Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Exosomes er microvesicular strukturer som spiller en meklerrolle i interkommunikasjon. Det er av interesse å studere i laste av exosomes å finne ut om de bærer sykdoms diskriminerende biomarkører. For å utføre exosomal analyse, er det nødvendig å utvikle en metode for ekstrahering og analyse av exosomes fra target biofluids uten å skade det indre innhold.
Elektrisk felt-indusert frigjøring og måling (EFIRM) er en metode for spesielt trekke ut exosomes fra biofluids, lossing sin last, og teste deres interne RNA / protein innhold. Ved hjelp av et anti-humant CD63-spesifikt antistoff magnetiske mikropartikkel, er exosomes først utfelt fra biofluids. Etter ekstraksjon, lavspente elektriske sykliske firkantbølger (CSW) er brukt for å forstyrre vesicular membran og føre last lossing. Innholdet i exosome blir hybridisert til DNA-primere eller antistoffer immobilisert på en elektrodeoverflate for quantification av molekylær innhold.
Den EFIRM metoden er fordelaktig for utvinning av exosomes og lossing last for analyse uten lysisbuffer. Denne metoden er i stand til å utføre spesifikk påvisning av både RNA- og protein biomarkør mål i exosome. EFIRM ekstrakter exosomes spesielt basert på deres overflatemarkører i motsetning til størrelse baserte teknikker.
Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og analysen viser funksjonaliteten av fremgangsmåten for exosome fangst og analyse. Den EFIRM metode ble anvendt for å exosomal analyse av ni mus injisert med human lungekreft H640-celler (en cellelinje transfektert for å uttrykke exosome markør human CD63-GFP) for å teste deres exosome profil mot 11 mus som mottok saltløsningskontrollene. Forhøyede nivåer av exosomal biomarkører (referanse genet GAPDH og protein overflaten markør human CD63-GFP) ble funnet for den H640 injisert mus i både serum og spyttprøver. Videre saliva, og serumprøver ble vist å ha linearitet (R = 0,79). Disse resultatene er tankevekkende for levedyktigheten av spytt exosome biomarkører for påvisning av distale sykdommer.
Exosome forskning er et voksende felt av etterforskningen som undersøker lipid mikrovesikler som bærer RNA 1, DNA to, og protein tre last. Tidligere undersøkelser av exosome biologi har ført til identifisering av exosomes i biofluids som blod 4, urin 5, morsmelk 6, og spytt 7. Studier har vist at exosomes spille en rolle i forskjellige cellulære veier, eksternt meditere kommunikasjon mellom forskjellige systemer i kroppen 8. På grunn av den rollen exosomes spille i inter kommunikasjon, er det en hypotese om at de kan pakke biomolekyl mål (protein, RNA, og DNA) korrelerte med sykdomstilstander. In vitro tre og dyremodell ni studier synes å bekrefte denne hypotesen. I å undersøke exosomal innhold for biomarkører, er det nødvendig å utvikle en metode for selektiv exosome isolasjon fra biofluids, indusert expulsipå av last fra exosomes, og kvantifisering av exosome biomolekyler. I den utstrekning av dette arbeidet, vil exosomes bli definert som en struktur med en diameter på omtrent 70 til 100 nm og besitter overflatemarkører CD63.
Forskere typisk først rense exosomes av ultrasentrifugering 10 og deretter behandle exosomal innhold gjennom bruk av lysis buffer kits. Bruk av lyseringsbuffer metoder krever inkubasjonstider som strekker seg fra minutter til timer. Denne prosessen kan potensielt skade exosome last og føre til prøve degradering. For eksempel, spytt exosome RNA frigitt via lysisbuffer i det omgivende ekstracellulære miljøet besitter en halveringstid på under ett minutt, noe som gjør måling av exosomal RNA post-lysisbuffer en særlig vanskelig oppgave uten tilsetning av stabiliserings reagenser 11. Forverret effekten av å legge ulike reagenser for lysering og stabilisering kan innføre midler som vanskelig og forstyrre analysis av exosomal innhold. En alternativ tilnærming kan være nyttig for hurtig lossing exosomal innhold og trygt å bevare lasten for karakterisering.
I dette arbeidet, foreslår bruken av et ikke-uniformt elektrisk felt for frigjøring av exosomal innhold. Elektrisk-felt er kjent for å bære evne til å polarisere og forstyrre det ytre lipid bilaget som danner cellemembraner. Vår eksperimentelt arbeid utforsker bruk av uensartede sykliske firkantbølger (CSW) for å forstyrre mikrovesikkelen strukturen i exosomes og slippe gjennomført last. Denne metoden bruker spenninger i flere hundre millivolt rekkevidde, noe som betyr at de fleste biomolekyler ikke vil bli forstyrret. Vi viser at bruken av en cyklisk-firkantbølge er i stand til å aktivere frigjøring av spytt exosome mRNA-innholdet i det omgivende fluidmiljø. Denne utgaven av exosomal innhold er sømløst integrert med en elektrode system som kan brukes til å kvantifisere biomarkør uttrykk nivåer 12,13. Denne foreslåtte metoden gjør det mulig for rask, følsom, og lysisbuffer gratis analyse av exosome innhold.
Figur 1. Oversikt over EFIRM arbeidsflyt.. The EFIRM metode grovt deles inn i tre hovedfaser som er nødvendige for å rense og analysere exosomes.
Dette CSW basert exosomal innhold utgivelsen og analysemetode er brukt i forbindelse med CD63-spesifikke magnetiske mikroperler for exosome isolasjon. Disse CD63-affinitet perler gir mulighet for selektiv isolering av exosomes fra spyttprøver (og andre biofluids). Etter inkubering og utvinning av exosomes ved hjelp av de magnetiserte kuler, blir kulene overført til den elektrokjemiske sensorsystemet for CSW basert innhold frigjøring og analysedelen av forsøket. Figur 1 gir en oversikt over arbeidetflyt av EFIRM metoden.
Som resultatene viser, anti-human CD63 belagte magnetiske nanopartikler er i stand til spesifikt å fange opp små partikler som har en størrelse i området 70-100 nm. Dette fanges partikkel er i overensstemmelse med den tidligere observerte profil exosomes. Videre er bruken av lavspent CSW etter fangst av partiklene vist seg å fjerne dem fra kuleoverflaten og forårsake DNA-degraderingsprofil lik den i et tradisjonelt lysisbuffer basert metode for frigjøring av last. Disse dataene indikerer at arbeidsflyten av exoso…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Nasjonalt Senter for Forskningsressurser og Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences, National Institutes of Health, gjennom Grant UL1TR000124 (til FW); Felix & Mildred Yip gaveprofessorat og Barnes Family Fund (til DTWW), National Institute of Dental og kraniofaciale Forskning av National Institutes of Health i henhold Award Number T90DE022734 (til MT). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |