El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Tecnologías como la espectroscopia de fluorescencia, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, todos se basan en la fluorescencia, una propiedad ampliamente explotado en aplicaciones bioquímicas, biomédicas y químicas. Fluorescencia, ya sea intrínseco o mediante el etiquetado, se ha explotado para el análisis de patrones de expresión de la proteína y perfiles, el destino celular, interacciones de proteínas y funciones biológicas ^1-9, y por medio de la fluorescencia / Förster de transferencia de energía de resonancia para la detección de interacciones de biomoléculas y los cambios conformacionales ^10-13. Desde el aislamiento de la proteína fluorescente verde victoria Aequorea (GFP) ^14, el descubrimiento de que ocurren naturalmente proteínas fluorescentes adicionales de otros cnidarios, en particular los corales, ha aumentado en gran medida el número de proteínas fluorescentes distinguibles existentes con espectros de excitación / emisión. Estos, junto con la introducción de mutaciones en sus genes ^15-19, have amplió aún más las posibilidades, la obtención de una verdadera paleta de proteínas fluorescentes disponibles para los científicos que explotan la microscopía, citometría de flujo y otras tecnologías basadas en fluorescencia para su investigación.

En paralelo, aunque de forma independiente, el desarrollo de la tecnología retroviral ha facilitado drásticamente la expresión estable de la información genética en células de mamíferos ectópico ^20-23. Por lo tanto, no es sorprendente que esta tecnología ha sido utilizada para transferir genes de proteínas fluorescentes en un amplio número de tipos de células y tejidos ^24-28 o para la producción de animales transgénicos ^29-31. Después de la naturaleza de los retrovirus, la información genética de la proteína fluorescente ectópico se introduce dentro del genoma de la célula ³² y la célula se vuelve fluorescente `para ever'. Esta propiedad ha permitido el seguimiento del destino de las células, o de una sola célula dentro de una población de células. La célula ahora fluorescente tiene así adquiel rojo su propio biofirma y puede definirse como códigos de barras. Su biofirma único identifica de otras células, y esto es importante, lo distingue de células manipuladas genéticamente para expresar diferentes proteínas fluorescentes distinguibles con espectros de absorción / emisión. Las aplicaciones biológicas, tales como el seguimiento de los factores de reprogramación hacia la pluripotencia ^33, el análisis de los factores subnuclear para el esclarecimiento de localización nucleolar ^34, la construcción de plásmidos indicadores fluorescentes para estudios transcripcionales ³⁵ o el etiquetado genética de las neuronas para el estudio de arquitectura de red neuronal ³⁶ , son sólo cuatro ejemplos de los muchos que han explotado diferentes genes de proteínas fluorescentes para la misma configuración experimental.

La citometría de flujo ha sido ampliamente utilizado para el análisis de los procesos biológicos a nivel de células individuales, tales como la expresión génica, el ciclo celular, la apoptosis y la señalización a través de fosforiloación ^37-43 .La expresión estable de los genes de proteínas fluorescentes en células de mamífero ha mejorado aún más la utilidad de la citometría de flujo para el análisis celular ^38,44 y las interacciones ligando-receptor ^45. Reforzar la capacidad han permitido que la citometría de flujo para convertirse en una metodología ampliamente utilizada para alto rendimiento y alto contenido de cribado ^46. A pesar del número ahora ampliada de fluorómetros y robótica tecnologías que pueden sistemas de lectura de placas pareja, imágenes y citometría de flujo, parece que hay una falta en el diseño experimental que puede explotar y adaptarse a estas capacidades tecnológicas mejoradas.

Metodologías basadas en células rápidas, confiables, simples y robustas están drásticamente necesarios para aplicaciones multiplexados que mejoran aún más la capacidad de alto rendimiento. Esto es especialmente cierto en el campo del descubrimiento de fármacos en ensayos basados ​​en células de ingeniería en un formato multiplexado pueden mejorar el poder de cribado de alto rendimiento ^39,47-50 </sup>. Multiplexación, ya que permite analizar simultáneamente en una muestra, mejora aún más las capacidades de alto rendimiento ^51-54. Los códigos de barras genético fluorescente no sólo permite la multiplexación elegante, sino también, una vez diseñada, evita la necesidad de protocolos que consumen tiempo, reduce los costes acompañados con anticuerpos, los granos y las manchas ^39,52,55, y puede reducir el número de pantallas de alta requeridas para aplicaciones de rendimiento. Recientemente hemos descrito cómo la tecnología puede mejorar retroviral multiplexación mediante código de barras genético fluorescente para aplicaciones biológicas, mediante la expresión de un ensayo desarrollado previamente para controlar el VIH-1 actividad de la proteasa ^56,57 con diferentes variantes clínicamente prevalentes ^58. La metodología se explica de una manera más descriptiva se centra en la forma de seleccionar y amplificar las células genéticamente con código de barras fluorescentes y cómo producir paneles de poblaciones clonales que expresan proteínas fluorescentes distintas y / o diferente intensit fluorescenciaies. Los paneles de las poblaciones de células diferenciadas en función de sus características fluorescentes mejorar las capacidades multiplexados, que pueden ser más explotado en combinación con ensayos basados ​​en células que abordan diferentes cuestiones biológicas. El protocolo también se describe cómo diseñar un grupo de células con código de barras que llevan uno de los ensayos basados ​​en células previamente desarrollados en el laboratorio, como ejemplo ^59. Este protocolo lo tanto, no se pretende mostrar la tecnología bien establecida retroviral / lentiviral para la transferencia genética, el valor de las proteínas fluorescentes o las aplicaciones de la citometría de flujo ^60,48 sino más bien para mostrar el poder de la mejora de la combinación de los tres para aplicaciones multiplexados.

Protocol

1. Preparación de células de mamíferos, la producción viral y Transducción de códigos de barras genético Placa de 2,5 x 10 6 células adherentes en una placa de 10 cm (o alrededor de 50-60% de confluencia) un día antes de la transfección en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera fetal (FCS). Para retroviral uso de producción de envases línea celular de elección, como Phoenix-GP (una especie de regalo de Gary Nolan, la Universidad de Stanford). NOTA:…

Representative Results

Multiplexing fluorescente barcoded genéticamente células con el propósito de aplicaciones biológicas sólo puede lograrse una vez que se han generado poblaciones clonales individuales. Multiplexación es más efectiva cuando las poblaciones con códigos de barras tienen características fluorescentes distintas claras con solapamiento espectral mínima. El ejemplo mostrado en la Figura 1 con poblaciones clonales de células de mamíferos SupT1 ilustra que las células con códigos de barras con mCher…

Discussion

Aquí dos procedimientos bien establecidos se han combinado; la ingeniería genética a través de la tecnología retroviral y la detección de proteínas fluorescentes utilizando citometría de flujo. Los códigos de barras genético basado en una proteína fluorescente para la producción de líneas celulares únicos proporciona una manera simple y robusta para aplicaciones multiplexados. La generación de células con código de barras de ingeniería genética a través de la tecnología retroviral, es un principio d…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10mL syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter	pall corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells