Abstract
Cryptococcosis er en livstruende infeksjon forårsaket av patogene sopper av slekten Cryptococcus. Infeksjon oppstår ved inhalering av sporer, som er i stand til å replikere i den dype lungen. Fagocytose av Cryptococcus av makrofager er en av de måter som sykdommen er i stand til å spre seg inn i det sentrale nervesystemet å forårsake letale Meningoencefalitt. Derfor er studiet av sammenhengen mellom Cryptococcus og makrofager viktig for å forstå utviklingen av infeksjonen. Denne studien beskriver en steg-for-steg-protokollen for å studere makrofag smittsomhet av C. neoformans in vitro. Ved hjelp av denne protokollen, er rollen som verts steroler på verts-patogen interaksjoner studert. Forskjellige konsentrasjoner av metyl - cyklodekstrin (MCD) ble anvendt for å utarme kolesterol fra murin sarkom retikulum-makrofag-lignende cellelinje J774A.1. Kolesterol uttømming ble bekreftet og kvantifiseres både et allment tilgjengeligee kolesterol kvantifisering kit og tynnsjiktskromatografi. Kolesterol utarmet celler ble aktivert med Lipopolysacharide (LPS) og Interferon gamma (IFNy) og infisert med antistoff-opsonisert Cryptococcus neoformans villtype H99-celler ved en effektor-til-mål-forhold på 1: 1. Infiserte celler ble overvåket etter 2 timer inkubasjon med C. neoformans og deres fagocytisk indeks ble beregnet. Kolesterol uttømming resulterte i en signifikant reduksjon i den fagocytisk indeks. De presenterte protokoller gi en hensiktsmessig metode for å etterligne initieringen av infeksjonsprosessen i laboratorieomgivelser og studere rollen til verten lipidsammensetningen på infektiviteten.
Introduction
Fagocytose er en prosess ved hvilken ekstracellulære enheter blir internalisert av vertsceller. Det er et viktig redskap i immunsystemet arsenal å forsvare seg mot patogener, men prosessen kan ofte undergravd av patogener for å tillate internalisering og sprer seg over hele legemet 1. Fagocytose er mediert ved flere signaleringshendelser som resulterer i festing og engulfment via rearrangementer av vertscellen er cytoskjelettet. "Profesjonell" phagocytes er i stand til å gjenkjenne og binde seg til opsoniner på overflaten av invaderende patogen å signalisere for tilknytning og dannelsen av lamellipodia, som sluker patogenet og danne en phagosome to. Blant de såkalte "profesjonelle" fagocytter er makrofager. Makrofager er høyt spesialiserte celler som utfører beskyttelsesfunksjoner som inkluderer søker ut og eliminere sykdomsfremkallende stoffer, reparere skadet vev, og formidling av betennelse, de fleste avdisse gjennom prosessen med fagocytose 1,2.
Cryptococcus neoformans er en art av patogene gjær som forårsaker en alvorlig sykdom som er kjent som Cryptococcosis. Cryptococcus sporer blir inhalert av verten, og resultere i en lungeinfeksjon som vanligvis er asymptomatiske. Det er antatt at eksponeringen er svært utbredt; et utvalg på 61 barn fra Pediatric Infectious Diseases Clinic ved Bronx-Libanon Hospital Center funnet at alle de spurte hadde antistoffer mot cryptococcal polysakkarid glucuronoxylomannan og andre studier har vist utbredelse i både humant immunsviktvirus (HIV) infisert og infiserte voksne 3, 4. alveolære makrofager er den første linjen i respons til lungeinfeksjon og i de fleste tilfeller med hell klart patogenet. Men i immunsupprimerte individer (f.eks, HIV og AIDS pasienter) gjæren er i stand til å overleve innenfor makrofager. I dissetilfeller kan de makrofager tjene som en nisje for replikering av organismen og kan legge til rette for sin formidling til sentralnervesystemet (CNS) der sykdommen blir fatal 5-8. Det er antatt at makrofager kan selv levere gjær direkte inn i hjernehinnene, hjelper gjær å krysse blod-hjerne barrieren via "trojansk hest" modell 3,9 - 11. Således er det viktig å forstå prosessen med fagocytose og de faktorer som påvirker den, spesielt i cryptococcal infeksjoner.
Tidligere arbeid i andre patogen systemer peker på kolesterol og lipid flåter dannet av kolesterol som å ha en viktig rolle å spille i fagocytose 12-15. Kolesterol er de mest tallrike fettarter i pattedyrceller, og omfatter 25 - 50% av pattedyrcellemembran 16. Det har vist seg å spille en rolle i modulering av biophysical egenskaper av membraner ved å endre sin stivhet 17. Kolesterol og sfingolipider sammen danner lipid mikroområder innenfor membranen kjent som lipid flåter. Lipid flåter har blitt funnet å være involvert i dannelsen av caveolae, samt gi et isolert domene for visse typer signale 16-18. På grunn av deres lille størrelse, er det vanskelig å undersøke lipid flåter in vivo. En nyttig metode for å studere rollen til lipid flåter er å endre sine bestanddeler. Metyl-β-syklodekstrin (MβCD) er en forbindelse som har blitt funnet å utarme kolesterol fra pattedyrmembraner og er vanlig brukt for å studere rollen til lipid flåter 18.
I denne protokollen presenterer vi en fremgangsmåte for å utarme kolesterol fra vertscellemembraner og kvantifisere effekten av utarming på evnen av vertscellene til fagocyttere C. neoformans in vitro. Denne fremgangsmåten gjør bruk av cellekultur techniques på en udødelig makrofag som cellelinje (J774A.1) som en modell for infeksjon. Kolesterol uttømming ble utført ved eksponering for MβCD, som har en hydrofob kjerne bestemt av størrelsen av steroler og er i stand til å virke som et sluk for kolesterol for å trekke den ut av membranen 19. Kolesterol uttømming ble målt kvantitativt ved å bruke et kommersielt tilgjengelig kit og kvalitativt ved hjelp av en modifisert Bligh-Dyer lipid ekstraksjon fulgt ved tynnsjiktskromatografi (TLC): 20. . Fagocytose ble målt ved å infisere cellelinje med en kultur av opsonisert gjær blandet med en cocktail av interferon-γ og lipopolysakkarid for aktivering av makrofager Cryptococcus ble opsonisert ved hjelp av en glucuronoxylomannan (GXM) antistoff 21-23. Farging og mikroskopi eksperimenter tillatt for visualisering av cellene og beregning av fagocytisk indeks for å bedømme graden av fagocytose. Til sammen denne protokollen dBetegner en grunnleggende fremgangsmåte som integrerer endring av lipid-sammensetningen med et fysiologisk prosess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kolesterol Nedbryting av J774A.1 Celler med MβCD
- I et sterilt biosikkerhet skapet, frø 10 5 J774A.1 makrofag-lignende celler per brønn på en 96-brønners cellekulturplate i 200 ul av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S). Inkuber ved 37 ° C og 5% CO 2 O / N.
- Fjern mediet fra cellemonolaget og vaske cellene to ganger med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) som har blitt filtrert eller autoklaveres.
- Tilsett 200 ul av MβCD oppløsning ved den ønskede konsentrasjon (10 mM eller 30 mM i PBS), eller 1 x PBS som kontroll, og inkuber i 30 min ved 37 ° C med risting. Fjern supernatant og reserve ved RT for kvantitativ analyse med kommersielt tilgjengelig kit umiddelbart etter inngrepet.
- Vask cellene to til tre ganger med 1 x PBS eller serum-fritt DMEM og fortsette med infeksjon eller lyse celler ved pipetting to til tre ganger med deionisert H2O for analyse med tynnsjiktkromatografi eller med et kit.
MERK: Etter kolesterol uttømming en kommersielt tilgjengelig kolesterol kvantifisering kit kan brukes. Se avsnitt materialer for detaljer. Følg produsentens instruksjoner som er skrevet.
2. Observasjon av kolesterolinnholdet ved tynnsjiktskromatografi (TLC)
- Vask en TLC tank to ganger med aceton og en gang med en oppløsning av petroleumeter: dietyleter: eddiksyre (65: 30: 1 på volumbasis). Mette tank med petroleumeter: dietyleter: eddiksyre (65: 30: 1 etter volum) løsning, og la O / N.
MERK: Organiske løsemidler skal alltid brukes under en avtrekkshette for å hindre inhalering av damp. Hansker og labfrakk Det skal til enhver tid. Eddiksyre er en sterk syre og bør brukes med forsiktighet. - I en steril biosikkerhet kabinett, frø 10 6 J774A.1 makrolignende celler per brønn på en 6-brønnen cell kulturplate i et volum på 5 ml varm DMEM supplert med 10% FBS og 1% P / S. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
- Utarme makrofager av kolesterol ved å følge trinn 01.02 til 01.04, erstatte en ml for 200 mL der det er aktuelt å ta hensyn til større godt størrelse.
- Legg 500 pl trypsin-EDTA til hver brønn, inkuber i 3 min ved 37 ° C og forsiktig skrape celler med en celleskrape.
- Overfør til et mikrosentrifugerør og tilsett ytterligere 500 ul varm DMEM supplert med 10% FBS og 1% P / S.
- Spinn-celler i 5 min ved 300 x g og fjern supernatanten.
- Legg ytterligere 500 ul varm DMEM supplert med 10% FBS og 1% P / S til cellepelleten og resuspender nøye ved å pipettere opp og ned.
- Fjern 10 ul av celler og telle celler i et hemocytometer. Normalisere cellekonsentrasjoner fra hver prøve og tilsett et likt antall celler i glassrør.
MERK: På dette trinnet, kan manvelge å kombinere cellene fra de samme behandlingsgrupper for å oppnå et mer konsentrert endelige lipidekstraktet. - Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min ved RT og fjerne media.
- Tilsett 2 ml metanol og virvle. Deretter kan du legge en ml kloroform og virvle. Kontroller fase status for å sikre at løsningen i monofasisk.
MERK: Rør kan lagres ved 4 ° CO / N. - Sentrifuger ved 1700 x g i 10 min ved RT og Overfør supernatanten til et nytt rør
- Legg ytterligere 1 ml kloroform etterfulgt av en ml dH 2 O. Vortex to ganger for 30 sek. Sentrifuger ved 1700 x g i 5 min ved RT.
- Veie et glassrør på en følsom balanse og bruke et glass Pasteur pipette for å overføre den nedre fase inn i glassrøret med kjent vekt.
- Tørk ned lipider i en sentrifugal-fordamper inntil tørrhet (ca. 2 timer). Veie rør med tørkede lipider og beregne den tørre lipidvekten.
MERK: Tørre lipider kan lagres i -20 ° C inntil de er klare til å utføre TLC. - Fortynn tørkede lipider i tilstrekkelig kloroform til å normalisere konsentrasjonen av lipid (vanligvis 20 - 50 ul) og lasten 20 ul av den fortynnede lipid på en silika-TLC-plate. Lasten 20 ug kolesterol fortynnet i 20 ul av kloroform som en standard.
- Legg tørkede TLC-platen til den mettede TLC tanken og tillate løsningsmidlet å migrere opp til 1 cm før platekanten. Fjern TLC plate fra tanken og la den tørke ca 5 min.
- Visualisere lipider ved å plassere i en joddamp tank for å sjekke migrasjon. Ta ut og la flekker å visne i ca 10 - 15 min under panseret.
MERK: Jod er et innåndingsfare. Bruk alltid under en avtrekkshette. - Fremstille en løsning for nøytralt lipid farging ved å kombinere 60 ml metanol med 60 ml deionisert H2O, 4 ml svovelsyre, og 630 mg av manganklorid.
- Sakte og forsiktig dyppe TLC-platen inn i nøytral lipid flekker løsning i en skuff og fjerne uten sloughing av silika layer.
MERK: Den nøytrale lipid flekker løsning kan brukes om igjen flere ganger og så det kan hentes fra skuffen og plassert tilbake i en flaske for senere bruk. - Tillat plate tørke under panseret ved RT inntil alle boblene har forsvunnet. Varm TLC-plate på en varmeblokk satt til 160 ° C og røye til den ønskede fargen.
MERK: En densitometry program som Vision Works LS kan brukes for å kvantifisere de forkullede band å sammenligne lipid prøver.
3. Infeksjon av makrofager med C. neoformans (H99)
- I et sterilt biosikkerhet skapet, frø 10 5 makrofag-lignende celler per brønn på en 96-brønners cellekulturplate i 200 ul DMEM supplert med 10% FBS og 1% P / S. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2, 5% CO 2 O / N.
MERK: Infeksjon kan også gjøres i glassbunn konfokale retter for enklere bildebehandling; alle beløp forblir den samme. - Dyrke en kultur av C. neoformans (H99)ved å inokulere 10 ml YNB med en koloni oppnådd fra et truffet plate og inkubering av det O / N ved 30 ° C med risting.
- Vask og telle C. neoformans (H99) celler.
- Sentrifuger C. neoformans O / N kulturen ved 1700 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Fjern media og kast. Vask cellene med 5 ml av 1 x PBS. Sentrifuger ved 1700 x g i 10 min ved 4 ° C.
- Fjern PBS og vask med 5 ml filtrert 1x PBS. Sentrifuger ved 1700 x g i 10 min ved 4 ° C. Gjenta dette trinnet to ganger til.
- Fjern PBS og resuspender i 5 ml 1 x PBS.
- Foreta en seriell fortynning i PBS for å oppnå en 1: 500 fortynning av den vaskede kultur.
- Tilsett 100 ul av den opprinnelige prøven til 900 ul av 1 x PBS for å oppnå en fortynning på 1:10.
- Tilsett 100 ul 1:10 fortynnet prøve til 900 ul av 1 x PBS for å oppnå en 1: 100 fortynning.
- Tilsett 200 ul av 1: 100 fortynnet prøve til 800 ul av 1 x PBS for å oppnå en 1: 500 fortynningenepå
- Ta 10 ul av 1: 500 fortynning, og regne med hemocytometer for å beregne antall celler.
- Forberede arbeidsløsning for å aktivere makrofager og opsonizing C. neoformans.
- Fortynne LPS og IFNy 100x fra stamløsninger ved å legge til 10 pl til 990 mL.
MERK: LPS og IFNy brukes til å forbedre fagocytisk opptak, men er ikke nødvendige for fagocytose. Hvis det er en interesse i fungicid aktivitet av makrofager, utfører aktivering O / N ved 37 ° C med risting før infeksjon. - Per prøve kombinere 7,5 pl av fortynnede LPS, 1,25 ul fortynnet IFNy, 1,25 mL av GXM antistoff og volumet av C. neoformans kultur som gir 1,25 x 10 5 celler. Bringe volumet opp til 250 pl multiplisert med antall prøver med DMEM supplert med 10% FBS og 1% P / S.
- Vortex og inkuber løsningen i 20 minutter ved 37 ° C med risting.
MERK:Kolesterol mangel (trinn 1,2 - 1,4) kan gjøres samtidig med opsonization trinn. Sørg for å behandle makrofager før kombinere arbeidsløsningen, som opsonisert celler bør optimalt brukes ikke lenger enn 20 min etter trinn 3.4.3 inkubasjon.
- Fortynne LPS og IFNy 100x fra stamløsninger ved å legge til 10 pl til 990 mL.
- Infisere Makrofager
- Vask makrofager to ganger med serum gratis DMEM og legge 200 III opsonisert C. neoformans arbeidsløsning til hver brønn.
- Inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
- Fix og Stain Cells
- Fjern media og vaske cellene to ganger med DMEM.
- Luft tørke cellemonolaget i 10 minutter og tilsett 200 ul iskald metanol for å fiksere cellene.
- Inkuber i 15 min ved RT og fjerne eventuelle gjenværende metanol.
- Tilsett 200 ul av 10 x Giemsa og inkuberes i 5 minutter ved RT.
- Vask 2-3 ganger med avionisert vann og tørk O / N med hetten av.
MERK: Imaging kan gjøres neste dag eller opptil en uke following farging.
- Visualisere og grev
- Ved hjelp av et mikroskop, teller 300 celler per datapunkt (hvis det er to av samme behandling telle 150 per brønn) og noterer antall infiserte makrofager og antall oppslukt Cryptococcus celler.
MERK: For å sikre enda prøvetaking per datapunkt bruk to plater per tilstand, velger tre ikke-overlappende områder per plate og telle 50 celler per område. - Beregn fagocytisk indeks ved å multiplisere prosentandelen av infiserte makrofager av det midlere antall av C. neoformans per makrofag. Normal fagocytisk indeks ved å uttrykke verdiene som en prosentandel av 1 x PBS behandlede kontroll. Etter flere forsøk kalkulere middelverdien og standardavviket for middelverdien til å bestemme tendenser i fagocytisk indeks. Bruk student t-test for å fastslå betydning.
- Ta mikrografer av celler på 1,000X eller 400X forstørrelse.
- Ved hjelp av et mikroskop, teller 300 celler per datapunkt (hvis det er to av samme behandling telle 150 per brønn) og noterer antall infiserte makrofager og antall oppslukt Cryptococcus celler.
4. trypanblått analysen
- I et sterilt biosikkerhet skapet, frø 10 6 makrofag-lignende celler per brønn på en 6-brønners cellekulturplate i et volum på 5 ml av Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin . Inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
- Utarme makrofager av kolesterol ved å følge trinn 1,2 - 1,4 erstatte 2 ml for 200 mL der det er aktuelt å ta hensyn til større godt størrelse.
MERK: Sørg for å inkludere en kontroll behandlet med 1x PBS, samt en kontroll som skrapes før noen behandling. - Legg 500 ul av 1 x PBS til hver brønn og forsiktig skrape celler med en celleskrape. Overfør til et mikrosentrifugerør og suspendere cellene ved forsiktig pipettering opp og ned.
- Fjerne 10 mL av celler og flekken med en fil av 4% Trypan blå.
- Tell cellene med et hemocytometer, og levedyktigheten beregne ved hjelp av følgende ligning:% levedyktighet = [1 - (Blå celler / totalt antall celler)]x 100. Normaliser verdier til kontrollen som var ubehandlet. Etter flere forsøk kalkulere middelverdien og standardavviket for å bestemme tendenser i levedyktighet. Bruk student t-test for å fastslå betydning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kolesterol Nedbryting
Analyse av supernatanten reservert i trinn 1.3 i protokollen ved å følge produsentens instruksjoner i Amplex Red Kolesterol Assay kit gir en forhøyet konsentrasjon av kolesterol i MβCD behandlede prøve som sammenlignet med 1 x PBS kontrollen. Avhengig av celletypen og MβCD konsentrasjon anvendt kolesterol uttømming kan variere. For J774 behandlet med 10 mM MβCD, ble en reduksjon av omtrent 50% observert. Nedbrytning kan beregnes ved hjelp av verdier erholdt fra supernatanten og cellelysat samlet i trinn 1.4 (figur 1).
Cellelysat analysert ved hjelp av TLC viser en markert nedgang i farging av kolesterol i celler behandlet med økende konsentrasjon av MβCD (figur 2A). Densitometri analyse av TLC viser en lignende tendens i den kvantitative analysen (figur 2B). Den Bligh-Dyer metoden gir en grov extract av totale lipider, og det er viktig å opprettholde passende separasjon av lipider for å identifisere den riktige båndet anvendelse av kolesterol standard.
Infeksjon
Etter å ha fulgt smittemåten, forblir celler levd og intakt. Cellemorfologi forblir uendret mellom behandlingsgruppene. En kontrollgruppe som ikke har blitt eksponert for C. neoformans fungerer som en kontrollpost (figur 3). Det er mulig å oppnå suboptimale resultater og kan manifestere seg som lysering av celler og andre unormale morfologi. Den mest sannsynlige årsak er forurensning av cellelinjen eller reagenser som brukes i fremgangsmåten. Mikrografer av optimalt infiserte celler viser tydelig C. neoformans omsluttet innenfor de mammalske celler. Forskjeller i antall phagocytized gjær kan bli bemerket av observasjon mellom behandlingsgruppene (figur 4). Etter beregning phagocytic indeksen fra 300 makrofagceller per behandlingsgruppe enreduksjon av fagocytisk indeks er funnet i kolesterol utarmet celler (Figur 5). Reduksjonen i den fagocytisk indeks synes ikke å være avhengig av potensialforskjeller i makrofag aktivering, selv om de kan oppstå. Utføring av infeksjon i fravær av makrofag-aktivatorer, men etter behandling med MCD resulterer i en tilsvarende reduksjon av fagocytisk indeks (data ikke vist).
Trypanblått
Trypanblått farging brukes til å vurdere levedyktigheten av celler etter kolesterol uttømming. Ingen endring i levedyktighet er observert mellom PBS behandlet og 10mm MCD behandlet celler. Levedyktighet ser ut til å slippe ut litt etter behandling med 30 mM MCD, noe som kan ventes på grunn av den omtrent 75% reduksjon i kolesterol (et vesentlig lipid) observert i densitometri analyse (figur 6 og figur 2B).
Figur 1. Kolesterol innholdet av supernatanten etter behandling. Kvantifisering av kolesterol i supernatanten oppsamlet fra behandlede celler viser anrikning i MCD sammenlignet med 1 x PBS. Kolesterol uttømming er 50 ± 5% beregnet ut fra totalkolesterol i 1 x PBS (supernatant + cellelysat). Feilsøylene viser standardavvik (n = 5).
Figur 2. TLC av kolesterol i cellelysat og densitometry. Bilde av utviklet TLC plate visualisert med MnCl2 forkulling. En markert nedgang i kolesterol er sett etter MβCD behandling (A). Densitometri analyse av båndene i forhold til PBS-behandlet kontrollgruppe (vist som 100%) bekrefter trend funnet i Cholesterol kvantifisering assay (B Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Uinfiserte kontrollmikrografer av behandlede J774 makrofager. Bilder av uinfiserte J774 celler tatt ved 200X forstørrelse. Målestokk er 50 mikrometer. 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B), og 30 mM MβCD (C) behandlede celler viser ingen endring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Infeksjon av J774 makrofager medC. neoformans Bilder av infiserte J774 celler tatt på 400X (øverste rad A.1 - C.1). Og 1,000X (nederste rad A.2 - C.2) forstørrelse vises. Internalisert C. neoformans celler vises som blå-fiolett kuler med en lysere ring rundt dem. Celler behandlet med 1 x PBS (A), 10 mM MβCD (B), og 30 mM MβCD (C) viser forskjeller i C. neoformans opptak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. fagocytisk indeks. Fagocytisk indeks er vist i forhold til kontrollgruppen som ble behandlet med PBS (markert ved 100 for sammenligning). Fagocytisk indeks ble redusert med 25% etter 10mM MβCD behandling og med nesten 55% ved 30 mM behandling. Feilsøylene viser standardavvik av gjennomsnittet (n = 4).
Figur 6. Celleviabilitet. Variasjoner i celle levedyktighet ved trypanblått analysen viser liten variasjon når man sammenligner alle tre behandlingsgruppene. Det er en liten nedgang av i levedyktighet i 30 mM MβCD behandlingsgruppen, som kan forventes fra utarming av en så stor del av membranen. Feilfelt viser standardavvik (n = 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I arbeidet med denne protokollen, er det viktig å oppnå nøyaktige celletellinger ved plating pattedyrceller og opsonizing C. neoformans celler. Dette reduserer variasjonen mellom forsøk og sikrer en nøyaktig 1: 1 effektor til mål-forhold gjennom hele studien. Det er også viktig å koordinere tidsberegningen av kolesterol uttømming og infeksjon for å hindre de opsoniserte gjærceller eller behandlede makrofagceller fra hvile ved romtemperatur i mellom prosedyrene. Lange ventetider kan føre til tap av antistoff opsonization eller påfyll av utarmet kolesterol før infeksjon kan begynne. Hvis forsøkene er gjort med presisjon dataanalyse gir konklusjoner som skal bedømmes om rollen av kolesterol i fagocytose.
Begrensningene av den teknikk som forhindrer noen konklusjoner med hensyn til den spesifikke mekanismen som kolesterol uttømming senker fagocytisk indeks av makrofag lignende celler, og det er uklart om effekt er direkte følge av kolesterol eller på grunn av en sekundær mekanisme. Videre arbeid langs denne vene undersøker andre bestanddeler av lipid flåter som sfingolipider eller proteiner kjent funksjon i fagocytose som Fcy reseptoren og komplement receptor 3 2. Endring av denne teknikken til å bruke enten antistoff opsonization eller utfylle alene kunne hjelpe skille en rolle for kolesterol i en eller begge av disse kjente veier. Det er også viktig å huske at MβCD ekstrakter kolesterol basert på sin hydrofobisiteten og størrelse, og dermed steroler av samme størrelse kan også bli tømt og vil migrere like hyppig som kolesterol på en TLC. Det er også viktig å merke seg at kolesterol uttømming kan delvis påvirke makrofagaktivering, er dette neppe være ansvarlig for forskjellen observert i opptak som utfører infeksjon i fravær av IFN og LPS viser den samme reduksjon i opptaket av C. neoformans (data ikke vist), but det er av interesse når du endrer denne teknikken til å studere anti-sopp aktiviteter av makrofager og rollen til aktivering. Denne metoden heller ikke tillate oss å skjelne om kolesterol uttømming har noen terapeutiske implikasjoner i soppinfeksjon. Videre arbeid in vivo med kolesterol-senkende midler og epidemiologiske studier av pasienter som bruker kolesterolsenkende medikamenter kan ytterligere belyse en rolle for kolesterol uttømming ved behandling av sykdommen, og kan gi en mer selektiv måte å inhibere kolesterol akkumulering.
Denne fremgangsmåten kan lett anvendes for å studere opptak av andre patogener eller faste partikler (dvs. glasskuler) blir phagocytized og tillater studiet av grunnleggende biologi av fagocytose. Modifikasjoner kan tillate for studiet av andre aspekter ved fagocytose ved behandling av makrofagceller med enzymer for å selektivt degradere andre membrankomponenter, eller forskjellige legemidler og inhibitorer som kan være av interest. Det bør også bemerkes at flowcytometri kan utgjøre en mer nøyaktig og kvantitativ måte å karakter fagocytose og kan brukes til å erstatte den direkte mikroskopisk telling 24. Alt i alt er dette en ganske enkel teknikk som kan brukes som et utgangspunkt for mer dyptgående studier som svarer på spørsmål om hvordan lipider kan spille en viktig rolle i infeksjon og immunrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd AI56168, AI71142, AI87541 og AI100631 til MDP. Maurizio Del Poeta er Burroughs Wellcome Investigator i Infectious Diseases.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations |
| Orbital shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S meaures down to 0.1 mg | |
| Glass Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass bottom confocal dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
- Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
- Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
- Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
- Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
- Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
- Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
- Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
- García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
- Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).
- Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
- Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
- Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
- Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
- Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
- Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
- Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
- Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).
