生殖系化学毒性的利用线虫综合评估<em>秀丽隐杆线虫</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
识别数以千计的出现在我们的环境中的化学物质的生殖毒性已经在环境健康领域中最诱人的挑战之一。这部分对模型系统，可以（1）准确地概括生殖过程的键的功能和（2）这样做的一个中高通量方式的缺乏是由于，而不需要大量的脊椎动物的。
我们在这里描述的线虫C.化验线虫 ，它允许快速鉴定生殖系毒物通过监测非整倍体胚胎的诱导。通过利用GFP报告线，在染色体分离从种系的破坏而导致的错误很容易可视化并用自动荧光显微镜定量。由此一组特定于它的毒性化合物的筛选可以在96至384孔板格式在几天之内进行。积极H第二分析其可以被执行以确定是否染色体异常起源于减数分裂中断或从早期胚胎染色体分离错误。总之，此法代表了一个快速第一遍战略的生殖功能障碍的化学品接触的快速评估。
Introduction
有在美国注册的商业约87000化学品，但只有一小部分，这些已经过测试，潜在的健康影响1。那些已被测试过的，仅一部分被评定为生殖健康的影响，部分原因是在确定改变哺乳动物早期生殖活动的困难，特别是在雌性生殖细胞发育和分化。事实上，第一减数分裂事件发生期间，在雌性哺乳动物胚胎发育的早期阶段，因此难以进入并收集在适于筛选目的号码。
生殖细胞提供了两代人之间的关键环节，其相应的功能是依赖于细胞和染色体分裂的复杂程序的精确执行称为减数分裂。减数分裂过程的失调可导致减少的生育力和生产配子和胚胎染色体数目异常，这种情况被称为非整倍体。减数分裂中染色体分离错误是高度相关的人体健康。染色体异常是常见的，具有一个频率的1在150个活产，21三体，18和13以及X和Y染色体的误差是最普遍的类型2,3。此外，先天性畸形，包括那些染色体来源的，是婴儿死亡的首要原因，在美国4中的环境影响可以影响染色体分离和行为的概念并不是新的5，但仍知之甚少。因此，关键是要考察其引入到我们的环境中的化学物质会干扰人的生育能力，早期的发展和整体生殖健康。
在光的哺乳动物模型的这些限制，我们开发了一种高通量筛选测定法中的蛔虫，以测试生殖毒性<EM>温度。线虫。我们已动员本常用的遗传模型系统提供了几个重要的功能，例如它的尺寸小，成本低，短的再现周期，生殖细胞的比例高，并易于操作6。蠕虫可以生长在96孔板或在高容量液体培养物并由于其透明性，可直接上成像板检测荧光报道的。下面所描述的实验利用了这些特点优势，以含荧光记者Pxol-1 :: GFP检测生殖干扰和诱导胚胎非整倍体的虫株的优势。
使用该报告菌株的是基于通常罕见的男性在一个主要雌雄同体蠕虫人口。这些男性（<0.2％），自然地从错误中X染色体7的隔离起源。然而，由于种系破坏经常导致错误的常染色体的偏析heterochromosomes的和，它与雄性表型（Ⅹmissegregation）以及胚胎致死（常染色体missegregation）升高的发病率相关两者。容易地检测男性的感应而绕过胚胎致死的问题，一个雄性特异性启动子（XOL-1）用于驱动的GFP表达在早期胚胎仍含有蠕虫的子宫内。因此，表达GFP的胚胎的外观被用作用于非整倍体胚胎的存在的代理。此方法已被以前用于确定基因牵连种系维护和减数分裂8,9。适用于化学筛选，这株被采用在中高通量筛选。重要的是，应变忠实报告的化学品的aneugenicity，因此相关的哺乳动物的生殖端点10。这里描述的检测将是特别有用的毒理学家医药和化工等行业的设置看迅速评估朝生殖端点的化学品的毒性。此外，此法完全对准了毒性，在21 世纪11报告强调了政府的优先事项。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处所描述的方法构成第一大规模策略种系毒物的鉴定。它需要使用一个GFP转基因Pxol-1含有应变:: GFP的忠实报告非整倍体的诱导，其中用作种系功能障碍的代理早期胚胎。该方法涉及一个C的仔细同步线虫蠕虫人口和蠕虫暴露于化学品中的96孔格式接着GFP阳性蠕虫通过自动化高含量显微镜成像。
几个步骤这个协议是至关重要的结果的一致性。首先，?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. . Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
