EPA Method 1615 Mätning av Enterovirus och Norovirus förekomst i vatten efter kultur och RT-qPCR. II. Total odlingsbara virus Assay

Summary

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Abstract

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency’s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Introduction

Enter virus är en blandad grupp av virus som infekterar människan tarmsystem och som överförs via fekal-oralt. Dessa virus anger yt- och grundvatten genom reningsverket och septisk tank avlopp, felaktigt utformade eller trasiga septiktankar, brutna avloppsledningar kombinerade avlopp svämmar över, och andra punkt och diffusa källor ^1-4. Mänskliga infektioner och sjukdomar från vattenburna virus ske via konsumtion av förorenat eller otillräckligt desinficeras vatten eller genom rekreationsvattenkontakt. Sjukdomssymptomen kan innebära mild till svår gastroenterit; konjunktivit; feber; övre andnöd; handen, mul- och klövsjuka; myokardit; aseptisk meningit; encefalit; förlamning; sepsis ^5-8, och död ^9,10.

USEPA metod 1615 ger ett förfarande för att mäta infektiösa enterviruspartiklar i miljö- och dricka vatten. Dessa vatten kan innehålla enblandning av infektiösa och icke-infektiösa virioner, men bara de infektiösa partiklar utgör en potentiell hälsorisk. Infektiösa viruspartiklar förlorar smitt tiden i miljö- och dricka vatten från förlust av protein kapsid integritet, skador på nukleinsyror på grund av UV-strålning från solljus, och skador på grund av alla desinfektionsmedel som kan finnas ^11-13. Den totala odlingsbara virus förfarande som anges i metoden är baserad på produktion av cytopatiska effekter (CPE) i Buffalo Green Monkey kidney (BGM) cellinje. Denna cellinje valdes på grund av dess omfattande användning i miljö virologi fält ^14,15, trots att utbudet av smittsamma virustyper som upptäcks begränsas i första hand till vissa enterovirus ^15. Syftet med detta dokument är att beskriva metod 1615 rutiner för eluering av fem-tums elektropatronfilter, sekundär koncentration, och mätning av den totala odlingsbara virus. En utvärdering avövergripande metod beskrivs i Cashdollar et al. ^16.

Protocol

OBS: Se kompletterande material under rubrik S1 för en lista över definitioner. QA förfaranden i samband med USEPA metod 1615 beskrivs i kompletterande material under rubrik S2. 1. Filter Eluering ordningen första Eluering Placera 500 ml av buffrad 1,5% köttextrakt, pH 9,0, värmdes till rumstemperatur i en graderad cylinder. Öppna filterpatronhöljet och tillsätt en tillräcklig mängd av biffextrakt för att täcka elektrofiltret helt. Byt locket filterhuset och häll den återstående köttextrakt i en steril bägare. Efter en minut av kontakttid, passera köttextrakt lösning i huset tillsammans med det som finns kvar i den sterila bägaren långsamt genom filtret med hjälp av en tryckbehållare eller peristaltisk pump. Samla upp eluatet i en 2 liters glasbägare. andra eluering Upprepa steg 1,1 med hjälp av ytterligare 500 ml buffrat 1,5% köttextrakt, Men öka kontakttiden i steg 1.1.2 till 15 minuter. Tillsätt köttextrakt från andra elueringen till 2 L bägare innehållande det från den första elueringen. Lägg till en steril omrörare till bägaren. 2. Organic Flock Koncentration ordningen Sterilisera en kombination av typen pH-elektrod med 0,525% natriumhypoklorit under minst fem minuter. Skölj elektroden med sterila dH 2 O och sedan deklorera med 0,05 M natriumtiosulfat. Kalibrera pH-mätaren med hjälp av pH 4 och 7 standarder. Placera bägaren innehållande eluatet på en omrörningsplatta. Vända på plattan och öka omrörningshastigheten till dess att en virvel bildas. Justera pH hos eluatet till 3,5 ± 0,1 långsamt genom droppvis tillsats av 1,2 M HCl till eluatet. Tillsätt HCl droppvis eftersom snabb tillsats kommer att inaktivera virus. Under denna tid eluatet blir grumlig som en fällning börjar bildas. Minska blandnings speed till en långsam rör och sedan fortsätta att övervaka och upprätthålla pH i eluatet vid 3,5 ± 0,1 vid rumstemperatur under 30 minuter. Häll den utfällda köttextrakt suspensionen i en eller flera centrifugflaskor och centrifugera i 15 min vid 2500 xg vid 4 ° C. Avlägsna flaskorna från centrifugen och antingen aspirera eller långsamt dekantera supernatanten för att förhindra förlusten av det pelleterade fällningen. Kassera supernatanten. OBS: Det kan finnas stora skillnader mellan köttextrakt massor i kvantitet och kvalitet av fällningen. Fällningen som produceras från vissa partier kommer att upplösas snabbt medan det från andra partier upplöses med svårighet. Tillsätts 30 ml 0,15 M natriumfosfat till centrifugflaska innehållande fällningen. Använda 0,15 M natriumfosfat, pH 9,0 för fällningar från köttextrakt massor som löses upp inom 5 minuter. Rör om under 10 min efter fällningen är helt upplöst, och sedan gå omedelbart till steg 2,7. Använda 0,15 M natriumfosfat, pH 7,0 till 7,5 för alla andra fällningar. Rör om under 10 till 15 min för att lösa upp, eller för svårare fällningar, bryta upp dem med en steril spatel, genom att upprepade gånger dra lösningen upp och ner under omrörning med en pipett, genom att skaka fällningen vid 160 rpm på en orbital skakanordning, eller genom en kombination av dessa förfaranden. OBS: Om du använder mer än en centrifug flaska, kombinera fällningar som använder mindre än 30 ml natriumfosfat och sedan använda den återstående delen av de 30 ml för att skölja flaskorna efter kombinera fällningarna i en flaska eller bägare. Om den kombinerade fällningen är i ett plant bottencentrifugflaska, tillsätt en omrörarstav till flaskan. Gå till steg 2.6.5. Om den kombinerade fällningen i en centrifugflaska med en konisk botten, överför till en liten glasbägare och tillsätt en omrörare till bägaren. Placera flaskan eller bägare på en magnetomrörare, och rör tills precipitate hade löst sig fullständigt. Åter sterilisera en kombination typ pH-elektrod med 0,525% natriumhypoklorit och deklorera med 0,05 M natriumtiosulfat såsom beskrivits i steg 2,1. Kalibrera pH-mätare med hjälp av pH 7 och 10 standarder. Långsamt justera pH för den fullständigt upplösta fällningen till 9,0 med 1 M NaOH och sedan rör om i 10 min. Avlägsna omrörarstav och centrifugera den upplösta fällningen under 10 min vid 4,000-10,000 xg och 4 ° C. Häll försiktigt supernatanten i en glasbägare utan att störa pelleten. Lägg en omrörare till bägaren och kasta pelleten. Placera bägaren på en magnetisk omrörare och rör om lösningen. Tillsätt 1,2 M HCl droppvis för att justera pH till 7,0-7,5. Filtersterilisera supernatanten genom passage genom ett steriliseringsfilter som innehåller ett förfilter som hade förbehandlats med 15 ml 1,5% biffextrakt, 0,05 M glycin, pH 7,0-7,5. Analys Prov Volume (S) beräkningar: Använd ekvation 1 för att beräkna S för alla testprover utom Lab spetsat blank och Lab Reagens Blank, ekvation 1 där D (Volym Original vattenprov Analyserad) är 500 L för grundvatten, TSV (totala provvolymen) är volymen av provfältet passerat genom 5-tums elektropatronfilter emot av laboratoriet, och FCSV (Final Koncentrerad Provvolym) är volymen efter filtrering i steg 2,10. Ett exempel visas i kompletterande material avsnitt S4.1. Beräkna S för Lab förstärkta blank (LFB, dvs en positiv kvalitetskontroll använder seedad reagenskvalitet vatten) och Lab Reagens Blank (LRB, dvs en negativ kvalitetskontroll med hjälp av reagenskvalitet vatten) genom att multiplicera FCSV med 0,3. Dela upp FCSV i three delprover. Förbereda delprover 1 och 2 med en volym som är lika med 1,04 gånger den Assay Provvolym. Frysa dessa delprov vid eller under -70 ° C, om de inte kan analyseras med hjälp av den totala odlingsbara virus analys (delprov 1, steg 4) eller behandlats för molekylära analyser (ej visade) inom 24 timmar; annars, håll vid 4 ° C. Frysa den återstående volymen (delprov 3) vid eller under -70 ° C. Beräkna inokulatet volymen genom att dividera S med 10. 3. Totalt odlings Virus Quantal analys OBS: För alla steg alltid lägga lösningar noggrant för att undvika att störa cellmonoskiktet. Dekantera eller aspirera media från testkärlen innehåller ett monolager av BGM celler vid 3-6 dagar efter delning och sedan lägga till en volym av balanserad saltlösning som är lika med media bort. Dekantera eller aspirera balanserad saltlösning från cellkulturen test fartyg som används och sedan ympa cellodlingstestkärlen Ympa 10 provkärl för varje prov med en volym av delprov en lika ympen volym tillsammans med den totala odlingsbara virus quantal analyskontroller (kompletterande material avsnitt S2.4). För LFB och Lab Berikade Prov Matris (LFSM; dvs., ympades vattenmatrisprov), förbereda 5-, 25-, och 125-faldiga utspädningar med användning delprov 3 och 0,15 M natriumfosfat, pH 7,0 till 7,5 som ett utspädningsmedel. Ett exempel på ett förfarande för framställning av späd ges i kompletterande material under rubrik S3. Inokulera 10 tvättade cellodlingstestkärl för varje spädningsserie med hjälp av ett inokulat Volym på varje testkärl förutom de fartyg som ympats med outspädd delprov 1 i steg 3.2.1. För varje prov från steg 3.2.1 (andra än de som ympas i steg 3.2.2) som har CPE i alla 10 replikat efter 14 dagars inkubation (se steg 3,3), prepare 5-, 25-, och 125, och 625-faldiga utspädningar av delprov 3. Inokulera 10 tvättades cellodlingstestkärl för varje spädningsserie med användning av en ymp-volym på varje testkärl tillsammans med en ny uppsättning av den totala odlingsbara virus quantal analyskontroller (kompletterande material under rubrik S2.4). Fördela inokulatet över ytan av cellmonolagren genom att luta kärlen och tillbaka. Inkubera testkärlen vid rumstemperatur under 80-120 minuter på en mekanisk gungande plattform vid 1-5 svängningar / min eller med gungande av fartygen var 15-20 min för att låta virus närvarande att bindas till celler. Lägg förvärmd underhållsmedium, och sedan inkubera testkärlen vid 36,5 ± 1 ° C. Leta efter uppkomsten av CPE i varje testkärl med hjälp av ett mikroskop dagligen för tre första d och sedan undersöka dem var 2-3 dagar upp till dag 14. Överför alla testkärl som visar ≥75% CPE till en frys inställd på ellerunder -70 ° C. Frysa alla återstående kulturer och den totala odlingsbara virus quantal analyskontroller vid eller under -70 ° C efter att ha granskat de fartyg på den sista dagen. Tina alla kulturer och filtrera ≥15% av mediet från varje CPE-positiva provkärl genom ett 0,2 pm steriliseringsfilter. Om den angivna volymen inte kan passera genom filtret på grund av igensättning, centrifugera mediet i 10 min vid 1,500-18,000 xg och 4 ° C före filtrering. Utföra en andra passage av alla 1 st passage prov fartyg som använder tvättade BGM testkärlen. Ympa de nya testkärlen med en inympning volym som representerar 10% av den tinade medium från alla negativa testkärl och från den filtrerade medium från positiva kärl. Upprepa steg 3.2.4-3.4.3, men frysa alla testkärl som var negativa på den 1: a passagen och positiv på 2: a som beskrivs i steg 3,3. Utför en 3: e passålder som beskrivits för 2: a passagen med användning av endast de negativa analyskontroller och cellkulturer som var negativa under en st passagen och positiva i två nd passagen. Identifiera enskilda provkärl som virus positiva när de visar CPE i både 1: a och 2: a passager eller, i det fall där CPE inte sker förrän 2: a passagen, i både 2: a och 3: e passager. Använd USEPA mest sannolika antal Calculator med standardprograminställningar som visas i tabell S2 att beräkna virustitrar i alla testproverna. Mata in antalet virus positiva likadana test fartyg från steg 3,6 för varje prov i räknaren för att bestämma MPN / ml (M ml) och den övre (CL UML) och nedre (CL LML) 95% konfidensintervall / ml värden . Obtain MPN / L-värde (M L) av den motsvarande testprov med användning av Ekvation 2. ekvation 2 M ml är MPN / ml värde i steg 3,7, är S analysprovet Volym, och D är volymen av original vattenprov analyseras. Beräkna övre konfidensintervall / L genom att ersätta CL UML värdet för M ml värdet. Beräkna lägre konfidensgräns / L genom att ersätta CL LML värdet för M ml värdet. Ett räkneexempel visas i kompletterande material avsnitt S4.2. Rapport M ml värdet 0 som ≤ 1 / D. Till exempel, ≤ 0,002 MPN / L (≤ 1/500 L) för grundvattenprover. Beräkna MPN och 95% förtroende gränsvärden för varje Lab spetsat blank och Lab Reagent Blank genom att först multiplicera värden / ml erhålls i räknaren av S och sedan dividera resultatet med 0,3.

Representative Results

Virus koncentrerades från källan grundvattnet tre dricksvattenreningsverk och en privat väl med hjälp av elektropositiva filter. Två provuppsättningar, som består av ett provfält och LFSM kontroll, samlades in från reningsverken på separata tillfällen, och en provuppsättning uppsamlades från egen brunn. Total återvinnings virus bestämdes genom att använda LFSM prover från två av anläggningarna och den privata brunn (två prover från en växt och ett prov från ett annat uteslöts från beräkningen eftersom MPN värdet av det utsäde som använts med varje prov kunde bestämmas exakt på grund av onormala CPE resultat bland likadana flaskor). Genomsnittlig poliovirus återhämtning från grundvattenprover i genomsnitt 58% med en variationskoefficient på 79% (Figur 2) 16. Ingen odlingsbara virus upptäcktes i någon av de dubbla oympade grundvatten fältprov. Metod prestanda mättes också med hjälp av LFB spel modifieras genom att använda två olika utsädesnivåer. En "låg" titer av 300 MPN av poliovirus användes för att utvärdera prestanda vid nivåer mindre än "standard" 500 MPN LFB nivå som används i USEPA metod 1615 En "hög" titer av 1000 MPN av poliovirus användes för att testa prestanda på nivån för den LFSM kontroll. Dessa kontroller utförs på samma sätt med en genomsnittligt utbyte av 111% och en variationskoefficient på 100% (Figur 2). Alla LRB prover var negativa och alla LFB prover utförs inom acceptansintervallet (utfyllnadsmaterial tabell S1). Figur 1. Filter Eluering. En schematisk för att använda en tryckbehållare för patronfilter eluering visas. Positivt lufttryck används för att skjuta köttextrakt lösning i tryckbehållaren genom patronhuset conlande den elektropatronfilter. En peristaltisk pump kan användas i stället för tryckbehållaren, med inloppet av pumpen placeras i behållaren som innehåller nötkött extraktlösning. Figur 2. Mean Poliovirus Recovery (%) från Ground och reagenskvalitet vatten. Den genomsnittliga procentuella återhämtningen visas för poliovirus från marken ( ; n = 4) och reagenskvalitet vatten ( ; n = 12) prover. De tolv reagenskvalitet vattenprover ingår sex ympades med 300 MPN och sex ympades med 1000 MPN av poliovirus. Felstaplar representerar standardfelet.

Discussion

USEPA metod 1615 var utvecklad för användning under Oreglerad miljögiftsövervaknings förordningen tredje övervakningsomgången (UCMR3) ¹⁷ och främst avsedd för att mäta virus förekomst i grundvattnet. Den delar ett antal gemensamma steg med informationssamling Rule (ICR) metoden, ^15,18 men har två små skillnader. Båda använder quantal analyser för att mäta virus som producerar CPE på BGM cellmonoskikt med kvantifiering är baserad på most probable number (MPN) beräkningar. Metod 1615 tillåter användningen av en nyare elektropositiv filter för koncentrering av virus från olika vatten matriser och reducerar antalet cellodlingstestkärl replikat per spädning från 20 till 10 Både mindre förändringar minska de totala kostnaderna metod. Minskningen av antalet replikat minskar arbetskraft, men resulterar i en något lägre detekteringsgränsen. Även grundvatten förväntas ha lägre halter av virus än ytvatten, ^19,20 ee mängd prov analyseras är fem gånger högre än för ytvatten, kompenserar delvis för skillnader. Användningen av färre replikat kommer att vara tillräckligt för de flesta ytvatten, men vissa kommer att kräva provspädning.

Metod 1615 har flera viktiga steg och begränsningar. Nötkött extrakt varierar från parti till parti. Varje parti bör testas för effektivitet av viruset eluering och kapaciteten för viruskoncentration genom de sekundära koncentrationssteg som beskrivs är kompletterande material under rubrik S2.3. Metoden använder exakta formler för beräkning av provet för att ympa in BGM cellkulturer och för att bestämma virustitrar. Felaktiga resultat kommer att genereras om dessa formler inte strikt följs. Korrekt aseptisk teknik måste användas för att upprätthålla cellkulturer. Oinfekterade BGM cellodlingskontroller som visar nöd under 14-dagars inkubationstid indikerar sannolikt problem med cellodlings underhåll. Stor omsorg måste också vara TAken under pipettering steg som är involverade med inokulering av och medel Förutom cellodlingsflaskor för att undvika korskontaminering. De kvalitetskontroller som beskrivs i tilläggsmaterial Avsnitt S2 måste noggrant följas. Avsnitt S2 ger också råd om felsökning för kvalitetsfrågor.

Den primära mekanismen för virusadsorption till elektropositiv filter är en laddningsinteraktion relaterad till styrkan i den positiva laddningen på filtret och styrkan av viruset "negativ laddning i samband med dess isoelektriska punkt och det pH för vattnet som testas ^21. Eluering från filter också påverkas av styrkan i dessa interaktioner. Eftersom de varierar bland virustyper och även bland stammar inom samma typ, är inte enhetlig eluering från filtren. Detta innebär att alla resultat kan underskatta den faktiska nivån av virus som finns i miljö vatten. Användningen av en enda BGM cellinje skattar också virus händelse. Räckviddenav enterisk virus som kan producera CPE i denna cellinje i första hand är begränsat till poliovirus och Enterovirus B Art serotyper samt några reovirus ^14,15,22. Andra smittvirustyper kommer inte att upptäckas.

Poliovirus återvinningar från marken och reagenskvalitet vatten träffade USEPA Metod 1615 Kriterierna prestanda acceptans för både Performance Evaluation (PE, dvs seedade reagenskvalitet vattenprover med titrar okända för en analytiker som används för att utvärdera analytikern före start av en studie) och LFB prover (kompletterande material tabell S1). Återhämtningen 58% från grundvatten användning av kulturen förfarande liknar det som rapporterats av andra som använder kranvatten ^23,24. Den genomsnittliga återhämtning från LFB prover av 111% med en variationskoefficient (CV) av 100% träffade också kriterier för metodens acceptans trots att de är högre än vad som observerats för PE prover during ICR. ICR betyda provnings återhämtningen var 56% med en variationskoefficient (CV) på 92% medan medel intralaboratory återvinningar varierade från 36 till 85% (CV 58-131%, opublicerade data från ICR PE databasen). Högre återvinningar observerades i denna studie för låg utsädes LFB prover än för högre prover utsädes (122 jämfört med 42%). Vid den tidpunkt då ICR planerades, var det väntat att PE prover som får låga värden utsäde skulle ha lägre återhämtning som de som får höga frön. I likhet med den som observerades här för LFB prover var poliovirus återhämtning för ICR PE prover 71% (CV 100%), 54% (CV 69%), och 44% (CV 71%) för startvärden ≤300 MPN, 300- 1500 MPN, och> 1500 MPN, respektive.

Det finns många metoder för att mäta infektiöst virus i vattenprover ^25. Denna metod är betydande i förhållande till andra metoder i graden av standardisering. Standardiseringen omfattar inte bara kvalitets- och prestandakontroller,men också använder definierade volymer och formler för att se till att alla analyslaboratorier utföra metoden identiskt. Utan standardisering, är det svårt att jämföra resultaten mellan laboratorier, och därför standardisering är viktigt när de utför storskaliga studier i flera analyslaboratorier. Med den inbyggda standardisering denna metod kan utvidgas i framtiden för att omfatta ytterligare virustyper och cellinjer. Forskning pågår för att ta fram underlag för införandet av adenovirus i metoden.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Beef extract, desiccated powder	BD Bacto	211520
Cryogenic tubes	Thermo Fisher	3775/945373
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	14170-112
Mechanical rocking platform	Daigger	EF4907G
Orbital shaker	Thermo Fisher	14-285-729
Sterilizing filter with prefilter	VWR	28143-295
Sterilizing syringe filter	Corning	431219
pH Standards	Sigma-Aldrich	33643, 33646, 33648
MEM	Sigma-Aldrich	M1018 or M4642
Leibovitz L-15	Sigma-Aldrich	L4386
Sodium bicarbonate, 7.5%	Sigma-Aldrich	S8761
Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-139
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Trypsin, EDTA	Invitrogen	25200072