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Biology

El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

doi: 10.3791/52452 Published: April 14, 2015

Introduction

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Tecnologías como la espectroscopia de fluorescencia, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, todos se basan en la fluorescencia, una propiedad ampliamente explotado en aplicaciones bioquímicas, biomédicas y químicas. Fluorescencia, ya sea intrínseco o mediante el etiquetado, se ha explotado para el análisis de patrones de expresión de la proteína y perfiles, el destino celular, interacciones de proteínas y funciones biológicas 1-9, y por medio de la fluorescencia / Förster de transferencia de energía de resonancia para la detección de interacciones de biomoléculas y los cambios conformacionales 10-13. Desde el aislamiento de la proteína fluorescente verde victoria Aequorea (GFP) 14, el descubrimiento de que ocurren naturalmente proteínas fluorescentes adicionales de otros cnidarios, en particular los corales, ha aumentado en gran medida el número de proteínas fluorescentes distinguibles existentes con espectros de excitación / emisión. Estos, junto con la introducción de mutaciones en sus genes 15-19, have amplió aún más las posibilidades, la obtención de una verdadera paleta de proteínas fluorescentes disponibles para los científicos que explotan la microscopía, citometría de flujo y otras tecnologías basadas en fluorescencia para su investigación.

En paralelo, aunque de forma independiente, el desarrollo de la tecnología retroviral ha facilitado drásticamente la expresión estable de la información genética en células de mamíferos ectópico 20-23. Por lo tanto, no es sorprendente que esta tecnología ha sido utilizada para transferir genes de proteínas fluorescentes en un amplio número de tipos de células y tejidos 24-28 o para la producción de animales transgénicos 29-31. Después de la naturaleza de los retrovirus, la información genética de la proteína fluorescente ectópico se introduce dentro del genoma de la célula 32 y la célula se vuelve fluorescente `para ever'. Esta propiedad ha permitido el seguimiento del destino de las células, o de una sola célula dentro de una población de células. La célula ahora fluorescente tiene así adquiel rojo su propio biofirma y puede definirse como códigos de barras. Su biofirma único identifica de otras células, y esto es importante, lo distingue de células manipuladas genéticamente para expresar diferentes proteínas fluorescentes distinguibles con espectros de absorción / emisión. Las aplicaciones biológicas, tales como el seguimiento de los factores de reprogramación hacia la pluripotencia 33, el análisis de los factores subnuclear para el esclarecimiento de localización nucleolar 34, la construcción de plásmidos indicadores fluorescentes para estudios transcripcionales 35 o el etiquetado genética de las neuronas para el estudio de arquitectura de red neuronal 36 , son sólo cuatro ejemplos de los muchos que han explotado diferentes genes de proteínas fluorescentes para la misma configuración experimental.

La citometría de flujo ha sido ampliamente utilizado para el análisis de los procesos biológicos a nivel de células individuales, tales como la expresión génica, el ciclo celular, la apoptosis y la señalización a través de fosforiloación 37-43 .La expresión estable de los genes de proteínas fluorescentes en células de mamífero ha mejorado aún más la utilidad de la citometría de flujo para el análisis celular 38,44 y las interacciones ligando-receptor 45. Reforzar la capacidad han permitido que la citometría de flujo para convertirse en una metodología ampliamente utilizada para alto rendimiento y alto contenido de cribado 46. A pesar del número ahora ampliada de fluorómetros y robótica tecnologías que pueden sistemas de lectura de placas pareja, imágenes y citometría de flujo, parece que hay una falta en el diseño experimental que puede explotar y adaptarse a estas capacidades tecnológicas mejoradas.

Metodologías basadas en células rápidas, confiables, simples y robustas están drásticamente necesarios para aplicaciones multiplexados que mejoran aún más la capacidad de alto rendimiento. Esto es especialmente cierto en el campo del descubrimiento de fármacos en ensayos basados ​​en células de ingeniería en un formato multiplexado pueden mejorar el poder de cribado de alto rendimiento 39,47-50 51-54. Los códigos de barras genético fluorescente no sólo permite la multiplexación elegante, sino también, una vez diseñada, evita la necesidad de protocolos que consumen tiempo, reduce los costes acompañados con anticuerpos, los granos y las manchas 39,52,55, y puede reducir el número de pantallas de alta requeridas para aplicaciones de rendimiento. Recientemente hemos descrito cómo la tecnología puede mejorar retroviral multiplexación mediante código de barras genético fluorescente para aplicaciones biológicas, mediante la expresión de un ensayo desarrollado previamente para controlar el VIH-1 actividad de la proteasa 56,57 con diferentes variantes clínicamente prevalentes 58. La metodología se explica de una manera más descriptiva se centra en la forma de seleccionar y amplificar las células genéticamente con código de barras fluorescentes y cómo producir paneles de poblaciones clonales que expresan proteínas fluorescentes distintas y / o diferente intensit fluorescenciaies. Los paneles de las poblaciones de células diferenciadas en función de sus características fluorescentes mejorar las capacidades multiplexados, que pueden ser más explotado en combinación con ensayos basados ​​en células que abordan diferentes cuestiones biológicas. El protocolo también se describe cómo diseñar un grupo de células con código de barras que llevan uno de los ensayos basados ​​en células previamente desarrollados en el laboratorio, como ejemplo 59. Este protocolo lo tanto, no se pretende mostrar la tecnología bien establecida retroviral / lentiviral para la transferencia genética, el valor de las proteínas fluorescentes o las aplicaciones de la citometría de flujo 60,48 sino más bien para mostrar el poder de la mejora de la combinación de los tres para aplicaciones multiplexados.

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Protocol

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1. Preparación de células de mamíferos, la producción viral y Transducción de códigos de barras genético

  1. Placa de 2,5 x 10 6 células adherentes en una placa de 10 cm (o alrededor de 50-60% de confluencia) un día antes de la transfección en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera fetal (FCS). Para retroviral uso de producción de envases línea celular de elección, como Phoenix-GP (una especie de regalo de Gary Nolan, la Universidad de Stanford).
    NOTA: La línea celular de empaquetamiento expresa de forma estable las proteínas Gag y Pol para la formación de partículas retrovirales en trans. Hacer que las células estén sanas y adherido a la placa en una monocapa, antes de la transfección.
  2. 24 horas más tarde, preparar la mezcla de transfección de ADN.
    1. Para 125 l de DMEM libre de suero añadir 3 g de la estomatitis vesicular envoltura del virus vector glicoproteína (PCI-VSVG) y 3 g de vector de transferencia que lleva el gen de la proteína fluorescente de interés. Mezclar y añadir 15 l de polietilimina (2 mg / ml).
    2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min y añadir a las células gota a gota.
      NOTA: polietilimina se añade a la mezcla de ADN homogéneo como reactivo de transfección para la formación de poliplejos. Con el fin de obtener partículas virales que llevan diferentes marcadores de proteínas fluorescentes, realice cada transfección independiente con el marcador de elección. Recuerde que el vector de transferencia retroviral es de alrededor de 7 kb de longitud y no puede ser empaquetado si es superior a 10 kb.
  3. Incubar las placas a 37 ° C. Con el fin de aumentar la producción de placas virales lugar a 30 ° C o 32 ° C en lugar.
    NOTA: 24 el medio de transfección enviar hr pueden ser reemplazados con 7 ml de medio fresco, y aunque esto puede mejorar la salud de las células que pueden disminuir la carga viral en el sobrenadante.
  4. Después de la transfección de 48 horas a recoger las partículas virales que contiene sobrenadante y filtrar con un filtro de 0,45 mM politetrafluoroetileno. Utilice sobrenadante viral recién recogida para la transducción. OthDe otro mantener sobrenadante en alícuotas a -80 ° C y evitar la congelación-descongelación. Recuerde que el título viral disminuirá probablemente hasta un 50% con cada ciclo de congelación-descongelación.
  5. Línea celular Placa de elección 24 horas antes de la transducción si adherente, o inmediatamente antes de la transducción si no adherente. Semillas 2,0 x 10 5 a 3,0 x 10 5 células adherentes (aquí Eh 7.5.1 y HEK 293T) o 5.0 x 10 5 a 1 x 10 6 células no adherentes (aquí SupT1) por pocillo en una placa de 6 pocillos.
    NOTA: Asegúrese de calibrar el número de células que se sembró antes de la transducción, especialmente para las células adherentes, por lo que las células alcanzan una confluencia del 60% en el momento de la transducción.
  6. Añadir 5 g / ml polibreno (bromuro de hexadimethrene) a las células sembradas y luego añadir sobrenadante viral recogido previamente para obtener alrededor de 20-40% de infección (en este caso 2 ml).
    NOTA: El MOI o porcentaje de infección es principalmente arbitraria, como la clasificación permitirá amplificar cualquier subpopulation de las células. Obviamente, una mayor tasa de infección facilita y acelera el proceso de amplificación.
  7. Transducir células por centrifugación en un rotor de cubo colgante en 1500 xg durante 120 min a 32 ° C. Resuspender las células no adherentes con medio fresco antes de la incubación. Para células adherentes, reemplazar con fresco medios 24 horas después de la transducción.
    NOTA: Se recomienda sellar las placas antes de la centrifugación con parafilm para evitar que se derrame más. Para aumentar la diversidad de células genéticamente con código de barras, transducir las células con partículas virales que llevan diferentes proteínas fluorescentes (obtenidas de la etapa 1.4). Al elegir los marcadores fluorescentes, asegúrese de que son compatibles con la instrumentación y tienen parámetros fluorescentes distinguibles.

2. Selección y Amplificación de células genéticamente con código de barras

  1. Analice las células de mamíferos transducidas por citometría de flujo, al menos, 72 h después de transducción para cuantificar el porcentaje de transducción. Utilice una línea de células no transducidas comparable como control negativo.
    NOTA: Como clasificación se utiliza para purificar poblaciones celulares con códigos de barras individuales, un alto porcentaje de transducción inicial, aunque no es necesario, debe acelerar el proceso de amplificación.
  2. Utilizar la célula clasificador de elección para obtener las células que expresan la proteína de interés.
    1. Para ello, asegúrese de que las puertas se han establecido correctamente en los canales adecuados.
      1. Para ello utilice la misma línea celular ingenuo como control negativo y ajustar la tensión parámetro / canal para que el negativo de la población está por debajo del valor de 10 3 en cada eje fluorescente. Determinar gating para fluorescencia positiva como eventos que aparecen por encima de la del control negativo para cada canal fluorescente.
    2. Tenga en cuenta que cada instrumento puede variar y el voltaje correcto para determinar compuerta debe ajustarse en consecuencia, por lo que los controles positivos y negativos imperativas en cada expconfiguración erimental.
      1. Para la detección de fluorescencia en este montaje experimental utilizar el canal FITC (filtro de paso de banda 530/30 procedió por un filtro de paso 502 de largo) para EGFP, el canal de PE (filtro de paso de banda 585/42 procedió por un filtro 556 pase) para td Tomate , y el canal de APC (filtro de paso de banda 660/20) para E2 Crimson.
        NOTA: El láser de 488 nm excita eGFP y td tomate mientras E2 Carmesí es excitado por el láser de 633 nm.
  3. Ordenar en tubos de 15 ml cónicos con 1 ml de 100% de FCS.
    NOTA: El proceso de clasificación de las poblaciones de células fluorescentes no es obligatorio, según se puede proceder directamente con la especie de clones individuales (véase más adelante). Ordenando las poblaciones ajustados basados ​​en fluorescencia elegido asegura una población de copia de seguridad para la futura selección de clones individuales. Tenga en cuenta que las células individuales son a veces difíciles de cultivar, mientras que una gran población de células puede ser fácilmente congelado, y luego descongelado y se amplifica en una etapa posterior.
  4. Spen bajar las poblaciones clasificadas en un rotor centrífugo cubo colgado en 524 g en 32 ° C durante 5 min para sedimentar las células. Vuelva a suspender en 1 ml de medio fresco, y volver a la placa de células de modo que la confluencia de células es inferior al 60% para permitir el crecimiento y la división durante al menos dos días.
    1. Por ejemplo, las células adherentes placa a alrededor de 3 x 10 5 células en 2 ml de medio por pocillo en una placa de 6 pocillos y 2 x 10 6 células en 2 ml de medio en una placa de 6 cm. Utilice DMEM para las células adherentes y RPMI para las células no adherentes (o cualquier medio especificado si se requiere). Coloque células sembradas en una incubadora a 37 ° C durante varios días para permitir la amplificación.

3. Obtener clonales poblaciones de células genéticamente con código de barras en diferentes intensidades

  1. Obtener poblaciones clonales de células transducidas originalmente (paso 1.7) o de la población ordenada (paso 2.3).
    NOTA: Esto asegurará nivel igual o similar de expresión de la proteína fluorescente entre todos la células dentro de la población (una población apretado con una pequeña CV en la intensidad de fluorescencia media de hasta 40%).
    1. Para ello, las células tipo individuales en placas de 96 pocillos con una unidad de deposición de células automatizado (ACDU). Establecer puertas para la clasificación de acuerdo con la población de interés. Asegurar puertas se establecen al menos un registro escala aparte para obtener poblaciones distinguibles al elegir las células en diferentes intensidades fluorescentes. Para el procedimiento que se muestra aquí, utilizar la misma citometría de flujo experimental establecido como el descrito en el paso 2.2.
  2. Amplificar clones individuales en una incubadora a 37 ° C durante al menos 2 semanas. A través del proceso de amplificación analizar las células bajo el microscopio para asegurar que las poblaciones en crecimiento originan en las células individuales y no de más de uno.
    NOTA: Recuerde que el clasificador colocará una célula por pocillo en promedio, y mientras algunos pozos pueden no tener ninguna célula en absoluto, otros pueden tener más de uno.
    1. Para asegurar que una población surge de una célula única, extremadamente suave con la placa y nunca molestar a los pozos con la pipeta. Observar la placa, así por así, bajo el microscopio.
      NOTA: Mientras que las células individuales pueden ser difíciles de identificar, una vez que comience a dividirse serán fácilmente reconocibles a veces.
    2. Tenga en cuenta que a menudo las células 'mata' a lo largo de los bordes. Deseche los pozos donde se pueden observar múltiples poblaciones clonales y mantener los que tienen una población ajustada.
      NOTA: Es recomendable transferir aquellos en los platos más grandes para la amplificación.
  3. Se tamizan los poblaciones clonales putativos mediante el análisis de ellos por citometría de flujo. Comparación de ellos con un control negativo utilizando la misma configuración experimental citometría de flujo.
    1. Analizar sólo un porcentaje de la muestra y mantener el resto como reserva. Elija las poblaciones más claramente separados basados ​​en la intensidad media y opresión de la población. Amplificar según sea necesario o congelar las existencias enmedio de congelación con 20% de glicerol a -80 ° C durante períodos cortos de tiempo o nitrógeno líquido durante más tiempo.
      NOTA: Recuerde que una "verdadera" población clonal debe tener un patrón de fluorescencia muy apretado.

4. Asegúrese de Capacidades de multiplexación para selección de alto rendimiento (HTS)

  1. Combinar tantos poblaciones clonales distintas según sea necesario que puede ser utilizado adicionalmente en un formato multiplexado. Elige clones con la absorción / espectros de emisión distinguible y / o diferentes intensidades. Si se utiliza un formato de placa de 96 pocillos, que es adecuado para HTS, semilla de 50.000 células en 200 l por pocillo.
    NOTA: Tenga en cuenta que el número de células es sólo una estimación y puede cambiar en función del tipo de célula y si es adherente o no.
  2. Analizar la muestra utilizando citometría de flujo para garantizar que cada una de las líneas de células fluorescentes establecidas independientes se pueden distinguir unos de otros. Antes de preparar el análisis negativoy los controles de un solo color para ajustar los parámetros y los valores de compensación.
    NOTA: Ajuste de los parámetros para distinguir claramente las poblaciones mixtas les permita ser utilizada además en un formato multiplexado.

5. Adaptar líneas celulares genéticamente con código de barras a la aplicación biológica de Elección

  1. Transducir líneas celulares establecidas con códigos de barras genéticamente con partículas virales que contienen los elementos de ensayo de elección, como se describe aquí en Stolp et al., 2013 59. Recuerde que el ensayo de elección debe ocupar un canal fluorescente adicional y distinguibles y por lo tanto se va a transferir a la línea celular con código de barras apropiado.
    NOTA: Cada línea celular con código de barras puede soportar un ensayo diferente.
  2. Células con código de barras Ordenar genéticamente fluorescentes para aquellos que contienen elementos de ensayo.
    NOTA: elementos de ensayo pueden ser diseñados junto a una etiqueta o proteína fluorescente (como una fusión o a través de un sitio interno de entrada al ribosoma) fo detección directa a través de Western Blot, citometría de flujo o microscopía. El sistema utilizado en este protocolo se basa en la expresión de superficie HA epítopo solo, o con la expresión epítopo FLAG adicional.
    1. Manchar las poblaciones clonales que contienen el ensayo con anticuerpos acoplados HA y APC con fluorescencia. Luego de analizar las poblaciones clonales con anti-FLAG y la tinción de anticuerpos conjugados con FITC.
    2. Para rastrear el ensayo, analizar o "descifrar" las poblaciones en el canal adecuado, donde las líneas de células genéticamente distintas con códigos de barras se pueden distinguir. Aquí, decodificar la naturaleza del sustrato mediante el análisis en el canal de PE para la detección de tomate td.

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Representative Results

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Multiplexing fluorescente barcoded genéticamente células con el propósito de aplicaciones biológicas sólo puede lograrse una vez que se han generado poblaciones clonales individuales. Multiplexación es más efectiva cuando las poblaciones con códigos de barras tienen características fluorescentes distintas claras con solapamiento espectral mínima. El ejemplo mostrado en la Figura 1 con poblaciones clonales de células de mamíferos SupT1 ilustra que las células con códigos de barras con mCherry y proteína fluorescente ciano (PPC) se pueden analizar fácilmente al mismo tiempo sin perder sus características fluorescentes individuales. Por tanto, esta matriz es un ejemplo de un panel de células genéticamente con códigos de barras fluorescentes que se puede utilizar para aplicaciones biológicas de multiplexación con una lectura en todavía un canal disponible adicional. A fin de obtener un panel tal, es importante recordar la naturaleza de la tecnología retroviral, lo que conducirá a intervalos variables de intensidad de fluorescencia dentro de la población debido a ef insercionaldefectos y / o MOI. La Figura 2 ilustra que la transducción inicial de células de mamífero con partículas virales que contienen cualquiera td tomate o E2 carmesí resultados en las células que expresan uno o ambos de las proteínas fluorescentes en una amplia gama de intensidades (panel izquierdo). Selección y clasificación de células individuales en placas de 96 pocillos como se muestra por las cajas cerradas (mediados del panel), permiten que una obtenga poblaciones clonales apretados siguientes expansión (panel derecho). Una población apretado debe ser definida como teniendo una pequeña CV que puede variar según el tipo de célula, normalmente 30-40% en la intensidad de fluorescencia media. Figura 2 ilustra también que para aumentar aún más el número de poblaciones genéticamente con código de barras con una matriz de sólo dos fluorescente proteínas, también se puede explotar la intensidad de fluorescencia. En general, una desviación de registro en la intensidad de fluorescencia media entre poblaciones es adecuado para lograr la separación adecuada entre sí después de la selección y amplificación deción. Td tomate fue elegido en el ejemplo mostrado para ilustrar esta característica, donde dos poblaciones de diferentes intensidades, medias y altas, se obtuvieron para la multiplexación con E2 carmesí en una sola intensidad.

La multiplexación es una poderosa herramienta para facilitar el análisis de muchas muestras al mismo tiempo y por la capacidad de decodificar las poblaciones enmascarados. Mejora de multiplexación se puede lograr con una tercera proteína fluorescente tal como eGFP, siempre y cuando las propiedades espectrales no interfieren unos con otros. En el procedimiento experimental se ilustra en la figura 3 el panel de seis poblaciones obtenidos con td Tomate y E2 carmesí fue explotada para aumentar la multiplexación con eGFP. Tecnología retroviral se utiliza para transferir eGFP a las poblaciones representadas en una de las matrices. Cuando se observa en el canal de eGFP, los ingenuos matriz de seis población no verde (panel superior izquierdo en la figura 3) es indistinguible de la eGFP-transducedmatriz de población (panel inferior izquierdo en la figura 3). Es importante destacar que los paneles pueden ser analizados en los canales ocupados por el código de barras genético original (td Tomate y E2 Carmesí). Mientras indistinguibles en estos canales (comparar las poblaciones de 1-6 con poblaciones 07/12 a mediados de los paneles, Figura 3), las poblaciones individuales se pueden analizar en el canal de eGFP y decodificados o rastreados hacia atrás, como se muestra en los histogramas (paneles de la derecha en la Figura 3). Después de repetir el proceso de transducción, selección, clasificación, y la amplificación, aprovechando los canales desocupados es inútil si la compensación derecho no se aplica para ajustar por el posible solapamiento espectral. Para probar esto, cuando las poblaciones de 1, 2, 3 (no verde) y 7, 8, 9 (verde) se analizan en el eGFP y td canales de tomate, las poblaciones 7 y 8 son difíciles de distinguir (panel izquierdo en la figura 4) . Por tanto, es necesario elegir ingenuo células (población 1) como una estafa negativocontrol de manera que los parámetros de la instrumentación se pueden ajustar. Al analizar cualquier matriz, especialmente con fluoróforos espectralmente que se superponen, es imperativo que los controles de color individuales se utilizan para determinar los valores de compensación correctos. En el análisis de la Figura 4 poblaciones 2 o 3, y 7 sirven para este propósito, lo que permite definir mejor las poblaciones que son verdaderamente doble positivos (poblaciones 8 y 9).

Células genéticamente con códigos de barras con marcadores fluorescentes conservan su propia identidad como se define por su biofirma, cuando se analiza en el canal fluorescente derecha con el instrumento adecuado. Sin embargo, la firma biológica se convierte simplemente en una propiedad individual adicional a menos explotados para aplicaciones biológicas. Con el fin de demostrar el poder de los códigos de barras genético fluorescente para la multiplexación decidimos introducir uno de nuestros ensayos previamente desarrollados para el descubrimiento de fármacos en algunas de las líneas de células de mamíferos con código de barras fluorescentes. Al hacerlo, FLUORESCent código de barras genético fue explotada para lograr tres ensayos en una muestra. En este procedimiento un andamio de proteínas que contiene uno de los tres sustrato viral putativo para proteolisis se transfirió a las células con códigos de barras genéticamente. En el ensayo, la escisión se revela por la pérdida del epítopo FLAG en la superficie celular (Figura 5B). En contraste, tinción de la superficie bandera representa la falta de escisión La Figura 5 ilustra el resultado del análisis de tres sustratos diferentes.; VIH-1 sobre de tipo salvaje (Env peso), el VIH-1 sobre de mutante (Env mut), y el virus del dengue (DENV) prM. Cada uno de ellos se introdujo en 1 de 3 líneas de código de barras de células, ingenuos, y otros 2 que utilizan td tomate en diferentes intensidades (media y alta; Figura 5A). La tinción para la expresión superficie FLAG revela cuál de los sustratos se escindió con base en el respectivo código de barras. En el ejemplo sólo Env VIH mut conserva la etiqueta FLAG (tinción positiva siguiente), como se ve en el verde-FITC canal (Figura 5C, panel inferior derecho). El análisis del ensayo de este modo se puede realizar independientemente del código de barras original, y explotarse más para decodificar y rastrear las distintas poblaciones. Este método de multiplexación por lo tanto se basa en un canal adicional reservado para la lectura biológica de interés.

Figura 1
Figura 1:. Barcoding para la multiplexación poblaciones individuales con códigos de barras genéticamente utilizando proteínas fluorescentes distintos tales como mCherry, PPC o ambos (panel izquierdo) se puede mezclar, analiza y decodifica (panel derecho) en sus respectivos canales mediante citometría de flujo. Adaptado de Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 2:. Clasificación y amplificación de las células con códigos de barras Las células de mamífero se analizaron 48 horas después de la transducción con partículas virales que contienen ya sea td tomate o E2-carmesí (panel izquierdo). Gates, se establecen a continuación, para la clasificación para incluir las células que expresan td tomate en diferentes intensidades, con entrada / salida E2-Carmesí (panel central). Los clones de las clases fueron amplificados y re-analizados para generar una matriz de seis poblaciones distinguibles (panel derecho). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3:. Decodificación revela poblaciones enmascarados La matrizde seis poblaciones obtenidos en la Figura 2 (TD tomate y / o E2-carmesí) puede manipularse adicionalmente para expresar una proteína fluorescente adicional, como eGFP. (A) La matriz original, cuando se analiza en el canal eGFP (panel izquierdo) es negativo y las seis poblaciones son indistinguibles entre sí. Cada una de las seis poblaciones se pueden analizar de forma independiente en el canal de eGFP como se muestra en los histogramas (paneles de la derecha). (B) La misma matriz, ahora también expresar eGFP, se analizó como en A, revelando ahora su característica fluorescente verde. Adaptado de Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Retribuciones vela correcta separación Algunas de las poblaciones originalmente elegidos en base a td Tomate y / o eGFP expresión (poblaciones 7 y 8) no se pueden separar correctamente cuando se analizaron juntos (panel izquierdo), a menos compensación adecuada por esos canales se ajusta (a la derecha. panel). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. La selección de células con código de barras para una mayor adaptación a ensayo elegido (A) Selección y adaptación al ensayo de elección. Las poblaciones con códigos de barras genéticamente con td tomate en diferentes intensidades (panel superior izquierdo) fueron utilizados para aplicaciones biológicas. Cada una de las poblaciones fue diseñado más para contener un ensayo que supervisa la escisión, Pero cada uno de un sustrato diferente (panel superior derecho). (B) Representación del ensayo. Positivo mancha bandera indica falta de escote mientras mancha BANDERA negativo indica escote. (C) Análisis de la siguiente ensayo de tinción FLAG. Poblaciones mixtas son distinguibles en base a la td tomate código de barras pero indistinguibles en el canal FITC (paneles de la izquierda). Cuando se tiñen con el anticuerpo FLAG-FITC, sólo una población es positiva para FLAG. Decodificación revela, sobre la base de los códigos de barras genético, que esta población lleva el sustrato mut Env VIH (panel derecho). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Aquí dos procedimientos bien establecidos se han combinado; la ingeniería genética a través de la tecnología retroviral y la detección de proteínas fluorescentes utilizando citometría de flujo. Los códigos de barras genético basado en una proteína fluorescente para la producción de líneas celulares únicos proporciona una manera simple y robusta para aplicaciones multiplexados. La generación de células con código de barras de ingeniería genética a través de la tecnología retroviral, es un principio de un largo proceso, pero permite obtener, una vez establecida, una fuente confiable y estable de material celular. La naturaleza de esta tecnología produce consistentemente líneas celulares genéticamente diseñado con características fluorescentes estables que se convierten en su verdadera biofirma distinguibles.

Ambos tipos de células adherentes y no adherentes pueden ser un código de barras utilizando proteínas fluorescentes que son fácilmente distinguibles en base a su espectro de absorbancia / emisión física. Estos incluyen, pero no se limitan a proteínas tales como PPC, mCherry, E2 Carmesí y td tomate. Una vez genéticamente con código de barras con su proteína fluorescente distinguibles, que pueden ser combinados para producir un panel de poblaciones de células. Es importante destacar que el panel contiene poblaciones celulares con la exacta genotípica maquillaje pero diferenciadas sólo por su característica de fluorescencia. Como tal, estos paneles están perfectamente adecuados para aplicaciones multiplexados, aumenta grandemente la capacidad de alto rendimiento.

Debido a las diferentes preferencias de inserción de la partícula retroviral en el genoma huésped, junto con las diferencias en la MOI, se espera que las intensidades de fluorescencia variables del gen de la proteína fluorescente particular, transportado. El análisis de una población genéticamente modificado que porta un gen fluorescente único será así detectar una gama de perfiles de expresión que pueden definirse en base a la intensidad de fluorescencia. Este perfil de expresión diferencial puede ser explotada para crear poblaciones que son espectralmente distintas una de otra. Uno puede por lo tanto combine elección de los marcadores fluorescentes con la intensidad de fluorescencia para ajustarse al diseño experimental. Aquí, matrices de 4, 6, y 12 poblaciones, que incluyen dos paneles 6 de población de E2 carmesí y td tomate, con o sin eGFP, se muestran. En teoría, esto se puede ampliar con diferentes intensidades de eGFP, así para crear poblaciones de 3 proteínas fluorescentes diferentes; cada una con diferentes intensidades asociadas con ella. Como se dijo anteriormente, se debe tener cuidado al elegir las proteínas fluorescentes a fin de garantizar que la separación de hecho se puede lograr. Proteínas elegidas deben tener distinta absorción y espectros de emisión; Sin embargo, cuando se utilizan dos proteínas fluorescentes distinguibles espectralmente pero similares, la compensación debe aplicarse. Es importante destacar que una compensación adecuada, que permite la separación física de los espectros de emisión / absorbancia entre diferentes fluoróforos o proteínas fluorescentes, se lleva a cabo con el uso de los controles de color único apropiado paradetección mediante citometría de flujo.

Multiplexing con menos proteínas fluorescentes sino la explotación de una variedad de intensidades libera canales adicionales que pueden ser entonces más explotado para la aplicación biológica de interés. Esto puede aumentar la flexibilidad de la disposición experimental y simplificar la elección de la combinación de marcadores fluorescentes para ser utilizado. Por ejemplo, el ensayo de multiplexado se muestra en la Figura 5 se basa en la tinción de anticuerpos, en este caso acoplado a FITC. Como sólo el canal PE está ocupada por el código de barras genético, se puede utilizar anticuerpos conjugados con FITC, o por el contrario, acoplado a APC, una decisión que puede hacerse sobre la base de la instrumentación apropiada y / o la disponibilidad de anticuerpos.

Si bien los logros tecnológicos en el campo de la citometría de flujo, microscopía o metodologías combinadas son impresionantes, el cuello de botella parece ser la tecnología de células disponibles para aplicaciones biológicas y HTS. Tecnología retroviralnología, junto con el número creciente de proteínas fluorescentes se pueden combinar para responder a esta consulta. Los códigos de barras genético fluorescente facilita drásticamente multiplexación, que a su vez, satisface la creciente necesidad de ampliar las capacidades de HTS de ensayos basados ​​en células. Los códigos de barras genética conduce a un sistema robusto, rentable y manera simple de ensayos basados ​​en células con par de metodologías de alto rendimiento para aplicaciones biológicas y de detección de drogas. El poder de la realización de un lugar de tres pantallas utilizando un panel de 3 población tiene costo beneficioso y consecuencias relacionadas con el tiempo. Con la creciente versatilidad en la citometría de flujo, de imágenes de alto contenido y microscopía acoplado a la citometría de flujo, los códigos de barras genético fluorescente será una herramienta consistentemente fiable para el desarrollo del ensayo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer al Dr. Garry Nolan de la Universidad de Stanford para proporcionar la línea celular de empaquetamiento Phoenix GP para la producción de partículas retrovirales. Agradecemos al Dr. Roger Tsien de la Universidad de California en San Diego para proporcionar td tomate. También nos gustaría dar las gracias al Fondo para San Diego de la Universidad Estatal de Citometría de Flujo por su servicio y ayuda.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 ml syringes BD 309604 used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter Pall Corporation 4219 used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Corning 45000-304 cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine) poly sciences 23966-2 2 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated) Eppendorf 5805 000.017 used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline) Corning 21-040-CV used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide) Sigma-Aldrich 107689 Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAria BD Biosciences instrument used for sorting cell populations
FACSCanto BD Biosciences instrument used for cell analysis
Phoenix-GP Gift from Gary Nolan cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum Mediatech MT35015CV used for cell growth and sorting
SupT1 cells ATCC CRL-1942 Human T lymphoblasts
HEK 293T cells ATCC CRL-11268 Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640 Corning 10-040-CV cell growth media for SupT1 cells

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El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados
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Smurthwaite, C. A., Williams, W., Fetsko, A., Abbadessa, D., Stolp, Z. D., Reed, C. W., Dharmawan, A., Wolkowicz, R. Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications. J. Vis. Exp. (98), e52452, doi:10.3791/52452 (2015).More

Smurthwaite, C. A., Williams, W., Fetsko, A., Abbadessa, D., Stolp, Z. D., Reed, C. W., Dharmawan, A., Wolkowicz, R. Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications. J. Vis. Exp. (98), e52452, doi:10.3791/52452 (2015).

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