Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
L'identification de la toxicité pour la reproduction des milliers de produits chimiques présents dans notre environnement a été l'un des défis les plus alléchantes dans le domaine de la santé environnementale. Cela est dû en partie à la rareté des systèmes modèles qui peuvent (1) récapituler précision touches caractéristiques des processus de reproduction et (2) le font dans un moyen à la mode à haut débit, sans la nécessité d'un grand nombre d'animaux vertébrés.
Nous décrivons ici un essai chez le nématode C. elegans qui permet l'identification rapide des substances toxiques de la lignée germinale en surveillant l'induction d'embryons aneuploïdes. En faisant usage d'une ligne rapporteur GFP, des erreurs dans la ségrégation des chromosomes résultant de la perturbation de la lignée germinale sont facilement visualisés et quantifiés par microscopie à fluorescence automatisé. Ainsi, la projection d'un ensemble particulier de composés pour sa toxicité peut être effectuée dans un format de plaque à 96 384 puits dans une affaire de jours. Une analyse secondaire des h positifsa peut être effectuée pour déterminer si les anomalies chromosomiques provenaient de la perturbation de la méiose ou de début erreurs chromosome de ségrégation embryonnaires. Au total, ce test représente une stratégie de premier passage rapide pour l'évaluation rapide de la dysfonction de la lignée germinale suite d'une exposition chimique.
Introduction
Il ya environ 87 000 produits chimiques inscrits pour le commerce aux États-Unis, mais seulement un petit nombre d'entre eux ont été testé pour ses effets potentiels sur la santé 1. Parmi ceux qui ont été testés, seule une partie a été évalué pour les effets sur la santé de la reproduction en partie à cause de la difficulté à déterminer l'altération des événements reproduction début chez les mammifères, en particulier au cours du développement des cellules germinales femelles et la différenciation. En effet, les premiers événements méiotiques ont lieu pendant les premiers stades du développement embryonnaire chez les mammifères femelles et sont donc difficiles d'accès et se accumuler dans les numéros appropriés à des fins de dépistage.
La lignée germinale fournit le lien crucial entre les générations, et sa fonction appropriée dépend de l'exécution précise du programme complexe de la division cellulaire et chromosomique appelée méiose. Le dérèglement du processus méiotique peut provoquer une réduction de la fertilité et de la productiongamètes et des embryons avec un nombre anormal de chromosomes, un état appelé aneuploïdie. Chromosomiques erreurs de ségrégation dans la méiose sont très pertinents pour la santé humaine. Les anomalies chromosomiques sont communs, avec une fréquence de 1 à 150 naissances vivantes, la trisomie 21, 18 et 13 ainsi que chromosomes X et Y étant les erreurs types les plus répandus 2,3. En outre, les malformations congénitales, y compris ceux d'origine chromosomiques, sont la principale cause de mortalité infantile aux États-Unis 4 L'idée que les influences environnementales peuvent affecter la ségrégation et le comportement chromosomique ne est pas nouveau 5, mais est encore mal comprise. Il est donc crucial pour enquêter sur laquelle des produits chimiques introduits dans notre environnement sont interférer avec la fertilité humaine, le développement des jeunes et la santé reproductive en général.
À la lumière de ces limites des modèles de mammifères, nous avons développé un test de l'écran à haut débit pour tester la toxicité de la reproduction dans le ascaris <em> C. elegans. Nous avons mobilisé plusieurs caractéristiques importantes offertes par ce système de modèle génétique communément employés comme sa petite taille, à faible coût, cycle de reproduction court, forte proportion de cellules germinales et la facilité de manipulation 6. Worms peuvent être cultivées dans des plaques à 96 puits ou dans des cultures liquides à volume élevé et à cause de leur transparence peuvent être directement visualisés sur des plaques pour la détection des journalistes fluorescentes. Le test décrit ci-dessous tire profit de ces caractéristiques et profite d'une souche du ver contenant le rapporteur fluorescent Pxol-1 :: GFP pour détecter la perturbation lignée germinale et l'induction de l'aneuploïdie embryonnaire.
L'utilisation de cette souche rapporteur est basé sur la présence des hommes généralement rares dans une population de vers principalement hermaphrodite. Ces mâles (<0,2%) proviennent naturellement de l'erreur dans la ségrégation du chromosome X 7. Cependant, comme la perturbation de la lignée germinale conduit souvent à des erreurs dans la ségrégation des autosomeset hétérochromosomes, il est corrélé à la fois avec une incidence élevée de mâles phénotype (X mauvaise ségrégation) ainsi que la létalité embryonnaire (autosome de mauvaise ségrégation). Pour détecter facilement l'induction des hommes tout en contournant la question de la mortalité embryonnaire, un promoteur spécifique mâle (xol-1) est utilisé pour diriger l'expression de la GFP dans les embryons précoces encore contenues dans l'utérus de la vis sans fin. En tant que tel, l'apparition d'embryons exprimant la GFP est utilisée comme indicateur de la présence d'embryons aneuploïdes. Cette méthode a déjà été utilisée pour identifier les gènes impliqués dans le maintien de la lignée germinale et la méiose 8,9. Adapté au dépistage chimique, cette souche est employé dans un milieu à l'écran à haut débit. Surtout, la souche rapporte fidèlement la aneugenicity de produits chimiques et est donc pertinent de paramètres de la reproduction des mammifères 10. L'essai décrit ici sera particulièrement utile pour les toxicologues dans les milieux de l'industrie pharmaceutique et chimique à la recherched'évaluer rapidement la toxicité des produits chimiques sur les effets sur la reproduction. En outre, ce test se aligne pleinement avec les priorités gouvernementales mises en évidence dans la toxicité dans le 21 e rapport de 11 siècle.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici constitue la première stratégie de grande échelle pour l'identification de substances toxiques de la lignée germinale. Il nécessite l'utilisation d'un transgénique GFP Pxol-1 :: GFP contenant la souche qui rend fidèlement l'induction de l'aneuploïdie dans les embryons précoces qui est utilisé comme un proxy pour le dysfonctionnement de la lignée germinale. La méthode implique la synchronisation minutieuse d'un C. elegans population de vers et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
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