Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Exossomos são estruturas microvesicular que desempenham um papel de mediação na comunicação intercelular. É de interesse para o estudo da carga interna de exossomos para determinar se eles são portadores da doença biomarcadores discriminatórias. Para a realização de análise exosomal, é necessário desenvolver um método para a extracção e análise de exossomas a partir de fluidos biológicos alvo sem danificar o conteúdo interno.
Libertação eléctrica induzida por campo e medição (Efirm) é um método para a extracção especificamente exossomas a partir de fluidos biológicos, descarregar as suas cargas, e testando o seu conteúdo de ARN / proteína interna. O uso de um anticorpo CD63 específico de micropartículas magnética anti-humana, exossomos são primeiro precipitado a partir de fluidos biológicos. Após a extracção, de baixa tensão ondas quadradas eléctricas cíclicos (CSW) são aplicados para romper a membrana vesicular e causar o descarregamento da carga. O conteúdo do exossoma é hibridado com iniciadores de ADN ou de anticorpos imobilizados numa superfície de eléctrodo para quantification de teor molecular.
O método Efirm é vantajoso para a extracção de exossomas carga e descarga para análise sem tampão de lise. Este método é capaz de efectuar a detecção específica de ambos os alvos de ARN e proteína de biomarcadores na exossoma. Efirm extrai exossomas especificamente com base nos seus marcadores de superfície, em oposição a técnicas baseadas em tamanho.
A microscopia electrónica de transmissão (TEM) e ensaio de demonstrar a funcionalidade do método de captura e análise de exossoma. O método foi aplicado para Efirm exosomal análise de 9 ratinhos injectados com células de pulmão humano H640 do cancro (uma linha de células transfectadas para expressar o marcador CD63 humano exossoma-GFP), a fim de testar o seu perfil contra exossoma 11 ratinhos que receberam controlos de solução salina. Níveis elevados de biomarcadores exosomal (GAPDH gene de referência e proteína de superfície do marcador CD63 humano-GFP) foi encontrado com o H640 injetaram em ratos em ambas as amostras de soro e saliva. Além disso, saliva e amostras de soro foram demonstradas ter linearidade (R = 0,79). Estes resultados são sugestivos para a viabilidade de biomarcadores de exossoma salivares para a detecção de doenças distais.
Pesquisa exosome é um campo emergente de investigação que examina microvesículas lipídicas que carregam um RNA, DNA 2, 3 e proteína de carga. Inquéritos anteriores da biologia exosome levaram a identificação de exossomos em fluidos biológicos como sangue 4, 5 urina, leite materno 6, 7 e saliva. Estudos têm demonstrado que os exossomas desempenhar um papel em diferentes vias celulares, meditar remotamente a comunicação entre diferentes sistemas do corpo 8. Devido ao papel exossomas desempenhar na comunicação intercelular, é a hipótese de que eles podem empacotar alvos biomoleculares (proteína, RNA e DNA) correlacionados com estados de doença. 3 in vitro e animal modelo 9 estudos parecem confirmar esta hipótese. Ao investigar o conteúdo exosomal para descoberta de biomarcadores, é necessário o desenvolvimento de uma metodologia para o isolamento exosome seletiva de fluidos biológicos, expulsi induzidona carga a partir de exossomas, e quantificação de biomoléculas de exossoma. No âmbito do presente trabalho, os exossomas irá ser definido como uma estrutura com um diâmetro de cerca de 70-100 nm e que possui marcador de superfície CD63.
Os investigadores tipicamente primeiro purificar os exossomas por ultracentrifugação a 10 e, em seguida, processar o conteúdo exosomal através do uso de kits de tampão de lise. O uso de métodos de tampão de lise requer tempos de incubação variam de minutos a horas. Este processo pode potencialmente prejudicar carga exosome e levar para provar degradação. Por exemplo, o ARN exossoma salivar libertado através de tampão de lise para o ambiente extracelular circundante possui uma semi-vida de menos de 1 min, tornando a medição de ARN exosomal pós-tampão de lise uma tarefa particularmente difícil sem a adição de reagentes de estabilização 11. O efeito combinado da adição de vários reagentes para lise e estabilização podem introduzir agentes que complicam e interferir com a Analysis de conteúdo exosomal. Uma abordagem alternativa pode ser útil para uma rápida descarga conteúdo exosomal e preservar a segurança da carga para caracterização.
Neste trabalho, propomos o uso de um campo elétrico não uniforme para a liberação de conteúdo exosomal. Elétrico-campos foram conhecidos para levar a capacidade de polarizar e perturbar a bicamada lipídica que forma as membranas celulares. Nosso trabalho experimental explora o uso de não-uniformes cíclicos ondas quadradas (CSW) para interromper a estrutura microvesículas de exossomos e liberando a carga transportada. Este método utiliza tensões na faixa de várias centenas de milivolts, o que significa que a maioria das biomoléculas não será interrompido. Nós demonstramos que o uso de uma onda quadrada-cíclico é capaz de accionar o conteúdo lançamento de ARNm salivar exossoma no ambiente circundante fluídica. Esta versão do conteúdo exosomal está perfeitamente integrado com um sistema de eletrodos que podem ser usados para quantificar os níveis de expressão de biomarcadores 12,13. Este método proposto permite, e tampão de lise análise livre rápido, sensível do conteúdo exosome.
Figura 1. Visão Geral do Efirm Workflow.. O método Efirm é dividida em três fases principais que são necessários para a purificação e análise de exossomos.
Este método de libertação conteúdo exosomal e análise baseada CSW é usado em conjunto com microesferas magnéticas específicos de CD63 para isolamento exossoma. Estes grânulos de CD63 por afinidade para permitir o isolamento selectivo de exossomas a partir de amostras salivares (e outros fluidos biológicos). Após a incubação e extração de exossomos usando as esferas magnetizadas, as contas são migrados para o sistema de sensor eletroquímico para a CSW baseado liberação de conteúdo e análise de parte do experimento. A Figura 1 apresenta uma visão geral do trabalhofluir do método Efirm.
Como os resultados indicam, CD63 anti-humano revestido nanopartículas magnéticas são capazes de capturar especificamente pequenas partículas que têm um tamanho que varia 70-100 nm. Esta partícula capturado é consistente com o perfil observado anteriormente de exossomas. Além disso, o uso da CSW baixa voltagem após a captura das partículas é mostrado para removê-los da superfície do grânulo e provocar perfis de degradação de ADN semelhante ao de um método tradicional de tampão de lise com base para a li…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional, Institutos Nacionais de Saúde, através de Grant UL1TR000124 (a FW); o Felix & Mildred Yip Endowed Professorship eo Fundo Família Barnes (para DTWW), do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número T90DE022734 (de MT). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |