Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Anvendelse af et High-throughput Published: December 1, 2014 doi: 10.3791/52467
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Epidemiology, School of Public Health, The University of Michigan, 2Centre for Oral Health Research, School of Dental Sciences, Newcastle University

Summary

Målet med denne metoder papir er at beskrive anvendelsen af ​​et mikrofluidsystem for udviklingen af ​​multi-arter biofilm, der indeholder arter, typisk identificeret i human supragingival plak. Metoder til at beskrive biofilm arkitektur, biofilm levedygtighed, og en tilgang til høst biofilm for kultur-afhængige eller kultur-uafhængige analyser fremhævet.

Abstract

Der er få high-throughput in vitro systemer, som fremmer udviklingen af flere arter biofilm, der indeholder mange arter almindeligvis påvises inden in vivo orale biofilm. Endvidere et system, der anvender naturligt humant spyt som næringskilde, i stedet for kunstige medier, er særligt ønskeligt for at støtte ekspressionen af cellulære og biofilm-specifikke egenskaber, der efterligner in vivo samfund. Vi beskriver en metode til udvikling af flere arter orale biofilm, som er sammenlignelige med hensyn til artssammensætning, at supragingival plak, under betingelser svarende til det menneskelige mundhulen. Konkret vil dette metoder artikel beskriver, hvordan et kommercielt tilgængeligt mikrofluidsystem kan tilpasses for at fremme udviklingen af ​​flere arter orale biofilm stammer fra og dyrkes i samlet spyt. Endvidere kan en beskrivelse af, hvordan systemet anvendes i forbindelse med en confocal laser scanning mikroskop for at generere 3D-biofilm rekonstruktioner til arkitektoniske og levedygtighed analyser vil blive præsenteret. I betragtning af den brede mangfoldighed af mikroorganismer, der vokser inden biofilm i mikrofluidsystem (herunder Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella og Porphyromonas), vil en protokol også blive præsenteret som beskriver, hvordan man høste biofilm celler til yderligere subkultur eller DNA-ekstraktion og analyse. Grænserne for både microfluidic biofilm, og de nuværende state-of-the-art data analyser vil blive behandlet. I sidste ende, er det forudset, at denne artikel vil give en baseline teknik, der vil forbedre studiet af orale biofilm og støtte i udviklingen af ​​yderligere teknologier, der kan integreres med den mikrofluid platform.

Introduction

Biofilm er arkitektonisk komplekse samfund af bakterier, som sammendrages på overflader 1. Disse samfund indeholder typisk mange arter, der interagerer med hinanden i biofilmen 2. Mundtlige biofilm, de mest visuelt iøjnefaldende er plak, er et vedvarende problem i mennesker og deres ukontrollerede udviklingsresultater i frembringelsen af taksonomisk forskellige multi-arter samfund 3. Komponenten bakterier af disse forskelligartede samfund kan være op til 1.000 gange mere modstandsdygtige over for antibiotika end deres frit svævende (planktoniske) modstykker 4-6. Manglende behandling af disse orale biofilm samfund, som kan forårsage caries og paradentose, har resulteret i en betydelig offentlig sundhed byrde: over 500 millioner besøg hos tandlægen kontor om året i USA, og en ca. 108 milliarder dollar til at behandle eller forebygge periodontal sygdom og caries 7.

indhold ">" Mens mange mikrobiologer fortaler studerer mikrobiel opførsel under naturlige forhold, nogle af dem gør det. Det skyldes, at deres moral for at overvinde de vanskeligheder, konstant undergravet af den attraktive nem at arbejde med laboratorie kulturer. "-Smith 8.

På nuværende tidspunkt er oral biofilm forskning hjælp af en række in vivo og in vitro metoder, hver med deres egne fordele og ulemper 9,10. In vitro metoder bruger ofte model biofilm systemer, der er forholdsvis nem at sætte op, men kan mangle klinisk / virkelige verden relevans 10,11. In vivo metoder typisk afhængige dyremodelsystemer der kan reproducere visse aspekter af den menneskelige orale miljø, men igen lider begrænsninger på grund af forskelle i anatomi, fysiologi, mikrobiologi og immunologi mellem dyr og mennesker 12, 13.. Det skal bemærkes, at oral biofilmkan også udvikles på emaljeoverflader afholdt i en stent i munden på frivillige forsøgspersoner, men denne fremgangsmåde er i øjeblikket relativt dyrt og arbejdskrævende 14,15. I sidste ende, er nye midler eller teknologier til forbedring tandpleje testet på mennesker under kontrollerede forsøg vilkår 11 kliniske. På nuværende tidspunkt er en ofte brugt modus operandi for at identificere og evaluere nye tandpleje midler er først at udføre laboratorieundersøgelser for at skelne den potentielle effekt, og derefter udføre dyreforsøg og "markforsøg", der beskæftiger klinikere at vurdere succes teknologi 9, 16,17. Desværre laboratorieundersøgelser har tendens til at stole på modelsystemer, der optager en stor fodaftryk, er teknologisk udfordrende at bruge, og indeholder ofte forenklede samfund af ét eller højst nogle få arter at udlede potentielle virkelige verden betyder 10,18. Eftersom tandplak biofilm indeholde flere arter og form rundex strømmende spyt miljø, udvikling biofilm, der indeholder en eller nogle få arter i kunstig medier er usandsynligt at generere samfund, der opfører sig på en måde svarende til dem i den virkelige verden scenario 10,19. For at løse den tid, omkostninger, uddannelseskrav, og de ​​fattige repræsentative karakter af laboratoriemodel biofilm systemer i forhold til den virkelige verden miljø, vi for nylig udviklet en høj kapacitet og miljømæssigt germane biofilm 20, (figur 1). Systemet fordele ved brugen af ​​cellefrit puljet humant spyt (CFS) som medium og ubehandlet puljet human bakteriel celle-holdige spyt (CCS) som inokulum. Unikt, at systemet også kombinerer mikrofluid teknologi, et konfokalt laser scanning mikroskop, og kultur-uafhængige bakteriel mangfoldighed analyse teknologi. Således modelsystemet er miljømæssigt germane (ved hjælp af spyt som et inokulum til at vokse flere arter biofilm på 37 ° C i filtersteriliseret flyderspyt) og de ​​mundtlige biofilm indeholder arter (herunder Streptococcus, Neisseria, Veillonella og Porphyromonas arter) i mængderne repræsentative for dem, der findes i begyndelsen supragingival plaque 20.

Når man overvejer at dette arbejde beskriver brugen af ​​det nyudviklede model-system, skal man være særlig opmærksom på sammenlægningen af ​​en konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) mikrofluidik, og mangfoldighed analyseteknologier kultur-uafhængig. Foreningen af ​​disse teknologier, som vores forskningsgruppe var tilsigtet og ikke kun tilføjer en high-throughput evne til det nyudviklede model-system, men giver også mulighed spørgsmål at blive spurgt, der ikke kunne være let løses før med andre systemer. Første CLSM har tydelige fordele frem for traditionelle mikroskopi da det giver mulighed for den tredimensionelle analyse af biofilm. Ofte glemmes, det er yderst vigtigt, da biofilm er heterogene with hensyn til artssammensætning og rumlig position samt de fysiologiske forhold pålægges forskellige geografiske steder i biofilmen 6,21. I samråd med tredimensionel gengivelse software og billedanalyse software, biofilmen arkitektur, rumlige forhold mellem komponent arter, og omfanget af antimikrobiel drab kan analyseres 22-24. Sådanne evner er ikke muligt ved hjælp af standard lystransmission eller epifluorescens mikroskopi. Dernæst har mikrofluidik fået særlig opmærksomhed med hensyn til mikrobiologi, da den gør det muligt at studere biofilm under omhyggeligt kontrollerede betingelser (flow, temperatur, pH, etc.) og kræver kun små mængder af væske 25-27. Som et punkt i sammenligning, vokser en mundtlig biofilm i humant spyt i en flow-celle modelsystem (et system, der er velsagtens betragtes som den bærende model for mange orale biofilm undersøgelser) i 20 timer ved en lignende gennemstrømningshastighed og forskydning som der opnåsi en mikrofluidsystem kræver mindst 200 ml, i modsætning til 800 pi i mikrofluid anordning 28-31. Således er en mikrofluid model biofilm system muliggør studiet af kvantitet begrænset materiale under definerede betingelser. Endelig er pyrosekventering teknologi blevet optimeret i de sidste ti år til at kræve kun små mængder af materiale til at foretage et fællesskab analyse og er tilstrækkelig alsidig at styre dybden af ​​sekventering at få identiteten af ​​selv sjældne biofilm arter. Brugen af denne teknologi, såsom bakteriel tag-kodet FLX amplikon pyrosekventering (bTEFAP), har gjort det muligt for relevante spørgsmål vedrørende økologi biofilm, der skal behandles 32,33. Sådanne spørgsmål gennemsyret vanskeligheder i fortiden, når pyrosekventering var ikke tilgængelig på grund af den tid og de ​​omkostninger, der er nødvendige for at skabe plasmid biblioteker og de ​​komplekse teknologiske og analytiske trin, der kræves for at udlede data 33,34. Selvfølgelig en stor fordel med kultur-uafhængig aptilgange, såsom pyrosekventering, er, at de bakterielle arter, der ikke kan dyrkes i isolation i konventionelle laboratorium medier (dvs. levedygtige, men ikke-dyrkbare arter) kan dyrkes og identificeres inden for modellen, og deres relative overflod i samfundet kvantificeret 35, 36 . Hvis du vil tilføje perspektiv, så tidligt som 1963 anslået afdøde Sigmund Socransky at ca. 50% af bakterierne i materiale isoleret fra det menneskelige orale gingival sprække ikke kunne dyrkes under anvendelse vækst laboratorieforhold 37.

Formålet med denne metoder papir er at beskrive den tilgang til at udvikle orale flere arter biofilm i en mikrofluid (Bioflux) systemet kommercielt tilgængelige under: (i) betingelserne repræsentative for den menneskelige mundhule og (ii) med en artssammensætning og tæthed, som er sammenlignelig med supragingival plak. Desuden ved hjælp af både freeware og kommerciel software, fremhæve vi hvordan grundlæggende biofilmarkitektur foranstaltninger kan udledes CLSM data, med fokus på metoder til at kvantificere biofilm biomasse, ruhed, og levedygtighed (baseret på live / Dead farvning). Endelig er de nødvendige skridt til at høste biofilm materiale for mangfoldighed analyse af bTEFAP beskrevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den spyt indsamlingen protokollen beskrevet heri blev gennemgået af University of Michigan Institutional Review Board for menneske Research.
BEMÆRK: Med hensyn til de institutionelle anmeldelser for menneske arbejde af denne type, bør forudgående ordninger og tilladelser vundet fra værtsinstitutionen. Især afhængig af institutionen, kan IRB eller etik godkendelse skal søges og godkendes, før spyt samling fra frivillige kan fortsætte. Som en hjælp til at udarbejde en ansøgning, kan en nyttig NIH algoritme / diagram findes her: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. Fremstilling af Pooled Spyt til brug som en miljømæssigt germane Growth Medium

  1. Rekrutter> 5 personer til spyt donation. Tag ikke nogen identificerbare oplysninger, sikre, at ingen indivals vil donere spyt, hvis de er syge, eller har taget orale antibiotika i de sidste 3 måneder eller har spist mad eller væske, med undtagelse af vand, i den foregående 2 timer før donation.
  2. Saml spyt i 50 ml plastrør. Pool de indsamlede spyt i et plastbæger, holde det på is. Brug ikke glas som polymerer i spyt vil overholde de interne glasoverflader.
  3. Tilføj dithiothreitol (DTT) til en slutkoncentration på 2,5 mM fra en 100x lager. (Stock er frosset i engangsmaterialer portioner ved -20 ° C). Omrør i 10 minutter i et plastbæger på is.
  4. For at fjerne partikler, centrifugeres den poolede spyt i 30 minutter ved 17.500 x g.
  5. Fortynd spyt med 3 volumener dH2O at give en fjerdedel koncentreret spyt.
  6. Filter-sterilisere spyt hjælp 0,22 um polyethersulfon (PES), lav proteinbinding filter. Brug filter med stor overflade, eller brug flere små område filtre. Hold spyt i enplastbeholder på is, mens filtrering.
  7. Frys poolede spyt ved -80   ° C i 50 ml plastrør indtil nødvendig for at vokse bakterier. Hver plastrør er for en brug og bør ikke indeholde mere end 35 ml som hver mikrofluid godt besidder højst 1,2 ml (1,2 ml x 24 brønde = 28,8 ml), og der er behov for plads i hvert rør som spyt ekspanderer under frysning.
  8. Til anvendelse, optø den poolede spyt ved stuetemperatur. Når optøet, filter-sterilisere en gang mere (0,22 um polyethersulfon, lav proteinbinding filter for at fjerne eventuelle bundfald).

2. Fremstilling af Pooled Spyt til brug som et inokulum

  1. Rekrutter> 5 personer til spyt donation. Tag ikke nogen identificerbare oplysninger, sikre, at ingen personer vil donere spyt, hvis de er syge, har taget orale antibiotika i de sidste 3 måneder eller har spist mad eller væske, med undtagelse af vand, i den foregående 2 timer før donation. Saml samples over 30 min.
  2. Saml spyt i 50 ml plastrør ved stuetemperatur og samler opsamlet spyt i et plastbæger ved stuetemperatur.
  3. Fortynd pooled spyt med autoklaveret generelle reagenskvalitet glycerol til opnåelse af en bestand med en endelig forhold på 25% glycerol, 75% celleholdige spyt [CCS].
  4. Frys spyt ved -80 ° C i 3 ml engangsprodukter portioner indtil de skal bruges.
  5. Når det er nødvendigt at pode mikrofluidsystem alikvoter optøet ved stuetemperatur og omrøres forsigtigt på en vortexer i 5 sek, før den pipetteret i mikrofluidsystem som beskrevet i trin 3 af protokollen nedenfor.

3. Vækst af Oral flere arter biofilm

  1. CFS forbehandling
    1. Første coate Bioflux mikrofluidkanaler med CFS. Tilsæt 100 pi CFS til hver stikkontakt godt. Brug af Bioflux kontrol software, skal du vælge "manuel" og sæt strøm fra kanaler "B1-B24" that skal anvendes.
    2. Dernæst indstilles forskydning til 1,0 dyn / cm og begynde flow for 2 minutter ved stuetemperatur for at sikre homogen fordeling af CFS hele kanalen. Sørg væske i hver fyldningskanalen at kontrollere, at CFS strømmede gennem alle kanaler jævnt.
    3. Inkuber plade ved stuetemperatur i 20 min.
    4. Fjern CFS / forbehandle løsning, der forbliver i udløbet brønde og overføre til indløbet brønde. Denne totalt volumen på 100 pi vil tjene til at afbalancere mod trykket påføres på inokulum fra udløbet godt.
  2. Podning
    1. Til hver stikkontakt godt, tilsættes 100 pi CCS inokulum. Placer microfluidic plade på varme plade (temperatur er indstillet til 37 ° C), skal du vælge manual i kontrol software, og sæt strøm fra stikkontakten brønde til indløbet brønde (dvs. omvendt) ved 1,0 dyn / cm for præcis 6 sek.
    2. Inkubér mikrofluid plade ved 37 ° C i 40 minutter for at tilladefor indledende vedhæftning og vækst af bakterier i podestoffet.
  3. Vækst natten
    1. Af den anvendte inokulerede kanaler, aspireres affaldet inokulum fra hver af outlet brønde. Tilføj op til 1 ml totalvolumen af ​​CFS i hver af indløbs- brønde (kan gøres på toppen af ​​eksisterende CFS).
    2. Inkubér microfluidic plade ved 37 ° C, skal du vælge manuel og indstille programmet til at køre ved 0,2 dyn / cm i 20 timer.
  4. Stain forvask
    1. Aspirér al væske fra tilgangs- og afgangsåbninger brønde tilsættes 100 pi PBS (pH 7,4) til hver af indløbs- brønde. Flow i 20 minutter ved 0,2 dyn / cm.
  5. Stain blanding tilføjelse
    1. For levedygtighed cellefarvning lave 100 pi pletten blanding for hver kanal, der skal farves. Specifikt tilsættes 3 pi SYTO 9 og 3 pi propidiumiodid pr ml PBS ved hjælp af kommercielle levedygtighed cellefarvning kit såsom LIVE / DEAD. Dette skaberen farvning blanding indeholdende 10 uM SYTO 9 og 60 uM propidiumiodid.
    2. Aspirer de resterende PBS fra indløbet brøndene og derefter tilsættes 100 pi af cellelevedygtigheden pletten blandingen til hvert indløb godt. Indstil til at strømme på 0,2 dyn / cm2 og køre opløsningen fra indløb til udløb i 45 minutter ved stuetemperatur.
  6. Post-farvning vask
    1. Aspirer den resterende plet i hver af indløbs- brønde tilsættes 100 pi PBS til hvert indløb godt. Indstil til at strømme på 0,2 dyn / cm og køre PBS-opløsning fra indløb til udløb i 20 minutter ved stuetemperatur for at fjerne overskydende farve.

4. Billede Collection, 3D-gengivelse, og billedanalyse

  1. Brug en inverteret konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) at indsamle biofilm billeddata fra mikrofluidsystem. Sørg for, at CLSM kan modstå vægten af ​​Bioflux plade, som kan nå 150 g.
    BEMÆRK: På grund af dimensions af mikrofluide kanaler, der er behov for følsomhed at skelne biofilm struktur, og kravene til påvisning af fluorescens signal af varierende intensitet, så det passer til CLSM med en 40X 1,25 NA objektiv eller en med tilsvarende optisk kvalitet, forstørrelse, og numeriske åbning.
  2. Standardisere capture emission porte med gain og offset målinger holdes konstant. Sørg for, at laser effekt ikke overstiger 25%, da dette kan resultere i foto-blegning.
  3. Konverter CLSM filer fra L EICA jeg mage F ile type (LIF) til OME (O pen M icroscopy E nvironment) filtype. Dette giver mulighed for lettere adgang og kompatibilitet mellem softwareprogrammer. Brug kommercielt tilgængeligt software såsom, Imaris at konvertere filer til denne type.

3D rendering af billeder / figurer

  1. Når konverteret til OME format, skal du bruge kommercielt tilgængeligt software såsom Imaris at gøre billedernei 3D. Udfør denne ved hjælp af en kombination af "Easy3D" og "overgå" indstillinger.
    BEMÆRK: Opmærksomhed på baggrund signal og tærskling bør gøres. Histogramfunktionen i Imaris kan bruges til at opnå indsamlingen rækkevidde og dette bør holdes konstant mellem billeder, der analyseres.
  2. Gem billeder ved hjælp af "snapshot" -funktionen til og gør omhyggeligt hensyn til billedopløsning, før du gemmer filtyper.
  3. Saml billeder i tallene ved hjælp billedredigeringsprogram såsom CorelDraw eller Adobe Illustrator.

3D billedanalyse for Grafer og tabeller

  1. Brug frit tilgængelige ImageJ 23 og COMSTAT / COMSTAT2 38 for billedanalyse. Hent pakkerne fra http://rsb.info.nih.gov/ij/ og http://comstat.dk/ hhv. Har den seneste Java opdatering installeret.
    BEMÆRK: software platform JAVA skal være installeret prior for anvendelse af billedanalyse-software.
    1. Brug ImageJ software med COMSTAT2 plugin til at importere OME-filer for hver biofilm billede i "hyperstack" mode og visning med "split kanaler".
    2. Individuelt analysere de to kanaler (rød / propidium-iodid / døde væsen kanal 0, grøn / SYTO-9 / LIVE være kanal 1) ved hjælp af "histogram" funktion ImageJ. Denne funktion angiver det samlede antal pixels i 8-bit OME filer (vist som "tæller") ved hver farve intensitet fra 0 til 255 (vist som "værdi"), hvor 0 er pixels uden signal (baggrund) og 255 er pixels med komplet signal mætning.
    3. Eksportere data i et regneark og standardisere alle signalværdier ved at vægte hver pixel med den tilsvarende signalintensitet. Dette udføres ved at multiplicere det samlede optælling ved en given signalintensitet af den numeriske 8-bit værdi (0-255), i signalintensitet.
    4. Adderer alle vægtede værdier, 0-255, for begge kanaler for hver biofilm, der optages. Tag summen af ​​de vægtede værdier for begge kanaler for at bestemme procent total signal fra enten kanal. Gør dette til at bestemme det relative forhold eller procent rød og procent grønt signal (dvs. procent "døde" og procent "LIVE" for hver behandling).
    5. Udfør statistiske analyser, for eksempel ved anvendelse af to-tailed T-test modificeret til ulige varians. Værdier på p <0,05 betragtes som signifikant og disse værdier af p <0,01 betragtes som yderst signifikant.

5. Høst Biofilm Celler til Kultur-uafhængig analyse

  1. Fjern alt brugt og ubrugt spyt fra ind- og udløb brønde. Vask brøndene med 1 ml sterilt destilleret vand tre gange.
  2. Tilsæt 100 pi sterilt, destilleret vand til indløbet brøndene og ved hjælp af software kontrol interface, passerersterilt destilleret vand frem gennem kanalerne på> 8,0 dyn / cm 2 (flow rate> 745 ul / time, forskydning på 800 sek -1) i mindst 5 min. Gentag i den modsatte retning i mindst 5 minutter og derefter gentage fremad og revers vasketrin proces.
  3. Check af lys eller ved epifluorescensmikroskopi (hvis celler blev farvet / mærket) til grundig biofilmfjernelse (figur 2). Saml 100 pi celle-suspension og opbevares ved -80 ° C i kultur-uafhængig analyse. Kan der opnås en omkostningseffektiv analyse af fællesskab sammensætning ved at bruge bakteriel tag-kodet FLX amplikon pyrosekventering (bTEFAP) ved anvendelse af fremgangsmåden i Nance et al. 20

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3d rendering af biofilm

Repræsentative resultater er vist i figur 3. Et nyttigt værktøj i Imaris software er mulighed for at undersøge hver skive af det indsamlede biofilm stakken og til at kombinere dem for at skabe tredimensionale rekonstruktioner. Desuden kan der tilsættes kunstige shadowing effekter for at hjælpe visuelt fortolke tredimensionale strukturer. De ydede biofilm kan være orienteret i alle retninger med forskellige forstørrelser at udforske biofilm eller mikro-koloni struktur. Billederne vist i fig. 3 viser resultatet af behandlingen af en oral flere arter biofilm. Af særlig note er, at behandling med 70% ethanol i signifikant farveændring i det meste af biofilm (fra grøn til rød), hvilket tyder på en betydelig celledød eller celle-skade. De store mikro-kolonier viste sig at indeholde mere døde celler end de underliggende (og nu eksponerede) mikro-kolonidannende celler. Such resultat er tænkes skyldes de-adhæsion af biofilm celler, fordi ethanol er et membran-aktive antimikrobielle. Ved omdannelse af filer til OME format og analysere de ydede stakke i ImageJ, kan det ses ved anvendelse histogramfunktioner at mængden af ​​røde og grønne signal er omvendt proportional mellem de ubehandlede biofilm og der blev behandlet med ethanol.

Kvantificering af Biofilm Properties

Tabel 1 viser gennemsnit og standardafvigelser af de vigtigste strukturelle parametre. En vigtig fordel ved at bruge Imaris, ImageJ og COMSTAT, er, at hvis Imaris bruges først, kan OME filer genereres at tillade filer, der skal pipeline gennem ImageJ og COMSTAT. De eksempler på data i tabel 1 viser, at behandling af de mundtlige biofilm med 70% ethanol resulterede i en meget markant fald i rentabilitet fra 80,8% til 28,3%. Ethanol kan forårsage nogle celleskader og strukturel cNDRINGER i biofilm, men dette er ofte gange ikke målbart væsentligt anderledes. Her blev påvist nogen forskel af gennemsnitlig biovolumen, gennemsnitlig tykkelse og gennemsnitlig ruhed (tabel 1).

Figur 1
Figur 1. Bioflux mikrofluidsystem oral biofilm system. (A) Et diagram, der viser et lodret tværsnit af Bioflux systemet, mens er monteret på en omvendt SPE CLSM. (B) En kommenteret (sorte linjer) fotografi fremhæve to mikrofluide kanaler og indløbs- og outlet brønde. (C) Et eksempel på en afsmeltet todimensional bor / Dead farvede oral biofilm, der er blevet behandlet med en 0,01% CPC opløsning resulterer i heterogene drab, delvis på grund af reaktion diffusionsbegrænsning. Grøn farve angiver levende celler, farvesmed syto 9; røde farvede celler er døde eller beskadiget og farvet med propidiumiodid. Fig 1A og 1B fra Nance et al. 20 med tilladelse. Bar i fig. 1C repræsenterer 30 um.

Figur 2
Figur 2. Anvendelse af konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) til at generere todimensionale og tredimensionale visninger af afsmeltet 20 timer biofilm. Disse biofilm blev udviklet i pooled cellefrit spyt (CFS) fra et inokulum på pooled celleholdige spyt (CCS). En ubehandlet biofilm samfund (venstre kolonne af billeder) sammenlignes med en 70% ethanol behandlet biofilm samfund og en repræsentant biofilm er vist i forskellige planer for visning (XY, XZ, og ZYZ). Histogrammer, der viser forskellene i rød (døde / beskadigede celler) og grøn (levende celler) are vist for hvert billede stabel (logget data vist i sort og ikke-logget data vist i gråt). Alle data er afledt fra 8 bit billeder og dermed på en skala fra 0-255 (256 trin). Scale søjler repræsenterer 30 um.

Figur 3
Figur 3. Flowdiagram der viser resultatet af udtræk / høst af 20 timer oral flere arter biofilm (udviklet fra et CCS inokulum i strømmende CFS) fra Bioflux mikrofluid enheden ved hjælp af forhøjede forskydning / flow teknik. Stiplede linjer er blevet anvendt på de billeder, der hjælpe med at afgøre placeringen af ​​kanalvæggene. Den fælles sammensætning af den høstede biofilm kan analyseres ved 454 pyrosekventering teknologier såsom bakteriel tag-kodet FLX amplicon pyrosekventering (bTEFAP) og udtrykt på flere taksonomiske niveauer (phylum gennem arter) afhængigt requirements. Vist er et eksempel på EF-sammensætning, på phylum plan af biofilm høstet fra tre mikrofluidkanaler. Søjler repræsenterer skala i mikrometer.

Parameter / Behandling Ubehandlet 70% EtOH
Gennemsnitlig Levedygtighed (%) 80,8 (0,9) 28,3 (5,8) **
Gennemsnit biovolumen (um 3 / um 2) 17,7 (8,4) 16,1 (3,0)
Gennemsnitlig tykkelse (um 2) 23,3 (11,3) 15,6 (6,4)
Gennemsnitlig ruhed 0,4 (0,3) 0.50 (0,2)

Tabel 1. Kvantificering af biofilm egenskaber ubehandlet og 70% ethanol behandlet 20 timer biofilm udviklet i poolede cellefri spyt (CFS) fra et inokulum celleholdige spyt (CCS). Fed værdier er gennemsnittene og ikke-fed værdier i parentes er standardafvigelser. Data fra i-det mindste fem billeder fra tre mikrofluidkanaler. Væsentlige forskelle i forhold til den ubehandlede kontrol er fremhævet med en asterisk (** P <0,01%).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne metoder fremhæves de grundlæggende trin, der kræves for at opsætte og køre et mikrofluidsystem på en sådan måde at give mulighed for udvikling af orale flere arter biofilm afledt fra puljet human spyt og dyrket i filtersteriliseret 25% poolet humant spyt. Approaches at karakterisere biofilm er givet, men det bør erindres, at disse beskrevne fremgangsmåder er modificerbare og yderligere teknologier, såsom for eksempel kan indføres pletter eller etiketter. Som et spørgsmål eksempel kunne man forestille anvende mærkede antistoffer eller indføre et fluorescerende stamme til at visualisere og undersøge den rumlige position af visse arter i oral flere arter biofilm. Desuden, afhængig af model af mikrofluidsystem, der anvendes, er det muligt at udvikle biofilm under anaerobe betingelser (i tilfælde af Bioflux systemet en teknisk note findes på Fluxion.com om dette emne).

Et centralt aspekt til Bioflux mikrofluidIC-systemet er dets kompatibilitet med flere teknologier, og dette er fremhævet her ved evnen til at udføre kultur uafhængig mangfoldighed analyser (figur 3). Mens de indre overflader af mikrofluidsystem er ikke let tilgængelige, kraftig fremadgående og tilbagegående flow gør det muligt væsentlig biofilm biomasse, der skal fjernes. Mens alle biofilmen ikke let kan fjernes, og dette kan betragtes som en svaghed i systemet, er det relevant at bemærke, at mange model biofilm systemer har også et lignende spørgsmål, og kravene fra sådanne indsamlede data skal hærdet med denne viden . For eksempel er det muligt, at den overflod af streptokokker kan være højere i biofilmen, end der faktisk bestemt eksperimentelt, fordi mange Streptococcus-arter har exceptionelt gode evner til at binde til spyt overflader 39.

Som med alle model biofilm systemer, man skal være opmærksom på de spørgsmål bliver stillet. Feller eksempel ville dette system ikke være egnet for langsigtede langsgående studier. En model, såsom en konstant dybde film reaktor, en Sorbarod system eller et drop reaktor kan være mere passende 40-42. Selv om problemet med begrænsede mængder af spyt for et modelsystem bliver et problem, da disse ikke er microfluidic-baseret design. På en tilsvarende lys dog kunne Bioflux her beskrevne system også tilpasses til undersøgelser af biofilm i andre miljøer, hvor biologiske væsker er kun tilgængelige i små mængder. For eksempel kan dette omfatte urin og sårekssudat.

Afslutningsvis som en in vitro model system skal man være bekendt med de styrker og svagheder ved den mikrofluidsystem for væksten af orale biofilm. Mens mikrofluidsystem er nok miljømæssigt germane og giver mulighed for udvikling af biofilm, der sammensætningsmæssigt ligner in vivo-situationen, er det ikke the samme som in vivo-situationen og vil sandsynligvis aldrig være så. Et laboratorium model system er kun så god som dens antagelser og mens mikrofluidsystem har mange overlap med inden for det menneskelige mundhulen faktorer som host-baserede effekter og ekstern biotiske og abiotiske udfordringer (f.eks ved at drikke og spise) ikke kan være let replikeret. Det er dog klart, at den høje throughput naturen samt miljø- og mikrobiologiske overlapper det virkelige verden oral situationen gør dette til en dragende mikrofluidsystem for at gøre forudsigelser før de indleder logistisk udfordrende kliniske studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne takker William Nance (University of Michigan) om hjælp til at formulere de protokoller biofilm vækst og John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) for rådgivning om teknologiske spørgsmål i forbindelse med Bioflux systemet. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 til AHR) og University of Michigan startfonde til AHR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible) Thermoscientific Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor  Thermoscientific 28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water Thermo  Scientific Inc 23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. VWR 73520-986 
Glycerol Thermo Fisher Scientific Inc NC0542269
BioFlux microfluidic system Fluxion Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate Fluxion 910-0004
PBS (Gibco) Thermo Fisher Scientific Inc 10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)  Invitrogen L7012
Confocal Laser Scanning Microscope Lecia SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope Multiple choices Multiple choices
Pyrosequencing facilities Multiple choices Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution Fisher Scientific 04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80 °C Multiple choices Multiple choices
Tips (20, 200, and 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Software
Bioflux dedicated software Bioflux
Imaris Bitplane
Leica SPE Leica
ImageJ Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2 Freeware (http://www.comstat.dk/)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
  2. Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
  3. Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
  4. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  5. Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
  6. Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
  7. Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag (2011).
  8. Smith, H. Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).
  9. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
  10. McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
  11. Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
  12. Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
  13. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101 (2010).
  14. Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
  15. Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
  16. Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
  17. Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
  18. Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
  19. Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
  20. Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
  21. Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
  22. Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
  23. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  24. Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
  25. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
  26. Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
  27. Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
  28. Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
  29. Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
  30. Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
  31. Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
  32. Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
  33. Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).
  34. Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
  35. Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
  36. Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
  37. Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
  38. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  39. Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
  40. Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
  41. Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
  42. Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).

Tags

Bioengineering Dental plak biofilm konfokal laserscanning mikroskopi tredimensionelle struktur pyrosekventering billedanalyse image genopbygning spyt modellering COMSTAT Imaris ImageJ flere arter biofilm fællesskaber.
Anvendelse af et High-throughput<em&gt; In vitro</em&gt; Mikrofluidsystem at udvikle Oral Multi-arter biofilm
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S.,… More

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter