Abstract
Eksozomlar arası iletişimde bir aracı rolü mikroveziküler yapılardır. Onlar hastalık ayrımcı biyomarkerlar taşımak olmadığını belirlemek için eksozom iç kargo incelemek için ilgi olduğunu. Exosomal analizinin yapılması için, ayıklanması ve iç içeriği zarar vermeden hedef Biofluids gelen eksozomlar analiz etmek için bir yöntem geliştirilmesi gerekmektedir.
Elektrik alan ile indüklenen salma ve ölçüm (EFIRM) özel olarak, Biofluids gelen eksozomlar açılan kendi yük boşaltma ve iç RNA / protein içeriği test etmek için bir yöntemdir. Bir anti-insan CD63 özgü antikor manyetik mikropartikül kullanarak, eksozomlar ilk Biofluids çökeltilir. Aşağıdaki çıkarma, düşük voltajlı elektrik siklik kare dalgalar (CSW) veziküler membran bozabilir ve kargo boşaltma neden uygulanır. eksozom içeriği nereye için bir elektrot yüzeyi üzerinde hareketsiz DNA primerleri veya antikorlar hibridize edilirMoleküler içeriğin ntification.
EFIRM yöntemi liziz tamponu olmayan analizi için eksozom ekstre ve boşaltılması için avantajlıdır. Bu yöntem, eksozom hem RNA ve protein biyomarker hedeflerin belirli bir algılama gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Boyut-tabanlı teknikler aksine EFIRM özellikle yüzey belirteçleri dayalı eksozomlar ayıklar.
Transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile tahlil eksozom yakalama ve analiz için bir yöntem işlevselliğini gösterir. EFIRM yöntem, insan akciğer kanseri H640 hücreleri enjekte 9 farelerin analizi tuzlu kontrolleri alan 11 fareden karşı eksozom profili test etmek için (eksozom işaretleyici insan CD63, GFP ifade eden transfekte edilmiş bir hücre hattı) exosomal uygulandı. Exosomal biyobelirteçlerinin Artmış düzeyleri (referans gen GAPDH ve protein yüzey işaretleyici insan CD63-GFP) H640 hem serum ve tükürük örneklerinde fareler enjekte bulunamadı. Ayrıca Saliva ve serum numuneleri doğrusallık (R, = 0.79) sahip olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar uzak hastalıkların tespiti için tükürük eksozom biyobelirteçlerinin canlılığı düşündürür.
Introduction
Exosome araştırma RNA 1, DNA 2, ve protein 3 kargo taşıyan lipit microvesicles inceleyen bir araştırma ortaya çıkan bir alandır. Eksozom biyoloji Önceki araştırmalar, kan 4, idrar 5, anne sütü 6 ve tükürük 7 gibi Biofluids içinde eksozom belirlenmesine yol açmıştır. Çalışmalar uzaktan gövdenin 8 farklı sistemler arasında iletişimi meditating, eksozomlar farklı hücresel yolların bir rol oynadığını göstermiştir. Rolü eksozomlar hücrelerarası iletişimi oynamak için, onlar hastalık durumları ile ilişkili biyomolekülün hedefleri (protein, RNA ve DNA) paket olabileceği düşünülebilir. In vitro 3 ve hayvan modeli 9 çalışmalar bu hipotezi doğrular görünmektedir. Biyomarkır keşif için exosomal içerik araştıran, bu Biofluids seçici eksozom izolasyonu için bir metodoloji geliştirmek için gerekli olan, uyarılan expulsieksozom gelen kargo ve eksozom biyomoleküllerin miktarının on. Bu çalışmanın kapsamında, eksozomlar bir yapı yaklaşık 70-100 nm arasında bir çapa sahip olan ve yüzey işaretleyici CD63 sahip olarak tarif edilecektir.
Araştırmacılar genellikle ilk Ultrasantrifügasyon 10 ile eksozomlar arındırmak ve daha sonra lizis tamponu kitleri kullanımı yoluyla exosomal içeriğini işlemek. Liziz tamponu yöntemlerin kullanımı dakika saat arasında değişen bir bekleme süresi gerektirir. Bu süreç, potansiyel eksozom kargo zarar ve bozulmasını örnek yol açabilir. Örnek olarak, çevreleyen hücre dışı ortama liziz tamponu üzerinden serbest tükürük eksozom RNA exosomal RNA sonrası liziz ölçümü stabilizasyon tepkin 11 eklenmeden özellikle zor bir görev tampon hale 1 dakika altında bir yarı ömre sahip bulunmaktadır. lizis ve istikrar için çeşitli reaktifler ekleyerek bileşik etkisi komplike ajanları tanıtmak ve analı müdahale edebilirexosomal içeriğinin sis. Alternatif bir yaklaşım, hızlı bir şekilde exosomal içeriği boşaltma ve güvenli bir şekilde tanımlanması için yük korunması için yararlı olabilir.
Bu çalışmada, exosomal içeriğin salınımı için bir tek biçimli olmayan elektrik alanının kullanımını önermektedir. Elektrikli alanları polarize ve hücre zarlarını oluşturan lipid çift bozma yeteneği taşımak için bilinmektedir. Bizim deneysel çalışmalar eksozomlann microvesicle yapısının bozulması ve taşınan kargo serbest bırakılması için düzgün olmayan siklik kare dalgalar (CSW) kullanımını araştırıyor. Bu yöntem en biyomoleküllerin kesintiye olmayacak anlamına birkaç yüz milivolt aralığında gerilimleri kullanır. Bir siklik kare dalga kullanımı çevreleyen akışkan ortama tükürük eksozom mRNA içeriği serbest harekete geçirmek için mümkün olduğunu göstermektedir. Exosomal içeriğin Bu sürüm, sorunsuz bir şekilde biyomarker ekspresyon seviyelerini ölçmek için kullanılabilecek bir elektrot sistemi ile entegre 12,13.. Önerilen bu yöntem, eksozom içeriğinin hızlı, hassas ve parçalama tamponu ücretsiz analiz sağlar.
EFIRM İş Akışı 1. Genel Bakış Şekil.. EFIRM yöntemi geniş arındırıcı ve analiz eksozom için gerekli olan üç ana evreye ayrılır.
Bu SSG göre exosomal içeriği serbest bırakılması ve analiz yöntemi eksozom izolasyonu için CD63 spesifik manyetik mikro ile bağlantılı olarak kullanılır. Bu CD63-afinite taneleri tükürük örnekleri (ve diğer Biofluids) için eksozom seçici izolasyonu için izin verir. İnkübasyon ve manyetize boncuklar kullanarak eksozom çıkarılması ardından, boncuk Şekil 1. Içerik salınımını ve deney analizi bölümünü tabanlı CSW için elektrokimyasal sensör sistemi göç işin bir bakış verir edilirEFIRM yöntemi akar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Manyetik Boncuk-tabanlı Exosome Ekstraksiyon
- Boncuklar yeniden askıya almak için bir mikrosantrifüj tüpü içinde, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), tampon 495 ul içinde Streptavidin-kaplı manyetik mikro 5 ul iyi karıştırılmış solüsyonu pipetle. Manyetik bir raf kullanarak üç kez yıkanır ve 500 ul PBS ile yeniden süspanse boncuklar. raf örnek mikrosantrifüj tüpleri tutabilecek bir konut ünitesi tarafında mıknatıs bir dizidir.
- Her yıkamadan için, ilk tüpler 1 dakika rafa oturup, ve daha sonra dikkatlice boncuk bozmadan süpernatant tampon kaldırmak için bir pipet kullanın izin.
- Tarafında mıknatıslar olmadan düzenli bir rafa tüpleri yerleştirin. Tüplerin içine PBS 500 ul ekleyin ve birlikte çözüm ve boncuk karıştırmak için pipet kullanın. Sonra tekrar solüsyon gelen boncuk ayırmak için manyetik rafa geri tüpleri koymak.
- PBS a mıknatıslanma ve tabanda yoluyla tampon bu kaldırma gerçekleştirinüç kez toplam. Bu manyetik parçacıkların bir ilk yıkama yapar.
- Manyetik rafın olmayan manyetize edilmiş bölümü üzerine yerleştirilen bir tüp ile, PBS tamponu 490 ul içine boncuk yeniden süspanse edin. Pipet boncuk karışımı içine 1.0 mg / ml stok konsantrasyonunda biyotinile fare anti-insan CD63 antikoru 5 ul. Çözelti içinde, boncuk ve antikor karışımı pipet kullanın.
- Örnek karıştırıcı üzerine boncuk ve biyotinile antikor karışımı ile mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin. 90 ° 5 saniye eğerek ve 1 saniye 5 ° titreşimli de karşılıklı dönüş için örnek rotator için rotator parametrelerini ayarlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika için bu parametrelerin numune boncuk karışımı tüpleri döndürün.
- Konjugasyon sonra bağlanmamış antikor çıkarın.
- Oda sıcaklığında dönme, 30 dakika sonra, 5 dakika boyunca geri manyetik rafa tüpleri.
- Bir mikropipet kullanılarak sıvı faz kaldırarak boncuk üç yıkar gerçekleştirin ve 500 μ ile yıkayın; PBS l. Üçlü yıkamadan sonra, raf manyetize kısmına 490 kazein-PBS ul ve yerine boncuk tekrar süspansiyon.
- Antikor kaplı boncuklar kullanılarak exosome çıkarma.
- Hedeflenen örnek kimliği ile her tüp etiketleyin. Mikrosantrifüj tüpe serum veya tükürük 10 ul örnek Pipet. Birkaç kez pipet kullanılarak örneğini ve manyetik boncuk karışımı pipet kullanın.
- Döndürücü üzerine numune ve anti-insan CD63 antikoru boncuk tüpleri ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca döner. Aşama 1.2 'de tarif edildiği gibi aynı döndürücü parametreleri kullanın.
- Döner örnek 2 saat sonra, çözelti ayrı tanelerine mıknatıslanma mikropipet ile sıvı faz ayrılması ve Tris-HCI tampon maddesinin 500 ul boncuk resuspending üçlü yıkama yapar. Elde edilen boncuklar artık eksozom bağlı ve elektrik alan serbest bırakılması ve ölçüm için hazırız.
2. Elektrik Alan Bağlı Çıkış birnd Exosomal İçerik Ölçümü
- GADPH Astar ile Elektrot İlk ön kaplamaya tabi tutulması
- Bir plastik de bireysel elektrotların çapraz bulaşmayı önlemek için bir elektrot dizisi uygulayın. Bu deney için, çıplak altından yapılmış bir çalışma, sayaç ve referans elektrot oluşan dizideki her birim elektrot ile 16 sensör elektrot dizisi kullanın.
- Ultra saf damıtılmış su ile bir tüp içine hazır reaktifleri pipetleyerek, 100 nM DNA probu, 0.3 M KCI ve 10 mM pirol bir stok karışım hazırlayın. Vorteks ile iyice karıştırın.
NOT: Bu çalışma için seçilen DNA probu eksozom içinde mevcut olduğu bilinmektedir GAPDH referans genine karşılık gelir. kullanılan prob dizisi '-Biyotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 5'. Tüm elektrotlar üzerinde bu karışımı kullanın. - Pipet her altın elektrod yüzeyi üzerine monomer DNA probu karışımı 60 ul. Çalışma, c yeterli kapsama olmasını sağlamak için elektrotları inceleyinSıvı karışım ile Sayaç ve referans elektrotlar.
- Electropolymerize monomer prob karışımı elektrot yüzeyine döngüsel bir kare dalga (CSW) elektrik alanı profili uygulayarak elektrot yüzeyinde bir iletken polimer katmanı oluşturmak için. Bu elektrik alanı 9 saniye +350 mV uygulayarak ve hemen 1 saniye için 950 mV geçiş oluşur. Uygulanan bir elektrik alanı, 100 saniye, toplam 10 çevrim için elektroda bu siklik kare dalga profil uygulanır.
- Elektrotun yüzeyinden sıvının çıkması için sensör yüzeyine damıtılmış su ve azot gazı ile kuru ile 3 kez yıkayın. Bu sıvı düzgün elektrot kaldırılır emin olun.
- Exosome Kargo Boşaltma
- Yük 5 boncuk eksozom kompleks karışımı 495 ul bir detektör probu 1 mcM ul ve karıştırmak için bir pipet kullanın.
Not: detektör probu 3 'ucunda bir floresein molekülüne konjuge edilmiş bir DNA primer sekansıdır. Dedektör probBu çalışma için kullanılan e dizisi eksozom içinde bulunan, GAPDH mRNA karşılık gelir. floresein konjuge detektör probu sekansıdır: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Floresein-3 '. - Pipet altında bir mıknatıs dizi ile bir altın elektrot yüzeyine prob ve boncuk eksozom kompleks karışımı 60 ul. Bu mıknatıs dizisi sensörünün çalışma elektrotlara karşılık hizalanmış onaltı 2.54 mm çaplı mıknatıslar oluşur. Şekil 2A mıknatıslar ve boncuk eksozom çözümün yerleşimini gösterir.
- Örnek elektrot yüzeyinde yüklendikten sonra, -300 mV 9 saniye ve 200 mV (200 sn toplam) 1 saniye ile CSW elektrik alanın 20 döngüleri uygulayın. serbest exosomal yük elektrodun sathı üzerinde primerler hibridize olur. Exosome yüzey belirteçleri soruşturma konusu ise,. Deney bu bölümünü atlamak 2B bu süreci göstermektedir Şekil. <li> Yıkama-off üçlü damıtılmış su ile elektrot yüzeyini durulayarak elektrot yüzeyinde ilişkisiz analitler. Azot gazı ile elektrot kurutun.
- Yük 5 boncuk eksozom kompleks karışımı 495 ul bir detektör probu 1 mcM ul ve karıştırmak için bir pipet kullanın.
- (: 1000 seyreltme, 1 içinde HRP) kazein / PBS içinde seyreltilmiş yaban turpu peroksidazına konjüge edilmiş 150 ünite / ml anti-floresin antikor 60 ul ekle.
- Prob sandviç karmaşık bir anti-floresein HRP bir elektrik alan tahrik konjugasyon kullanın. 1 saniye ve elektrot yüzeyine 5 çevrim için 1 saniye için 500 mV -200 mV uygulanır. Şekil 2A, bir protein ve nükleik asit sisteminde hem de yakalama ve dedektör sistemi kompleksleri gösterir.
- Distile su ve azot gazı ile kuru kullanılarak üçlü yıkama sensör yüzeyi.
- Bağlanmamış fazla bir anti-floresin antikorun yıkama ayrılmasının ardından, 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB), alt-tabakanın 60 ul ekle. Bir çok kanallı pipet kullanarak her bir sensör yüzeyine bu alt tabakayı yükleyin.
- . 16 kanal eş zamanlı olarak ölçüm kapasitesine sahip bir elektrokimyasal potansiyostat kullanılarak 60 sn için -200 mV'de elektrot akımının ölçülmesi ile akım amperometrik olarak okunmasını yapın 2C okuma sırasında akım profilinin bir örneği Şekil.
EFIRM Yöntem Şekil 2. Bileşenleri. (A), anti-insan CD63 kaplı manyetik mikropartiküller kullanarak biyo-sıvı gelen eksozomlar ayıklanması ve daha sonra parçacık-eksozom kompleksi uygulanan halkalı kare dalgaları kullanarak eksozom kargo boşaltma yöntemi. Serbest eksozom RNA / DNA / protein hedefleri tespit etmek için kullanılan elektrot biyosensör (B) Şema. Daha büyük akım büyüklüğü t karşılık (C) EFIRM metodolojisi, gelen amperometik okuma Temsilcisi örneğiBir biyomolekülün yüksek seviyelerde o. Bu rakam Wei ve ark değil. 14 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TEM kullanarak Boncuk Exosome Yakalama Doğrulama
Anti-insan CD63 manyetik boncukları kullanılarak tükürük eksozomlann izole transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleri kullanarak ekstraksiyon protokolü takip edilerek doğrulanmıştır. TEM eksozom bilinen profili ile uyumlu hemen bitişik (Şekil 3A, bkz ve 3B), 70-100 nm granüller, manyetik boncuklar gösterir. Resim 70-100 nm taneler daha önceden bunların konjüge anti-insan CD63 antikorları ortaya çıkmaktadır (Şekil 3C ve 3D bakınız) değil tükürük manyetik boncuk gözlenmiştir.
Şekil manyetik mikropartikülün 3. TEM görüntüleri. 70-100 nm bitişik küçük granüller anti-insan CD63 manyetik nanopartiküller (A) Görüntü. (B) 'EnlaManyetik nanopartiküle ve gözlenen granül rged görünümü. Konjüge hiçbir antikor ile manyetik boncuk (C) görüntüsü. (D) konjüge edilmiş herhangi bir antikor ile manyetik boncuk Büyütülmüş görünüşüdür. Bu rakam Wei ve ark değil. 14 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
CSW Elektrik Alan Kullanımı Exosomal İçerik Release Çalışması
Anti-insan CD63 boncukları TEM görüntüsü manyetik boncuk (Şekil 3A bakınız) bitişik olarak, 70-100 nm'lik granüller göstermektedir. Manyetik boncuklar kullanılarak eksozomlann yakalanması ardından, numuneler paralel iki farklı yöntemlerle işlenir. kullanılan ilk yöntem Triton-X eksozomlar parçalamak için 100 deterjan ve ikinci yöntem bu çalışmada tartışılan döngüsel kare dalga (CSW) elektrik alan lizis tamponu ücretsiz yöntem olduğunu Triton-X 100 yöntemi ar (detaylarWei e t al. 14 tarafından açıklanan, e). İşlenmiş eksozom boncuk kompleksi TEM ile analiz edilmiştir ve mRNA referans gen Bu çalışmada tarif elektrokimyasal yöntemi ile tekrar ölçülmüştür. Bu çalışmada kullanılan referans gen en eksozom mevcut GAPDH oldu.
TEM görüntüleri iki Triton-X 100 ve SSG elektrik alanı ile muamele edilmiş örneklerde, SSG ve Triton-X 100 tedavi yöntemleri (her ikisi de Şekil 4B-i ve daha sonra manyetik boncuklara yapışmış eksozom yapıların tanınmış yokluğu olduğunu göstermektedir Şekil 4B-IV). her ikisi de, Triton-X 100 ve SSG elektrik alanı ile muamele edilmiş örneklerde GAPDH ekspresyonu seviyelerinin ölçülmesi benzer bir profile sahip olmuştur: Farklı yokedici protokolleri takip edilerek ölçülmüştür GAPDH seviyelerinde bir azalma olduğu, yani o zaman ilerledikçe, exosomal bir pozlama gösteren Tükürük extravesicular çevreye mRNA (bkz Şekil 4C).
<keep-together.within-sayfa = "always">: fo p class = "jove_content"
Şekil elektrik CSW bırakma yöntemi Döngüsel Kare Dalga Exosome Yük Atma. (A) Diagram ile ilgili 4. Sonuçları. (B), eksozom TEM görüntüsü: SSG yayınlanmadan önce, (i), (ii) SSG yöntemin ardından, (iii) liziz tamponu yöntemi önce, (IV), liziz tamponu yöntemin ardından. TEM görüntüleri Arkaplan lacey destek. (C), eksozom GAPDH mRNA seviyelerinin Ölçümü liziz tamponu ve elektrik alan SSG uygulanır. Bu rakam Wei ve ark değil. 14 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yüzey proteinleri tespit ve barındırdığı mRNA için EFIRM Performans incelenmesi
EFIRM ve iştigal değerlendirilmesigeleneksel yöntemlere rison yapılmıştır. EFIRM (bir mRNA hedef olarak GAPDH kullanılarak) RNA ölçümü için ve qPCR (insan CD63-GFP, eksozom için bir yüzey işaretleyici için) Western blot protein miktarının ile karşılaştırılmıştır. İnsan CDP63-GFP exosome yüzeyinde olduğundan, CSW eksozom kargo kaldırmak için uygulanan değildi. Protein ve RNA testlerinin sonuçları sırasıyla Şekil 5A ve 5B'de gösterilmiştir.
Özelliği testleri de fare örneklerinden eksozom insan eksozomlar karıştırılarak EFIRM tabi tutuldu. Bu özgüllük testleri insan örnekleri fare, farklı oran karışımları dahil. Deney sonuçları fare exosomal içeriği beş insan içeriğine kat daha büyük, insan exosomal proteinleri ve mRNA hala belirlendi ve miktarları tayin edilebilir olduğunda (sırasıyla, protein ve RNA için Şekil 5C ve 5D bakınız) ortaya koymaktadır.
Eksozom seyreltilmiş numuneler kullanılarak, mRNA ve protein düzeyleri Şekil 5. EFIRM Performans Değerlendirme. GFP parçası üzerinde EFIRM ve western blot (A) karşılaştırması. GAPDH mRNA için EFIRM ve qPCR (B) karşılaştırması. (C) fare exosome farklı miktarlarda seyreltilmiş insan eksozom için Bağıl tespit GFP sinyali seviyeleri. (D) Fare exosome farklı miktarlarda seyreltilmiş insan eksozom için GAPDH mRNA için Bağıl tespit sinyali. Bu rakam Wei ve ark değil. 14 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fare Salyasından nicel Exosomal İçerik
Tespit ekso kapasitesini belirlemek için,tükürük numunelerinde lizozomal içeriği, bir çıplak fare modeli kullanılmıştır. Bu çıplak fare modeli, 1 x 10 6, insan akciğer kanser hücresi H460 ya da tuzlu su (aynı zamanda eksozom işaretleyici insan CD63, GFP ifade eden transfekte edilmiş bir hücre hattı) bir interplevral enjeksiyonu yapıldı. Tuzlu su, 100 ul bir negatif kontrol alınan ve 9 farenin hücre enjeksiyonu yapılmıştır 11 farenin vardı. 20 gün sonra serum, tükürük örnekleri İki fare grubu toplanmıştır.
Fareler serum ve tükürük insan CD63-GFP proteini göreli seviyelerinin EFIRM yöntemi izin ölçümü kullanımı. İki fare serum ve tükürük arasındaki görece seviyelerinin karşılaştırılması, iki Biofluids (R, = 0.79) arasında doğrusal bir ilişki bulunduğunu göstermiştir. H460 tuzlu su enjekte edilmiş farelerde karşı fareleri enjekte Ek olarak, önemli bir fark, insan CD63-GFP düzeyleri gözlenmiştir. Bu uzak tümör hücreleri eksozomlar int insan ticareti olduğunu göstermektedirdamar ve tükürük o. serum ve tükürük karşılaştırırken Sonuçlar Şekil 6'da gösterilmiştir.
Serum ve tükürük insan CD63-GFP, nispi TGs düzeyleri Şekil 6. EFIRM değerlendirilmesi., Insan akciğer kanser hücreleri enjekte edilmiş farelerden insan CDP63-GFP nispi seviyeleri arasındaki karşılaştırma çalışmaları. Doğrusallık insan CD63-GFP serum ve tükürük örnekleri arasında var. Insan CD63-GFP düzeyleri hücreleri ile enjekte edilmiş farelerde önemli ölçüde yükseltilir (salin enjekte edilen farelere kıyasla). Bu rakam Wei ve ark değil. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sonuçlar gösterdiği gibi, anti-insan CD63 kaplı manyetik nanopartikülleri, özellikle 70-100 nm arasında değişen bir boyuta sahiptir, küçük parçacıkları yakalamak mümkündür. Çekilecek parçacık eksozom daha önce gözlenen profili ile tutarlıdır. Bundan başka, parçacıklar yakalanmasından sonra düşük voltajlı CSW kullanım boncuğun yüzeyine kaldırmak ve kargo serbest bırakılması için geleneksel bir liziz tamponu göre yöntem ile benzer DNA parçalanma profilleri neden olduğu da gösterilmiştir. Bu veriler, exosomal yük verildiği akışı eksozom lipid membranı bozuklukları, siklik bir kare dalga uygulanması yoluyla basitleştirilebilir gösterir. Bu basitleştirilmiş yöntem olumsuz eksozom yük etkileyebilir tampon yok edilmesi için gerek kalmadan hızlı bir yük ayrılmasına imkan verir, ve bunun bir sonucu olarak EFIRM yöntem ultra-santrifüj ile liziz kullanımına geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında exosomal içerik çalışmaları için tercih edilen bir yöntem olduğu anlaşılmaktadırtamponlar. EFIRM yöntemin duyarlılığı, özgüllüğü, ve kolaylığı nükleik asitler ve protein hedefleri hem iç içeriği test hızla biyo-sıvı gelen eksozomlar ayıklanması ve için idealdir.
EFIRM yöntemi H460 insan akciğer kanser hücresi ile enjekte edilmiş bir çıplak fare modeli çalışması uygulandı. Eksozom yüzey işaretleyicileri CD63, floresan özelliğine sahip olur ve böylece H460 insan akciğer kanser hücreleri ek olarak insan CD63-GFP ile transfekte edilmiştir. 20 günlük bir süre sonra, fare serumu ve tükürük örnekleri alındı ve EFIRM metodolojisi exosomal içeriğini analiz etmek için kullanıldı. Bu çalışma, serum ve tükürük örnekleri (R = 0.79) arasında doğrusal bir korelasyon gösterdi. Bu sonuçların etkileri iki yönlüdür: Birincisi, Biofluids gelen eksozomlar yakalamak yeteneği uzak kanser hücreleri, bu çalışmada en önemlisi, vücudun diğer kesimlerine oral kavite eksozomlar iletmek mümkün olduğunu göstermektedir. Ssaniyeye serum, tükürük örnekleri arasında gözlenen doğrusallık tükürük gövdesinin (örneğin, kanser) ve moleküler içeriğin analizi Hastalık durumunda, üretilen eksozom yakalama için güvenilir bir biyo-sıvı olabileceğini düşündürmektedir.
yöntem tarif ve sonraki sonuçlar yöntemi yüzey belirteçleri dayalı Biofluids gelen eksozomlar ayıklanması için uygun olduğunu göstermektedir (bu çalışmanın kapsamında, CD 63 Seçilen yüzey belirtecidir). Gelecekteki projeler için, (örneğin CD 9 gibi) ek yüzey belirteçleri eksozomlar hedef veya diğer tekniklerle EFIRM yöntemi birleştirerek eksozom içerik çıkarma ve test artıracak olup olmadığını incelemek için liyakat olduğunu.
Exosome biyoloji öteleme ilaç için çalışmanın umut verici bir alandır, ve aşağıdaki çalışmanın verileri tükürük exosomal analizi hastalığı ayrımcı biyomarkırları belirlenmesi için bir mekan olabileceğini düşündürmektedir. Gelecek soruşturmaDistal hastalık biyobelirteçlerinin non-invaziv tanı için kullanılabilir olup olmadığını belirlemede uygun görünüyor. Bir yöntem olarak EFIRM eksozom içinde böyle hedeflerin daha etkili analiz önünü yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
David Wong RNAmeTRIX Inc., moleküler tanı şirketin kurucularından. PeriRx LLC RNAmeTRIX moleküler tanı ile ilgili fikri mülkiyet alt lisansı. David Wong PeriRx bir danışmandır.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi ve (FW) Hibe UL1TR000124 aracılığıyla Translational Sciences, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Advancing Ulusal Merkezi tarafından desteklenen; Felix & Mildred Yip donatılmış Profesörlük ve (DTWW için) Barnes Aile Fonu, (MT) Ödül Numarası T90DE022734 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Diş & Kranyofasiyal Research Ulusal Enstitüsü. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3 M KCl Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).
- Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).
- Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).
- Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).
- Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).
- Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).
- Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).
- Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).
