הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em> Elegans Caenorhabditis</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
זיהוי רעיל הרבייה של אלפי כימיקלים הנמצאים בסביבה שלנו היה אחד האתגרים המפתים ביותר בתחום בריאות והסביבה. זה נובע בחלקו המיעוט של מערכות מודל ש( 1) יכול במדויק לשחזר תכונות מפתחות של תהליכי רבייה ו( 2) לעשות זאת בצורה בינונית עד תפוקה גבוהה, ללא הצורך במספר גבוה של בעלי חיים בעלי חוליות.
אנו מתארים כאן assay בג נמטודות elegans המאפשר זיהוי המהיר של רעלים בתאי מין על ידי ניטור האינדוקציה של עוברי aneuploid. על ידי עשיית שימוש של קו כתב GFP, טעויות בהפרדת כרומוזום הנובעת מהפרעה בתאי מין הם דמיינו בקלות ולכמת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי. כך ההקרנה של מערכת מסוימת של תרכובות לרעילותו יכולה להתבצע בפורמט צלחת 96 384 היטב בעניין של ימים. ניתוח משני של h החיובישלה ניתן לבצע כדי לקבוע אם מומי כרומוזום מקורו מהפרעת meiotic או מטעויות הפרדה כרומוזום עוברית מוקדמות. בסך הכל, assay זה מייצג אסטרטגיה הראשונה לעבור מהר להערכה המהירה של בעיות בתפקוד תאי מין בעקבות חשיפה כימית.
Introduction
ישנם כ 87,000 כימיקלים רשומים למסחר בארצות הברית, אך רק מספר קטן של אלה נבדקו להשפעות בריאותיות פוטנציאליות 1. מבין אלה שנבדקו, רק חלק כבר העריך להשפעות פוריות נובעות בחלקו הקושי בקביעת שינוי באירועי הרבייה המוקדמים ביונקים, במיוחד בפיתוח תאי נבט נשי ובידול. ואכן, אירועי meiotic הראשונים יתקיימו במהלך המוקדמים של התפתחות עוברית ביונקי נקבת השלבים ולכן קשים לגישה וללאסוף במספרים מתאימים למטרות הקרנה.
Germline מספקת קישור החיוני בין דורות, והפונקציה המתאימה תלויה בביצוע המדויק של התכנית המורכבת של חטיבת הסלולר וכרומוזומליות מכונה מיוזה. אי סדיר של תהליך meiotic עלול לגרום לירידה בפוריות והייצור שלתאי מין ועוברים עם מספר לא תקין של כרומוזומים, מצב המכונים aneuploidy. טעויות הפרדה כרומוזום במיוזה רלוונטיות מאוד לבריאות אדם. חריגות כרומוזום נפוצות, בתדירות של 1 ל 150 לידות חיות, 21 טריזומיה, 18 ו -13, כמו גם טעויות כרומוזום X ו- Y להיות הסוגים הנפוצים ביותר 2,3. יתר על כן, מומים מולדים, כוללים אלה של מקורות כרומוזומליות, הם הגורם המוביל למוות תינוק בארה"ב 4 הרעיון שהשפעות סביבתיות יכולות להשפיע על הפרדה והתנהגות כרומוזומלית הוא לא חדש 5, אבל עדיין הבין היטב. לכן זה חיוני כדי לחקור מי מהכימיקלים מוחדרים הסביבה שלנו מפריעים לפוריות אדם, התפתחות מוקדמת ופוריות כוללת.
לאור המגבלות של המודלים של יונקים אלה, פיתחנו assay מסך תפוקה גבוהה כדי לבדוק רעילות רבייה בתולעת העגולה <em> C. elegans. יש לנו התגייס כמה תכונות חשובות המוצעות על ידי מערכת מודל גנטית זה נפוץ כגון גודלה הקטן, בעלות נמוכה, מחזור רבייה קצר, שיעור גבוה של תאי נבט וקלות מניפולציה 6. ניתן לגדל תולעים ב96-גם צלחות או בתרבויות נוזל בנפח גבוהות ובגלל השקיפות שלהם ניתן הדמיה ישירות על צלחות לגילוי של כתבי ניאון. Assay המתואר להלן מנצל מאפיינים אלה ומנצל את מתח תולעת המכיל את כתב ניאון GFP Pxol-1 :: לזהות הפרעה ואינדוקציה של aneuploidy העוברי בתאי מין.
השימוש במתח הכתב הזה מבוסס על ההתרחשות בדרך כלל נדירה של זכרים באוכלוסיית תולעת בעיקר מינית. גברים אלה (<0.2%) נובעים באופן טבעי משגיאה בהפרדה של כרומוזום X 7. עם זאת, כהפרעה בתאי מין בתדירות גבוהה גורם לשגיאות בהפרדה של autosomesושל heterochromosomes, והוא מתואם גם עם שכיחות גבוהה של פנוטיפ גברים (missegregation X) כמו גם קטלנית עוברי (missegregation אוטוזום). כדי לזהות בקלות האינדוקציה של גברים תוך עקיפת הבעיה של הקטלניות עובריים, אמרגן זכר ספציפי (xol-1) משמש לנהוג ביטוי של ה- GFP בעוברים מוקדמים הכילו עדיין בתוך הרחם של התולעת. ככזה, את המראה של עוברים להביע GFP משמש כמדד לנוכחות של עוברי aneuploid. שיטה זו שימשה בעבר לזיהוי גנים מעורבים בתחזוקה בתאי מין ו8,9 מיוזה. מותאם להקרנה כימית, זן זה הוא מועסק במדיום למסך תפוקה גבוהה. חשוב לציין, את המתח בנאמנות מדווח aneugenicity של כימיקלים ולכן הוא רלוונטי לנקודתי קצה רבייה של יונקים 10. Assay שתואר כאן יהיה שימושי במיוחד לtoxicologists בהגדרות תרופות ותעשייה כימית מחפשכדי להעריך במהירות את הרעילות של כימיקלים לנקודתי קצה רבייה. יתר על כן, assay זה מיישר באופן מלא עם סדרי העדיפויות הממשלתיות המודגשים ברעילות בדו"ח המאה ה -21 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן מהווה אסטרטגיה בקנה מידה הגדולה הראשונה לזיהוי רעלים בתאי מין. זה דורש שימוש במהונדס GFP Pxol-1 זן המכיל :: GFP שנאמנות מדווח האינדוקציה של aneuploidy בעוברים מוקדמים המשמש כמדד לתפקוד לקוי של תאי מין. השיטה כרוכה בסנכרון זהיר של ג אוכלוסיית eleg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. . Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
