Protocol
Nota: Les procédures utilisant le poisson zèbre ont été approuvés par Institutional Animal Care UCSF et l'utilisation Comité.
1. Préparation des outils
- Insérer la goupille de point caractéristique dans un porte-broche et serrer la goupille.
- Utilisation pince fine pointe de, pliez la pointe de la broche pour créer un léger crochet.
- Pour la manipulation et à la stabilisation de l'embryon au cours de blessure, pliez la fin d'une aiguille de ½ pouce 28 jauge montée sur une seringue à insuline en utilisant une pince à bec effilé.
2. Préparation des embryons de poissons zèbres pour blessures
- Mettre en place couples reproducteurs de poisson zèbre et de ramasser les œufs dans l'eau d'œuf (60ug / mL sels d'aquarium) comme indiqué précédemment 22.
- Ajouter 0,003% de N-phénylthiourée (PTU) à l'eau d'œuf lorsque les embryons sont environ après la fécondation de 8 heures (HPF) pour empêcher mélanisation.
- Dechorionate deux fertilisation poste de jour (DPF) embryons avant l'expérience à l'aide de pince fine de pointe.
- Anesthésier les embryons avec 0,02% tamponné acide 3-aminobenzoïque (tricaïne) environ 10 min avant de manipulations.
3. navire mécanique blessures d'embryons
- Transfert d'embryons anesthésiés à une diapositive de la dépression sur un stéréomicroscope à dissection en utilisant une pipette de transfert.
- En utilisant le côté plat court de l'aiguille de la seringue pour manipuler l'embryon avec la main dominante, placer l'embryon sur le côté avec la face ventrale tournée à l'opposé de l'aiguille.
- Positionner la goupille de minutie avec la pointe dirigée directement contre la surface ventrale de la partie postérieure de poisson à l'ouverture de urogénital. Placez la tige de minutie à un léger angle tel que l'extrémité incurvée est capable de percer le périderme directement dans la veine caudale (Figure 1 </ Strong>).
- Utilisation de l'aiguille de la seringue pour manipuler l'embryon, percer la veine caudale avec la broche de point caractéristique en appuyant sur l'embryon dans l'axe pour raccorder la broche légèrement dans la veine.
- Utilisation de l'aiguille de la seringue, l'embryon tirer loin de l'axe de minutie pour créer une petite déchirure dans le récipient.
NOTE: Une blessure réussie entraîner des saignements immédiate de la veine.
4. Analyse de l'hémostase
- Choisissez seuls les embryons avec circulation visiblement cellules sanguines pour cette procédure.
- Préparer la minuterie pour commencer dès que la broche de point caractéristique est extrait de la cuve.
- Lancer la minuterie dès que la perte de sang peut être visualisé à partir de la plaie. Lorsque la perte de sang de la plaie cesse, arrêter le chronomètre et le temps total que Temps de saignement. Si la coagulation est inhibée, enregistrer le temps au moment où il n'y a plus visiblement les cellules sanguines circulantes.
5. Analyse de la cicatrisation
- Transfert post-blessures animaux dans des plats d'imagerie à fond de verre pour la microscopie.
- Retirer la majorité de l'eau de l'oeuf.
- Couvrir les embryons dans 0,3 à 1,2% bas point de fusion agarose dissous dans l'eau d'œuf, chauffé entre 42 et 45 ° C et additionné de 0,02% tricaïne.
- embryons de position sur leurs côtés à l'aide de pinces.
- Après l'agarose refroidit, remplir la cuve avec 0,02% de tricaïne dans l'eau d'œuf.
- Acquérir des images à l'aide de clair, épifluorescence ou microscopie confocale.
- Retirer embryon à partir de l'agarose en utilisant une pince et transfert retour à l'eau d'œuf.
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Representative Results
Lésion vasculaire mécanique a été effectuée sur deux dpf embryons (Figure 2A - C). Résultats de blessures dans une réponse rapide et fiable la coagulation telle que mesurée par le temps à la cessation du saignement (figure 2D). Pour déterminer si les différences dans la réponse de coagulation peuvent être mesurés, l'hirudine anticoagulant a été administré à des embryons par injection dans le canal de Cuvier immédiatement avant la blessure (10.5 nl de 1 unité par ml hirudine dissous dans l'eau) (pour démonstration des injections dans le canal de Cuvier, voir précédent article JoVE 23) 24. L'administration de l'hirudine avant l'accident a entraîné une augmentation significative les temps par rapport à la maîtrise du véhicule (Figure 2D) saignements.
Preuve de lésions des vaisseaux et la coagulation peut être vu immédiatement après la lésion en utilisant des lignées transgéniques destinées endothéliale (kdrl: EGFP) et de globules rouges (gata1a: dsRED 25,26. Les images ont été acquises successivement toutes les 5 minutes pour une période de 12 heures en utilisant épifluorescence. Représentant des images fixes sont présentés dans les différentes étapes de la réparation des plaies (figure 3). En utilisant une combinaison de contraste interférentiel différentiel (DIC) et la microscopie de fluorescence, il est possible de mesurer des paramètres distincts de la cicatrisation des plaies. Afin de déterminer si oui ou non la cicatrisation des plaies suite à un motif reproductible à travers les expériences, le temps d'rétabli le flux sanguin a été mesuré dans quatre groupes de poissons. lésion vasculaire a entraîné une réponse stéréotypée fiable de 253 ± 16 min pour le rétablissement du flux sanguin à travers le vaisseau blessé (n = 4-5 poissons par expérience, moyenne ± SEM).
Figure 1: Schéma de 2 dpf embryon montrant le placement de la broche de minutie pour perf ormer blessures mécaniques de la veine caudale (CV). compartiment vasculaire est en grisé.
Figure 2: temps de saignement peuvent être mesurés visuellement après une lésion mécanique Stills de la vidéo en temps réel de lésion vasculaire poisson zèbre le 2 dpf embryons.. Les images sont affichées au moment de la blessure (A), lors de la perte de sang provenant de la plaie actif (B), et après l'arrêt de la perte de sang (C). Toutes les heures indiquées sont en seconde. Les embryons sont orientées latéralement par antérieur à la surface supérieure et la face ventrale vers la gauche. Barre d'échelle de 100 um. L'administration de l'hirudine anticoagulant conduit à une augmentation significative du temps de saignement par rapport à la maîtrise du véhicule (D) (p <0,0001, test t de Student).pg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Visualiser une lésion mécanique et la réparation en utilisant des marqueurs transgéniques Stills du Timelapse DIC et microscopie à fluorescence après une blessure du navire en utilisant des marqueurs de l'endothélium vasculaire (kdrl: egfp) et les globules rouges (gata1a: dsRED) dans 2 dpf embryons. Les images montrent un écart dans les vaisseaux et l'accumulation locale de sang rouge des cellules (t = 25), de la réparation partielle avec rétabli le flux sanguin (t = 210), et la restauration apparemment complète de la structure du navire normal (t = 615). Le temps est indiqué en minutes. Les embryons sont orientées latéralement par antérieur à la surface supérieure et la face ventrale vers la gauche. * Indique la position de l'aorte dorsale. La blessure (tête de flèche) perturbé la veine caudale et une partie du plexus caudale. Échellebar 25 um.
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Discussion
Le poisson zèbre ont été utilisés avec succès en tant que modèle pour les différents types de plaies, y compris les blessures laser 13 à 15, la thrombose induite par laser 16, 10 et épithéliale blessant. Nous rapportons une méthode de blessure mécanique qui est simple à exécuter et produit une blessure contrôlée dans un modèle in vivo qui est prête très bien à la microscopie en temps réel. Résultats de blessures dans une réponse hémostatique rapide et mesurable et un programme de réparation des plaies reproductible qui peut être contrôlée en utilisant la microscopie vidéo et timelapse.
Leur anatomie simple et stéréotypé vasculaire, ce qui permet blessure reproductible à un site défini et accessible au microscope, et la présence de plus vasculaire et types de cellules hématopoïétiques embryons de poisson zèbre rendent particulièrement utiles pour l'étude des réponses à une lésion. Cependant, les embryons de poisson zèbre ne ont pas lymphocytes fonctionnels pendant les premières semaines du développement 5,6, rendant ce système plus apappro- pour étudier la contribution de l'immunité innée dans l'inflammation et la réparation. Actuellement, une grande variété de poisson-zèbre transgénique existe avec des marqueurs pour les cellules et les protéines qui participent à la formation de thrombus, la coagulation, l'inflammation et la cicatrisation des plaies, y compris les lignes qui marquent les thrombocytes, le fibrinogène, les érythrocytes, les leucocytes et l'endothélium vasculaire 17,21,25- 31. Ces et d'autres outils devraient permettre de suivre les processus impliqués dans l'hémostase et la réparation en détail significatif.
Lésion mécanique complète blessures laser pour l'étude de l'hémostase chez le poisson zèbre. Alors que les blessures induite par laser a été utilisé pendant des années pour déclencher la formation de thrombus dans les embryons de poisson zèbre et de modèles de souris, les mécanismes par lesquels les blessures laser déclenche la coagulation et l'activation plaquettaire / de plaquettes ne sont pas entièrement connus 16,32. Lésion mécanique fournit une méthode physiologiquement pertinente pour induire la coagulation en violation vasculaire et, sans doute,-facteur tissulaire dépendant de l'initiation de la cascade de coagulation. Le fait que le traitement hirudine augmenté de manière significative les temps de saignement après une blessure suggère que ce modèle est la thrombine-dépendants. Blessure mécanique complète en outre blessure au laser en fournissant une perturbation suffisante d'un vaisseau sanguin pour fournir une possibilité de suivre la réparation de la cuve. Des études antérieures ont utilisé avec succès par des blessures mécaniques scalpel incision et ponction à l'aiguille pour montrer les différences dans le temps de saignement dans des conditions de manipulation pharmacologique et génétique 19,33. La blessure de broche de minutie utilisé dans le modèle actuel peut compléter d'autres modèles de blessures en fournissant une blessure plus reproductible en raison de la petite et défini la taille de la plaie qu'elle produit et en fournissant une occasion de mieux étudier recanalisation et réparation de navires.
Épithéliale blessant dans le poisson-zèbre se est avéré être un modèle puissant pour étudier l'inflammation et la cicatrisation des plaies 10. La capacité deintroduire une lésion vasculaire fournit l'occasion d'évaluer la réparation de plus de plaies complexes dans des contextes où la fibrine fournit une matrice provisoire, thrombus et les débris sont effacés, et les navires se régénérer. Comme ces processus participent à la réparation de tissus normaux et dans l'inflammation aiguë et chronique et pathologie vasculaire, cette méthode devrait contribuer à modéliser les aspects de la maladie humaine dans un système où les comportements cellulaires peuvent être surveillés en temps réel dans un modèle animal entier.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
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