تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em> انواع معينة ايليجانس</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
لقد كان تحديد سمية الإنجابية من آلاف المواد الكيميائية الموجودة في بيئتنا واحدة من أكثر التحديات محيرة في مجال الصحة البيئية. ويرجع ذلك جزئيا إلى ندرة نظم النموذج الذي يمكن (1) تلخيص بدقة ملامح مفاتيح العمليات الإنجابية و(2) القيام بذلك في المتوسط إلى الإنتاجية العالية الموضة، من دون الحاجة إلى وجود عدد كبير من الحيوانات الفقارية.
وصفنا هنا مقايسة في C. الخيطية ايليجانس التي تسمح للالتعرف السريع على المواد السامة الجرثومية من خلال رصد تحريض الأجنة مختل الصيغة الصبغية. من خلال الاستفادة من خط مراسل GFP، وأخطاء في العزل الصبغي الناجمة عن انقطاع سلالة الجرثومية وتصور بسهولة وكميا بواسطة المجهر الآلي مضان. وهكذا فإن فحص مجموعة معينة من المركبات لسميتها يمكن أن يؤديها في شكل لوحة 96- إلى 384 جيدا في غضون أيام. تحليل ثانوي للح إيجابيةلها يمكن القيام بها لتحديد ما إذا كان الشذوذ الصبغي نشأت من اختلال الانتصافي أو من أوائل الجنينية أخطاء كروموسوم الفصل. وإجمالا، يمثل هذا الاختبار استراتيجية مرور الأول-سريعة للتقييم السريع من اختلال وظيفي الجرثومية التالية التعرض للمواد الكيميائية.
Introduction
هناك ما يقرب من 87،000 من المواد الكيميائية المسجلة للتجارة في الولايات المتحدة، ولكن فقط عدد قليل من هذه قد تم اختبارها للآثار الصحية المحتملة 1. من تلك التي تم اختبارها، تم تقييم سوى جزء للآثار الصحية الإنجابية ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة في تحديد تحوير الأحداث الإنجابية المبكرة في الثدييات، وخصوصا خلال الإناث تطوير الخلية الجرثومية والتمايز. في الواقع، أول الأحداث الانتصافي تجري خلال المراحل الأولى من التطور الجنيني في الثدييات الإناث، وبالتالي فهي صعبة للوصول إلى وجمع بأعداد مناسبة لأغراض الفحص.
يوفر الجرثومية على الرابط الحاسم بين الأجيال، وظيفتها المناسبة تعتمد على التنفيذ الدقيق للبرنامج معقد من الانقسام الخلوي والكروموسومات يسمى الانقسام الاختزالي. ديسريغولاتيون عملية الانتصافي قد يؤدي إلى انخفاض الخصوبة وإنتاجالأمشاج والأجنة مع عدد غير طبيعي من الكروموسومات، وصفته حالة عدم توازن الصبغيات. أخطاء العزل الصبغي في الانقسام الاختزالي هي ذات أهمية كبيرة لصحة الإنسان. شذوذ صبغي شائعة، مع تردد من 1 في 150 ولادة حية، تثلث الصبغي 21 و 18 و 13 وكذلك X و Y أخطاء كروموسوم يجري أنواع الأكثر انتشارا 2،3. وعلاوة على ذلك، والتشوهات الخلقية، بما في ذلك أصول الكروموسومات، هي السبب الرئيسي للوفاة الرضع في الولايات المتحدة 4 إن فكرة أن التأثيرات البيئية يمكن أن تؤثر على الفصل الكروموسومات والسلوك ليس جديدا 5، ولكن لا تزال غير مفهومة. ولذا فمن الأهمية بمكان لتحقيق أي من المواد الكيميائية التي أدخلت بيئتنا تتداخل مع خصوبة الإنسان والتنمية في وقت مبكر والصحة الإنجابية الشاملة.
في ضوء هذه القيود المفروضة على نماذج الثدييات، وقد وضعنا شاشة الفحص الإنتاجية العالية لاختبار سمية الإنجابية في الدودة <م> C. ايليجانس. لقد حشدت العديد من الميزات الهامة التي يوفرها هذا النظام النموذجي الوراثية التي يشيع استخدامها مثل صغر حجمها، وانخفاض التكلفة، ودورة التكاثر قصيرة، نسبة عالية من الخلايا الجرثومية وسهولة التلاعب 6. يمكن زراعتها الديدان في لوحات 96-جيدا أو في الثقافات السائل حجم عالية وذلك بسبب شفافيتها يمكن تصوير مباشرة على لوحات للكشف عن صحفيين الفلورسنت. الفحص هو موضح أدناه يستفيد من هذه الخصائص ويستفيد من سلالة دودة تحتوي على مراسل الفلورسنت Pxol-1 :: GFP للكشف عن انقطاع سلالة الجرثومية وتحريض عدم توازن الصبغيات الجنينية.
ويستند استخدام هذه السلالة المراسل على البروز نادر عموما من الذكور في السكان دودة خنثوي في المقام الأول. هذه الذكور (<0.2٪) تنشأ بشكل طبيعي من خطأ في الفصل بين كروموسوم X 7. لكن، وكما تعطل الجرثومية يؤدي في كثير من الأحيان إلى أخطاء في فصل الجسميةوheterochromosomes، فإنه يرتبط على حد سواء مع ارتفاع معدل انتشار الإصابة الذكور النمط الظاهري (X missegregation)، وكذلك الفتك الجنينية (صبغي جسدي missegregation). للكشف بسهولة تحريض من الذكور في حين الالتفاف على قضية الفتك الجنينية، ويستخدم مروج المحدد لذكر (XOL-1) لدفع التعبير عن GFP في الأجنة المبكرة لا يزال الواردة في الرحم الدودة. على هذا النحو، ويستخدم ظهور الأجنة، معربا عن GFP كبديل لوجود الأجنة مختل الصيغة الصبغية. تم عرض هذه الطريقة تستخدم في السابق لتحديد الجينات المتورطة في صيانة سلالة الجرثومية والانقسام الاختزالي 8،9. تكييفها لفحص الكيميائي، وتوظيف هذه السلالة في المتوسط إلى شاشة عالية الإنتاجية. الأهم من ذلك أن سلالة تقارير بأمانة aneugenicity من المواد الكيميائية وبالتالي فهي ذات الصلة لنقاط النهاية الإنجابية الثدييات 10. سوف مقايسة الموصوفة هنا تكون مفيدة بشكل خاص لعلماء السموم في إعدادات صناعة الكيماويات الدوائية وتبحثلتقييم بسرعة سمية المواد الكيميائية نحو النهاية الإنجابية. وعلاوة على ذلك، هذا الاختبار محاذاة تماما مع الأولويات الحكومية سلط عليها الضوء في سمية في 21 تقرير القرن الحادي و11.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا يشكل أول استراتيجية واسعة النطاق لتحديد المواد السامة الجرثومية. ويتطلب ذلك استخدام المعدلة وراثيا GFP Pxol-1 :: GFP تحتوي على السلالة التي تقارير بأمانة تحريض عدم توازن الصبغيات في الأجنة المبكرة والذي يستخدم كبديل لضعف الجرثومية. ينطوي على طري?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. . Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
