電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）
Summary
Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Abstract
エキソソームは、細胞間コミュニケーションにおける仲介の役割を果たして微小胞構造体である。彼らは病気差別バイオマーカーを運ぶかどうかを決定するエキソソームの内部の貨物を研究するために重要である。エキソソーム分析を行うためには、内部コンテンツに損傷を与えることなく、標的生体液からエキソソームを抽出し、分析するための方法を開発する必要がある。
電界誘起放出および測定（EFIRM）は、特に、生体液からのエキソソームを抽出し、その積荷を降ろして、その内部RNA /タンパク質含有量を試験するための方法である。抗ヒトCD63特異的抗体磁性微粒子を用いて、エキソソームは、まず生体液から沈殿させる。抽出後、低電圧電気サイクリック方形波（CSW）は、小胞膜を破壊し、貨物搬出を引き起こすために適用される。エキソソームの内容は、資格でのために電極表面上に固定化されたDNAプライマーまたは抗体とハイブリダイズさせる分子コンテンツのntification。
EFIRM方法は、エキソソームを抽出し、溶解緩衝液なしの分析のために貨物をアンロードするために有利である。この方法は、エキソソームの両方のRNA及びタンパク質バイオマーカー標的の特異的な検出を行うことができる。サイズベースの技術とは対照的にEFIRMは、具体的には、それらの表面マーカーに基づいて、エキソソームを抽出する。
透過型電子顕微鏡（TEM）およびアッセイは、エキソソームキャプチャおよび分析のための方法の機能性を実証する。 EFIRM法は、生理食塩水コントロールを受けた11匹のマウスに対して彼らエキソソームプロファイルをテストするために、ヒト肺癌H640細胞を注射した9匹のマウス（エキソソームマーカー、ヒトCD63-GFPを発現するようにトランスフェクト細胞株）の分析をエキソソームに適用した。エキソソームのバイオマーカーのレベルの上昇（参照遺伝子GAPDHおよびタンパク質表面マーカーのヒトCD63-GFP）は、H640の両方の血清および唾液サンプルをマウスに注射するために見出された。さらに、SalIでvaの血清試料を、直線性（R = 0.79）を有することが実証された。これらの結果は、遠位疾患の検出のための唾液エキソソームのバイオマーカーの生存のために示唆している。
Introduction
エキソソーム研究は、RNA 1、DNA 2、およびタンパク質3貨物を運ぶ脂質微小胞を調べ、調査の新興分野である。エキソソーム生物学の以前の研究は、血液4、尿5、母乳6、および唾液7などの生体液中のエキソソームの同定につながった。研究では、遠隔体8の異なるシステム間の通信を瞑想、エキソソームは、異なる細胞経路に役割を果たすことが実証されている。ロールのエキソソームは細胞間コミュニケーションにおいて役割を果たすので、それらは疾患状態と相関して生体分子標的（タンパク質、RNA、およびDNA）をパッケージ化することができると仮定される。 インビトロ 3および動物モデル9の研究は、この仮説を裏付けるように見える。バイオマーカー発見のためのエキソソームコンテンツを調査において、それは生体液から選択エキソソームを単離するための方法論を開発することが必要である、誘起expulsiエキソソームからの貨物、およびエキソソーム生体分子の定量化の上で。この作業の範囲では、エキソソームは、構造体は、約70~100ナノメートルの直径を有し、表面マーカーCD63を有するとして定義される。
研究者は、通常、最初の超遠心分離10によってエキソソームを精製した後、溶解バッファーキットの使用を通じてエキソソームコンテンツを処理する。溶解緩衝液法の使用は、数分から時間の範囲のインキュベーション時間を必要とする。このプロセスは、潜在的にエキソソーム貨物を害する劣化をサンプリングする可能性がある。例えば、周囲の細胞外環境への溶解緩衝液を介して放出唾液エキソソームRNAは、エキソソームRNA溶解後の測定が安定化試薬11を添加せずに、特に困難な作業バッファ作る、1分間の下での半減期を有している。溶解および安定化のための様々な試薬を加えるの配合効果が複雑にエージェントを導入し、ANALYを妨害する可能性がエキソソームコンテンツのSIS。別のアプローチは、迅速にエキソソームコンテンツをアンロードし、安全に特徴づけのために貨物を保持するのに役立つことができる。
本研究では、エキソソーム内容物の放出のために不均一な電界の使用を提案する。電気フィールドが分極し、細胞膜を構成する脂質二重層を破壊する能力を運ぶことが知られている。私たちの実験的な作品は、エキソソームの微小胞の構造を破壊し、運ば貨物を解放するために、不均一な周期的な方形波（CSW）の使用方法を探ります。この方法は、ほとんどの生体分子が中断されないことを意味し、数百ミリボルトの範囲で電圧を使用しています。我々は、環状方形波の使用は、周囲の流体環境に唾液エキソソームのmRNA内容物の放出を作動することができることを実証する。エキソソームコンテンツのこのリリースは、シームレスに、バイオマーカーの発現レベルを定量するために使用することができ、電極システムに統合されている12,13。この提案された方法は、エキソソームコンテンツの迅速、高感度、および溶解バッファー無料で分析することができます。
EFIRMワークフロー図1.概要。。EFIRM法が広くエキソソームを精製し、分析するために必要な三つの主要段階に分けられる。
このCSWベースエキソソームコンテンツ放出および分析方法は、エキソソームを単離するためのCD63特異的磁気ビーズと組み合わせて使用される。これらのCD63-親和性ビーズは、唾液サンプル（および他の生体液）からのエキソソームの選択的な単離を可能に。インキュベーションおよび磁化ビーズを使用してエキソソームの抽出に続いて、ビーズは、 図1を参照 。内容物の放出実験の分析部をベースCSWための電気化学センサーシステムに移行作業の概要を示しているEFIRM方法のフローチャート。
Protocol
Representative Results
Discussion
結果が示すように、抗ヒトCD63被覆した磁性ナノ粒子は、具体的には70〜100ナノメートルの範囲のサイズを有する小さな粒子を捕捉することができる。この捕獲粒子は、エキソソームの以前に観察されたプロファイルと一致している。さらに、粒子の捕捉以下の低電圧CSWの使用は、ビーズ表面から削除し、貨物放出のための伝統的な溶解緩衝液ベースの方法と類似のDNAの分解プロフィールを引?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、（FW）のグラントUL1TR000124を通じて、トランスレーショナル科学、国立衛生研究所を進めるための研究資源のための国立センター、国立センターによってサポートされていました。フェリックス＆ミルドレッド·イップ寄附教授職と（DTWWへ）バーンズファミリー基金、（MT）の賞数T90DE022734下の国立衛生研究所の歯科·頭蓋顔面研究所研究所。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
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