen dBetegner en grunnleggende fremgangsmåte som integrerer endring av lipid-sammensetningen med et fysiologisk prosess.
I arbeidet med denne protokollen, er det viktig å oppnå nøyaktige celletellinger ved plating pattedyrceller og opsonizing C. neoformans celler. Dette reduserer variasjonen mellom forsøk og sikrer en nøyaktig 1: 1 effektor til mål-forhold gjennom hele studien. Det er også viktig å koordinere tidsberegningen av kolesterol uttømming og infeksjon for å hindre de opsoniserte gjærceller eller behandlede makrofagceller fra hvile ved romtemperatur i mellom prosedyrene. Lange ventetider kan føre til tap av a…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd AI56168, AI71142, AI87541 og AI100631 til MDP. Maurizio Del Poeta er Burroughs Wellcome Investigator i Infectious Diseases.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
Methyl-β-Cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations |
Orbital Shaker | Labline | ||
Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
TLC Chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
Fume Hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
6-Well Plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
Cell Scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
Votex Mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S Meaures down to .1 mg | |
Glass Pasteur Pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
Petroleum Ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
Iodine Chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
Manganese Chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
Glass Bottom Confocal Dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L. |
Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C. |
Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution |
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL | ||
Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |