निमेटोड का प्रयोग जर्मलाइन रासायनिक विषाक्तता के व्यापक मूल्यांकन<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
हमारे वातावरण में मौजूद रसायनों के हजारों की प्रजनन विषाक्तता की पहचान करना पर्यावरणीय स्वास्थ्य के क्षेत्र में सबसे tantalizing चुनौतियों में से एक रहा है। यह हड्डीवाला जानवरों के एक उच्च संख्या के लिए आवश्यकता के बिना (1) सही (2) उच्च throughput फैशन के लिए एक मध्यम में ऐसा प्रजनन प्रक्रियाओं की चाबी सुविधाओं पुनरावृत्ति कर सकते हैं और मॉडल प्रणाली की कमी के कारण भाग में है।
हम निमेटोड सी में यहां एक परख का वर्णन aneuploid भ्रूण की प्रेरण की निगरानी के द्वारा germline विषैले पदार्थ की तेजी से पहचान की अनुमति देता है कि एलिगेंस। एक GFP संवाददाता लाइन का उपयोग करने से, germline विघटन से उत्पन्न गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियों को आसानी से कल्पना कर रहे हैं और स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा। इस प्रकार अपने विषाक्तता के लिए यौगिकों के एक विशेष सेट की स्क्रीनिंग दिन के एक मामले में एक 96- को 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में प्रदर्शन किया जा सकता है। सकारात्मक ज के माध्यमिक विश्लेषणइसके गुणसूत्र असामान्यताओं meiotic विघटन से या जल्दी भ्रूण गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों से उत्पन्न निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस परख रासायनिक प्रदर्शन के बाद germline शिथिलता के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक तेजी से पहली पास रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है।
Introduction
संयुक्त राज्य अमेरिका में वाणिज्य के लिए पंजीकृत लगभग 87,000 रसायन, इन संभावित प्रभाव स्वास्थ्य एक के लिए परीक्षण किया गया है की अभी तक केवल एक छोटा सा नंबर रहे हैं। परीक्षण किया गया है कि उन लोगों में से केवल एक हिस्से को विशेष रूप से महिला जनन कोशिका विकास और भेदभाव के दौरान स्तनधारियों में जल्दी प्रजनन घटनाओं के परिवर्तन का निर्धारण करने में कठिनाई के कारण भाग में प्रजनन स्वास्थ्य प्रभाव, के लिए मूल्यांकन किया गया है। दरअसल, पहले meiotic घटनाओं महिला स्तनधारियों में भ्रूण के विकास के प्रारंभिक दौर के दौरान जगह ले सकता है और इसलिए का उपयोग और स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए उपयुक्त संख्या में एकत्र करने के लिए मुश्किल हैं।
germline पीढ़ियों के बीच महत्वपूर्ण कड़ी प्रदान करता है, और इसकी उचित समारोह सेलुलर और गुणसूत्र डिवीजन के जटिल कार्यक्रम की सटीक निष्पादन अर्धसूत्रीविभाजन करार दिया पर निर्भर है। Meiotic प्रक्रिया का अनियंत्रण प्रजनन क्षमता में कमी और उत्पादन में हो सकता हैगुणसूत्रों की एक असामान्य संख्या के साथ युग्मक और भ्रूण, एक की हालत aneuploidy करार दिया। अर्धसूत्रीविभाजन में क्रोमोजोम अलगाव त्रुटियों मानव स्वास्थ्य के लिए बेहद प्रासंगिक हैं। गुणसूत्र असामान्यताओं एक 1 150 में जीवित जन्मों की आवृत्ति, त्रिगुणसूत्रता 21, 18 और 13 के रूप में अच्छी तरह के रूप में सबसे अधिक प्रचलित प्रकार 2,3 जा रहा है एक्स और वाई गुणसूत्र त्रुटियों के साथ, आम हैं। इसके अलावा, गुणसूत्र मूल के उन सहित जन्मजात विकृतियों, अमेरिका चार में पर्यावरणीय प्रभावों गुणसूत्र अलगाव और व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं विचार है कि शिशु मृत्यु के प्रमुख कारण हैं 5 नया नहीं है, लेकिन अभी भी खराब समझा जाता है। यह मानव प्रजनन, प्रारंभिक विकास और समग्र प्रजनन स्वास्थ्य के साथ हस्तक्षेप कर रहे हैं हमारे वातावरण में पेश किया रसायनों की जो जांच करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।
स्तनधारी मॉडल के इन सीमाओं के प्रकाश में, हम <roundworm में प्रजनन विषाक्तता परीक्षण करने के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन परख विकसित किया हैउन्हें> सी। एलिगेंस। हम इस तरह के अपने छोटे आकार, कम लागत, कम प्रजनन चक्र, जर्म कोशिकाओं के उच्च अनुपात और हेरफेर 6 की आसानी के रूप में इस आमतौर पर इस्तेमाल किया आनुवंशिक मॉडल प्रणाली द्वारा की पेशकश की कई महत्वपूर्ण सुविधाओं जुटाए गए हैं। कीड़े 96 अच्छी तरह से प्लेट में या उच्च मात्रा तरल संस्कृतियों में उगाया जा सकता है और क्योंकि उनकी पारदर्शिता के सीधे फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का पता लगाने के लिए प्लेटों पर imaged किया जा सकता है। नीचे वर्णित परख इन विशेषताओं का लाभ लेता है और germline विघटन और भ्रूण aneuploidy के शामिल होने का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट संवाददाता Pxol-1 :: GFP युक्त एक कीड़ा तनाव का लाभ लेता है।
इस संवाददाता तनाव के उपयोग के एक मुख्य रूप से उभयलिंगी कीड़ा आबादी में पुरुषों की आम तौर पर दुर्लभ घटना पर आधारित है। इन पुरुषों (<0.2%) स्वाभाविक रूप से एक्स गुणसूत्र 7 के अलगाव में त्रुटि से उत्पन्न। हालांकि, germline विघटन के रूप में अक्सर autosomes के अलगाव में त्रुटियों की ओर जाता हैऔर heterochromosomes की, यह पुरुषों फेनोटाइप (एक्स missegregation) और साथ ही भ्रूण मारक (autosome missegregation) के एक ऊंचा घटनाओं के साथ दोनों संबद्ध करता है। भ्रूण मारक के मुद्दे circumventing आसानी से जबकि पुरुषों के शामिल होने का पता लगाने के लिए, एक पुरुष विशेष के प्रमोटर (xol -1) अभी भी कीड़ा के गर्भाशय के भीतर निहित जल्दी भ्रूण में GFP की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जैसे, GFP- व्यक्त भ्रूण की उपस्थिति aneuploid भ्रूण की उपस्थिति के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में प्रयोग किया जाता है। इस विधि में पहले germline रखरखाव और अर्धसूत्रीविभाजन 8,9 में फंसा जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित, इस तनाव उच्च throughput स्क्रीन करने के लिए एक माध्यम में कार्यरत है। महत्वपूर्ण बात है, तनाव ईमानदारी से रसायनों के aneugenicity रिपोर्ट करता है और स्तनधारी प्रजनन समापन 10 को इसलिए प्रासंगिक है। यहाँ वर्णित परख तलाश में दवा और रसायन उद्योग सेटिंग्स में toxicologists करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो जाएगातेजी से प्रजनन समापन की ओर रसायनों की विषाक्तता का आकलन करने के लिए। इसके अलावा, इस परख पूरी तरह से 21 वीं सदी की रिपोर्ट 11 में विषाक्तता में प्रकाश डाला सरकारी प्राथमिकताओं के साथ aligns।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित विधि germline विषैले पदार्थ की पहचान के लिए पहली बार बड़े पैमाने पर रणनीति का गठन किया। यह ईमानदारी से germline में शिथिलता के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में प्रयोग किया जाता है, जो जल्दी भ्रूण में aneuploidy के श…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
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