Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات

Published: January 19, 2015 doi: 10.3791/52474
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2The RNA Institute, SUNY Albany

Abstract

RNA أو DNA مطوية في للطي ثلاثي الأبعاد مستقر أهدافا مثيرة للاهتمام في تطوير انتيتومور أو الأدوية المضادة للفيروسات. في حالة HIV-1، والبروتينات الفيروسية المشاركة في تنظيم نشاط الفيروس تعترف عدة الأحماض النووية. البروتين قفيصة منواة NCp7 (NC) هو بروتين أساسي ينظم عدة عمليات خلال تكاثر الفيروس. NC هو في الواقع كوصي زعزعة استقرار الهياكل الثانوية من الحمض النووي الريبي والحمض النووي وتسهيل الصلب الخاصة بهم. وتثبيط NC هو نهج جديد وهدفا للاهتمام للعلاج لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. ucleocapsid على N A nnealing- M ediated E lectrophoresis تم تطوير (NAME) فحص لتحديد الجزيئات قادرة على منع ذوبان والصلب من الحمض النووي الريبي DNA ومطوية في التشكل ثلاثي الأبعاد مستقرة الديناميكا الحرارية، مثل الهياكل دبوس الشعر من القطران وعناصر cTAR من فيروس نقص المناعة البشرية، من خلال البروتين قفيصة منواة من HIV-1. فحص جديد يستخدم إما إعادةcombinant أو البروتين المركب، و[أليغنوكليوتيد دون الحاجة لوضع العلامات السابقة. ويتحقق تحليل النتائج وفقا لمعيار الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (PAGE) تليها التقليدي تلطيخ الحمض النووي. يصف بروتوكول ورد في هذا العمل كيفية إجراء الفحص الاسم مع بروتين كامل طول أو إصدار اقتطاع لها تفتقر المجال N-المحطة الأساسية، سواء المختصة كما الأحماض النووية المحرمين، وكيفية تقييم تثبيط NC النشاط كوصي من قبل خيوط intercalator. وعلاوة على ذلك، الاسم يمكن أن يؤديها في وضعين مختلفة، من المفيد الحصول على مؤشرات حول آلية المفترضة عمل مثبطات NC التي تم تحديدها.

Introduction

البروتين قفيصة منواة NCp7 (NC) من فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (HIV-1) هو والبروتين الأساسي الصغير الذي يرتبط بشكل وثيق مع RNA الجيني في الفيروسات المعدية ناضجة، ولعب دورا محوريا في تكاثر الفيروس بمثابة العامل المساعد خلال النسخ العكسي والاعتراف الجينوم، والتعبئة والتغليف. 1-3 NC بمثابة كوصي الحمض النووي تحفيز زعزعة استقرار الهياكل الحمض النووي والصلب من تسلسل التكميلية. نشاطها الحمض النووي تجميع يقيم في المقام الأول في الأحماض الأمينية 11 نطاق N-المحطة في حين تم تعيين النشاط زعزعة استقرار دوبلكس للهياكل إصبع الزنك لها (12-55 الببتيد). 4 البروتين موجبة الشحنة يقلل من الحاجز الكهربائي من رد فعل الصلب و يزيد من المعدل الذي اثنين من سلاسل تكميلية منفصلة معا.

الأحماض النووية مطوية في التشكل مستقرة وتتطلب أنشطة كوصي من NC إلى facilitatالبريد الصلب من 5 وهذا أمر مهم لا سيما في النسخ العكسي، حيث NC أمر بالغ الأهمية في نقل الأحداث حبلا: في نقل ناقص حبلا، وDNA توقف ناقص حبلا، retrotranscribed فقط، يجب أن يتم نقل وصلب لتسلسل مكمل في المنطقة R في 'نهاية 3 من الجينوم RNA القالب. 6 على الرغم من أن يفضل الديناميكا الحرارية، لا يحدث هذا التفاعل على نطاق واسع في غياب NC بسبب وجود هيكل مستقر في المنطقة استجابة تفعيل المتحولة (TAR) RNA في المناطق R، يجب أن تكون مرتبطة إلى نسخة الحمض النووي (DNA cTAR). 7 مناطق هي، في الواقع، منظم للغاية cTAR وTAR ذات صفة الجذعية حلقة التشكل. البروتين NC يبدل طبيعة هذه دبابيس الشعر، ويعزز نقل حبلا ناقص عن طريق زيادة معدل الصلب الجزيئات بين التكميلية جدائل الحمض النووي. وقد تم التحقيق آلية NC الصلب من تقرير التقييم الثالث وcTAR بدقة وديمكتوب كما فحص TAR الصلب في العديد من الأوراق البحثية ويصور الخطة المقترحة في الاستعراضات ممتازة. 8-11 التلخيص، NC يزعزع استقرار هيكل الثانوي من الحمض النووي الريبي مستقر مثل TAR-RNA، يزعزع استقرار هيكل الثانوي للتسلسل التكميلي، cTAR-الحمض النووي ، ويعزز رد الفعل الصلب من RNA / DNA مما يؤدي إلى TAR / cTAR تشكيل مضاعف متغاير. 10،11 ونتيجة لذلك، يفضل الخطوة حبلا نقل أثناء النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية. 12

NC غير هدفا جذابا لتطوير العوامل المضادة للفيروسات جديد منذ ان التداخل المحتمل الناجم عن جزيئات صغيرة نحو NC يؤدي إلى الحد من النسخ العكسي من الجينوم الفيروسي نتيجة لنشاط NC خطر. 2،13 يمكن هذا النهج تؤدي في النهاية إلى تطوير عوامل نجاح مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. في سياق عملية غربلة لNC مثبطات 14 ضعنا مقايسة الاعتماد على الخصائص المعروفةمن قفيصة منواة لزعزعة استقرار بكفاءة ويصلب [أليغنوكليوتيد التكميلية. نحن 10،11 يطلق عليه ucleocapsid N A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) فحص. يستخدم اسما وفحص NC للتوسط في الصلب بين نسخ منظم ثابت من الأحماض النووية التكميلية، في حالتنا من قليل النوكليوتيد الموافق الجزء القمي من سلسلة TAR-RNA مع تسلسل الحمض النووي لها التكميلي (cTAR) لانتاج الهجين TAR / cTAR مضاعف متغاير . ويمكن التحقيق في تحليل تقرير التقييم الثالث / cTAR الصلب رد الفعل في وجود NC التي كتبها الأصلي الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (PAGE).

ويظهر هذا البروتوكول كيفية إجراء الفحص الاسم ليصلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة [أليغنوكليوتيد مطوية في الهياكل منعطف حاد مستقرة، وكيفية تحليل نتائج تفاعل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكنا من التجربة. لا يطلب وضع العلامات المشع للحامض النووي، وdetectiعلى العصابات قليل النوكليوتيد يمكن أن يقوم بها وسائل تلطيخ التقليدية. الفحص، التي توظف إما المؤتلف بروتين كامل طول أو نسخة تركيبية اقتطاع من NC، يسمح بتحديد intercalators خيوط تثبيط NC، وهو نشاط تبين أن ترتبط مع ملزمة قوية لRNA والحمض النووي (14).

Protocol

1. إعداد المواد والأحماض النووية والبروتينات

  1. الأحماض النووية
    1. الأوتوكلاف 1.5 مل الأنابيب وتخزينها في حاوية معقمة. أداء كل خطوة باستخدام نصائح فلتر عقيمة للقضاء على عوامل تلويث أي nucleases من المواد الاستهلاكية المختبر.
    2. إعداد تريس، حمض الهيدروكلوريك 10 ملي العازلة الرقم الهيدروجيني 7.5 في المياه المعالجة DEPC وتصفية الحل مع حجم مرشح 0.22 ميكرون المسام.
    3. ملاحظة: يسمى "القطران" قليل النوكليوتيد يتوافق مع تسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة (29 مير) 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 "15 بينما cTAR هو في تسلسل الحمض النووي مكملة 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3".
      1. ذوبان كلا TAR وcTAR في المنطقة العازلة تريس المذكورة أعلاه (1.1.2.) لجعل 100 ميكرومتر الحلول الأسهم. متجر cTAR حل السهم عند -20 درجة مئوية (مأخوذة يمكن تخزينها لعدة أشهر في هذه الظروف). للتخزين على المدى الطويل من الحمض النووي الريبي، وجعل 20 مكل من تقرير التقييم الثالثحل سهم، تجف كل قسامة باستخدام فراغ المكثف الطرد المركزي وتخزينها في -80 ° C. الطازجة قبل استخدامها، و resuspend كل قسامة TAR في 20 ميكرولتر المياه المعالجة DEPC.
        ملاحظة: مأخوذة TAR العمل يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أسبوعين.
  2. البروتين NC و (12-55) NC الببتيد
    1. تحضير كامل طول المؤتلف البروتين NC كما ذكرت. 16 مخزن الحل الأسهم في aliquots في -20 ° C. تحديد تركيز البروتين المحدد مع الطيف للأشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام معامل الانقراض في 280 نيوتن متر من 6410 M -1 سم -1.
    2. Resuspend والاصطناعية (12-55) NC الببتيد في تريس، حمض الهيدروكلوريك 10 ملم 7.5 درجة الحموضة وتخزين حل الأسهم في aliquots في -20 ° C. تحديد تركيز الببتيد الصحيح على مقياس الطيف الضوئي UV-فيس باستخدام معامل الانقراض في 280 نانومتر من 5،700 M -1 سم -1.
      ملاحظة: تم الحصول على (12-55) NC الببتيد HPLC تنقيته وlyophilized من محلول يحتوي على اثنين من مكافئات من كلوريد الزنك.
  3. مجمع 1
    1. تزن حوالي 1 ملغم من مركب مجفف بالتجميد 1 باستخدام الميزان التحليلي وحله في 100 ميكرولتر من 100٪ DMSO، وزنه في الوقت المناسب، للحصول على تركيز عال (≈10 ملي) حل الأسهم. تحديد تركيز مركب المحدد على الأشعة فوق البنفسجية فيس مقياس الطيف الضوئي باستخدام معامل الانقراض (في 354 نانومتر: 11387 M -1 سم -1). تخزين محلول المخزون في الظلام في -20 ° C قبل استخدامها.

2. إعداد جل من أجهزة وصب جل

  1. لإعداد هلام، وشطف اثنين من لوحات (أحدهما طويل والآخر أقصر) مع 70٪ من الإيثانول، والسماح لهم الجافة، ومن ثم وضع اثنين من 1 ملم الفواصل على طول حواف طويلة من لوحة أطول. تغطية ذلك مع لوحة قصيرة، وللتأكد من محاذاة الصفيحتين في الأسفل.
  2. للادلاء الجل، اتبع الإرشادات التي تقدمها الملحقالكذاب (مختلف الموردين استخدام جهاز مختلف قليلا؛ وتقدم المشابك ساندويتش وأكوام من قبل كل جهاز الصب). في جميع الحالات، تأكد أن المشابك، مداخن وحشيات نظيفة، وإزالة آثار مادة الأكريلاميد من قبل المستخدمين السابق غادر.
  3. ضع شطيرة هلام تجميعها في موقف الصب واتبع تعليمات محددة من قبل المورد.
    ملاحظة: عادة طوقا سيليكون نظيفة في الجزء السفلي من فتحة الصب يضمن ختم جيدة ويساعد على تجنب التسريبات عندما صب جل.
  4. للتحقق من وجود تسرب، صب الماء المقطر باستخدام الماصة بين لوحات زجاجية. إضافة الماء لملء ساندويتش والانتظار لبعض دقائق للتأكد من عدم حدوث تسرب. إذا تم تجميعها شطيرة بشكل صحيح، وإزالة المياه وإدراج ورقة فلتر بين النظارات اثنين من لتجف النظارات. إزالة ورقة والآن شطيرة جاهز للهلام الصب.
  5. صب جل في درجة حرارة الغرفة (RT، 25 ° C). منذ بولي أكريلاميد هو أعصاب للغاية، وارتداء القفازات. لناالبريد مستمرة 12٪ والمواد الهلامية بولي أكريلاميد في عدم تغيير طبيعة الظروف، (الأم) لأداء اسم الفحص.
    1. إعداد الحل هلام 12٪: مزيج 12 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد / bisacrylamide (19/1) حل، 4 مل TBE 10X عازلة (10X: تريس، حمض الهيدروكلوريك 890 ملم، 890 ملم البورات، EDTA 20 مم) و 24 مل MilliQ المياه . إضافة 400 APS ميكرولتر و 50 ميكرولتر TEMED فورا قبل الاستخدام. مزيج الحل واستخدام بسرعة الماصة لمن أجل حل أسفل بين لوحات زجاجية. إدخال المشط بين لوحات الزجاج، وتجنب الفقاعات. إضافة الحل هلام لملء شطيرة تماما.
  6. السماح للهلام تتبلمر لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة. مباشرة قبل عينة التحميل وإزالة مشط ببطء وشطف الآبار جيدا بالماء المقطر.
  7. بعد البلمرة والآبار الشطف الخطوات، اتبع تعليمات محددة من قبل المورد لوضع شطيرة هلام في الجهاز لالعمودي الكهربائي للهلام. إذا كان نظام التبريد الحالي، للتأكد من وضع نظام هلام في مجلس النوابموقف مصحح من جوهر التبريد.
  8. إذا تم تصميم نظام للتعامل مع هلام أكثر من واحد، ولكن هلام واحد فقط لابد من تشغيل، ونعلق ساندويتش هلام كما سد عازلة لجوهر التبريد على الجانب الآخر لتشكيل غرفة عازلة العليا كاملة.
    ملاحظة: إذا لم يتم وضع السد بشكل صحيح، سوف المخزن المؤقت العلوي يتسرب ربما وقف على المدى هلام.
  9. إعداد 2.5 L من TBE العازلة تشغيل (1X: تريس، حمض الهيدروكلوريك 89 مم، 89 مم البورات، EDTA 2 مم) في الماء منزوع الأيونات. الى جانب مجموعة حوالي 500 مل من العازلة TBE للغرفة عازلة العليا وتصب الباقي في غرفة عازلة أقل. صب المتبقية 500 مل TBE عازلة في غرفة عازلة العليا.
  10. وضع غطاء على الجزء العلوي من غرفة عازلة أقل، بحيث الأنود والكاثود هي في الموقف المناسب.
  11. ربط الأساسية التبريد، وإذا كان موجودا، إلى صنبور الماء باستخدام خراطيم المياه. ملء الأساسية مع ماء الصنبور، والتي سوف تكون بمثابة بالوعة الحرارة خلال الكهربائي، والسماح للمياه الصنبور يعمم من خلال الأساسية خلال المنتخبrophoresis.

3. قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص

  1. إعداد المخازن المؤقتة
    1. إعداد TNMg عازلة (1X: تريس، حمض الهيدروكلوريك 10 ملم، كلوريد الصوديوم 20 ملم، والمغنيسيوم (CLO 4) 2 1 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) في المياه DEPC المعاملة وتصفية الحل مع حجم مرشح 0.22 ميكرون المسام.
      ملاحظة: يمكن تخزين عازلة TNMg في 4 درجات مئوية تصل إلى 7 أيام. للحصول على أفضل النتائج للطي والصلب، ونحن نوصي استخدام مخازن تقدم طازجة.
    2. إعداد العازلة جل تحميل تحتوي على SDS (SDS GLB: تريس، حمض الهيدروكلوريك 100 ملم، EDTA 4 مم، 50٪ ث / ت الجلسرين، 2٪ ث / ت SDS، 0.05٪ ث / ت برموفينول الأزرق) في المياه DEPC المعاملة.
      ملاحظة: GLB يساعد على تتبع مدى تقوم بتشغيل عينات [أليغنوكليوتيد في النظام جل ويسمح لإغراق العينات في هلام. إضافة SDS إلى GLB هي خطوة حاسمة لنجاح الأمثل للاسم الفحص. إذا لم يتبع هذه الخطوة، فمن غير الممكن التمييز النووية الأحماض الفرقة في شركة جنرال الكتريكنظام ل (الشكل 2).
  2. يتحكم إعداد
    1. تمييع متسلسل [أليغنوكليوتيد حلول الأسهم واستخدام تقدم طازجة 10 ميكرومتر حلول لإعداد 10 ميكرولتر من محلول 1 ميكرومتر من القطران. إعداد بنفس الطريقة، كل على حدة، و 10 ميكرولتر من 1 ميكرومتر cTAR في TNMg 1X العازلة. تسخين كل أنبوب إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تترك لتبرد لRT من أجل TAR وcTAR أن نفترض الهياكل الجذعية انتفاخ حلقة بهم.
    2. إعداد 1 ميكرومتر حل TAR الهجين / cTAR عن السيطرة. مزيج 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر TAR مع 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر cTAR في TNMg 1X، في الحجم الإجمالي من 10 ميكرولتر. تفسد أليغنوكليوتيد] عن طريق تسخين أنبوب إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتترك لتبرد ببطء إلى RT من أجل TAR ليصلب لتسلسل متمم لها cTAR وتشكل المزدوج تقطعت بهم السبل الهجين TAR / cTAR.
    3. عندما يتم تبريد الحلول لRT، إجراء الطرد المركزي تدور القصير. إضافة 3 ميكرولتر من GLB SDS، ماصة EACح الحل داخل الأنبوب 3 مرات ووضع أنبوب على الجليد. الحفاظ على عينات مراقبة ثابتة على الجليد حتى الخطوة التحميل.
  3. إعداد عينات لتحليل البروتين NC و (12-55) NC النشاط الببتيد
    1. استخدام 2.5 ميكرولتر من تقدم طازجة 4 ميكرومتر حل قليل النوكليوتيد لكل عينة. إعداد دائما المبلغ الزائد القليل من كل حل لمنع الأخطاء pipetting ل. أضعاف 32.5 ميكرولتر من 4 ميكرومتر حل TAR، وحدة، من cTAR في TNMg 1X عازلة كما ذكرت لإعداد الضوابط المذكورة أعلاه (الخطوة 3.2.1).
    2. تمييع الحل الأسهم في كل من البروتين NC و (12-55) NC الببتيد إلى 80 ميكرومتر حل مع الماء MilliQ.
    3. عندما يتم تبريد TAR وcTAR حلول لRT، إجراء الطرد المركزي تدور القصير لكل من الأنابيب وبدء التحضير للأنابيب العينات.
    4. إعداد 12 الفارغة 0.5 مل تعقيمها الأنابيب. ضع 3 صفوف من 4 أنابيب في رف لعينات المختبر. كل صف يشير التوالي عينات لتحليل عشرالبريد كامل طول البروتين NC، العينات دون البروتين وعينات لتحليل (12-55) NC النشاط الببتيد.
    5. محل دائما نصائح في أي وقت يتم استخدام كاشف مختلف.
    6. إضافة في كل أنبوب 2.5 ميكرولتر من TAR مطوية و 2.5 ميكرولتر من مطوية cTAR. إضافة 4 ميكرولتر المعالجة DEPC المياه إلى عينات لتحليل NC و(12-55) NC. إضافة 5 ميكرولتر المعالجة DEPC المياه إلى عينات أخرى.
    7. إضافة 1 ميكرولتر من 80 ميكرومتر NC أو 1 ميكرولتر من 80 ميكرومتر (12-55) NC إلى عينات ل، على التوالي، NC أو (12-55) تحليل NC.
    8. إضافة على الفور 3 ميكرولتر من GLB SDS إلى الوقت 0 دقيقة عينات (كما ذكرت 0 'في الشكل 1)، pipetting لحل داخل كل أنبوب 3 مرات، وأخيرا وضع أنبوب على الجليد. كرر هذه الخطوة لجميع العينات والضوابط. الحفاظ على عينات ثابتة على الجليد حتى الخطوة التحميل.
    9. بعد 15 دقيقة، 30 دقيقة و 1 ساعة من الحضانة في RT، إضافة 3 ميكرولتر من GLB SDS، ماصة الحل داخل EACح أنبوب 3 مرات ووضع أنبوب على الجليد. كرر هذه الخطوة لجميع العينات والضوابط، على التوالي، والحفاظ على الجليد حتى الخطوة التحميل.
    10. إزالة الغطاء لجهاز هلام. تحميل 13 ميكرولتر من كل عينة في آبار شكلت كما سبق وصفه من قبل الصب الجل مع مشط تشكيل جيدا. تحميل نماذج التالية النظام التي أعلن عنها في الشكل 1.
    11. استبدال غطاء لجهاز هلام. إرفاق يؤدي لجهاز الجل على امدادات الطاقة. تأكد من أن أقطاب موصولة في فتحات الصحيحة في امدادات الطاقة.
    12. بدوره على السلطة وتشغيل هلام لمدة 2 ساعة و 30 دقيقة في الجهد المستمر من 200 V، حتى هاجر الصبغة إلى 1.5 سم فوق الجزء السفلي من هلام.
  4. إعداد نموذج لتحليل النشاط أنثراكوينون على NC و (12-55) NC
    1. تمييع الحل الأسهم مركب 1. إعداد 10 ميكرولتر من 500 ميكرومتر، 250 ميكرومتر، 50 ميكرومتر، التخفيف 5 ميكرومتر من المجمع <قوية> 1 في الماء MilliQ.
    2. إعداد عينات السيطرة كما ذكرت آنفا (الفقرة 3.2).
    3. استخدام 2.5 ميكرولتر من تقدم طازجة 4 ميكرومتر حل قليل النوكليوتيد لكل عينة. إعداد دائما المبلغ الزائد القليل من كل حل لمنع الأخطاء pipetting ل. أضعاف 27.5 ميكرولتر من 4 ميكرومتر حل TAR، وحدة، من cTAR في TNMg 1X عازلة على النحو المذكور أعلاه (الخطوة 3.2.1).
    4. تمييع الحل الأسهم في كل من البروتين NC و (12-55) NC الببتيد إلى 80 ميكرومتر حل في الماء.
    5. عندما يتم تبريد TAR وcTAR حلول لRT، إجراء الطرد المركزي تدور القصير لكل من الأنابيب وبدء إعداد العينات.
    6. إعداد 20 الفارغة 0.5 مل تعقيمها الأنابيب. ضع 2 صفوف من 10 الأنابيب في كل من رف لعينات المختبر.
    7. محل دائما نصائح في أي وقت يتم استخدام كاشف مختلف.
    8. إضافة كل أنبوب من الصف الأول مع 2.5 ميكرولتر من TAR مطوية. إضافة كل أنبوب من الصف الثاني مع 2.5 ميكرولتر من مطوية cTAR.
      9. 1 تخفيف (زيادة تركيز من 5 ميكرومتر إلى التخفيف 500 ميكرومتر) لTAR وcTAR. استبدال مركب مع المياه في عينات لتحليل NC و (12-55) NC في غياب المجمع. احتضان هذه العينات لمدة 15 دقيقة في RT.
    9. بعد 15 دقيقة الحضانة، وخلط العينات cTAR (أنابيب من الصف الثاني) مع العينات مراسل TAR (أنابيب من الصف الأول).
    10. إضافة 1 ميكرولتر من 80 ميكرومتر NC أو 1 ميكرولتر من 80 ميكرومتر (12-55) NC إلى عينات لNC أو (12-55) تحليل NC، على التوالي.
    11. بعد 15 دقيقة الحضانة، إضافة 3 ميكرولتر من GLB SDS، ماصة كل أنبوب 3 مرات ووضع أنبوب على الجليد. كرر هذه الخطوة، على التوالي، وذلك باستخدام عينات للNC و (12-55) تحليل NC. الحفاظ على عينات ثابتة على الجليد حتى الخطوة التحميل.
    12. إزالة الغطاء لجهاز هلام. تحميل 13 ميكرولتر من كل عينة في الآبار. تحميل نماذج التالية النظام ذكرت في الشكللدى عودتهم 3B.
    13. استبدال غطاء لجهاز هلام. إرفاق يؤدي لجهاز الجل على امدادات الطاقة. تأكد من أن أقطاب موصولة في فتحات الصحيحة في امدادات الطاقة.
    14. بدوره على السلطة وتشغيل هلام لمدة 2 ساعة و 30 دقيقة في الجهد المستمر من 200 V، حتى هاجر الصبغة إلى 1.5 سم فوق الجزء السفلي من هلام.
  5. نموذج إعداد: الوضع بنسبة ضئيلة من حضن مسبق مقابل وضع NC-حضن مسبق
    1. تمييع مجمع 1 محلول المخزون. إعداد 10 ميكرولتر من 500 ميكرومتر، 250 ميكرومتر، 50 ميكرومتر، 5 ميكرومتر التخفيف من مركب 1 في الماء MilliQ.
    2. إعداد عينات السيطرة كما ذكرت آنفا (الفقرة 3.2).
    3. استخدام 2.5 ميكرولتر من 4 ميكرومتر حل قليل النوكليوتيد لكل عينة. إعداد دائما المبلغ الزائد القليل من كل حل لمنع الأخطاء pipetting ل. أضعاف 27.5 ميكرولتر من 4 ميكرومتر حل TAR، وحدة، من cTAR في TNMg 1X عازلة كما المذكورة أعلاه (الخطوة 3.2.1.).
    4. تمييع الحل الأسهم في كل من البروتين NC و (12-55) NC الببتيد إلى 80 ميكرومتر حل في الماء.
    5. عندما يتم تبريد TAR وcTAR حلول لRT، إجراء الطرد المركزي تدور القصير لكل من الأنابيب وبدء إعداد العينات.
    6. استبدال دائما النصائح يتم تغيير كل الكواشف الوقت أو إذا لمست أي سائل أو حل آخر الواردة في أنبوب رد فعل.
    7. من هذه الخطوة على التأكد من أن يعلم بشكل واضح وفصل عينات لإجراءات ما قبل الحضانة مختلفة اثنين.
      1. وضع بنسبة ضئيلة من حضن مسبق
        1. إعداد 10 الفارغة 0.5 مل تعقيمها الأنابيب. ضع 2 صفوف من 5 أنابيب في رف لعينات المختبر.
        2. إضافة في كل أنبوب لأول ميكرولتر التوالي 2.5 من TAR مطوية. إضافة في كل أنبوب من الصف الثاني 2.5 ميكرولتر من مطوية cTAR.
        3. إضافة 2 ميكرولتر من مجمع المناسب 1 تخفيف (زيادة تركيز من 5 ميكرومتر إلى التخفيف 500 ميكرومتر) لTAR وcTAR.استبدال مركب مع المياه في عينات لتحليل NC في غياب المجمع. احتضان هذه العينات لمدة 15 دقيقة في RT.
        4. بعد 15 دقيقة الحضانة، وأخذ العينات cTAR (الصف الثاني) ووضعها مع عينات مراسل TAR (الصف الأول).
        5. إضافة 1 ميكرولتر من 80 ميكرومتر NC لكل عينة واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في RT.
        6. بعد 15 دقيقة الحضانة، إضافة 3 ميكرولتر من GLB SDS، ماصة كل أنبوب 3 مرات ووضع أنبوب على الجليد. الحفاظ على عينات ثابتة على الجليد حتى الخطوة التحميل.
      2. NC-حضن مسبق وضع
        1. إعداد 5 الفارغة 0.5 مل أنابيب تعقيمها ووضعها في رف لعينات المختبر.
        2. إضافة في كل أنبوب 4 ميكرولتر من المناسب مركب 1 التخفيف (زيادة تركيز من 5 ميكرومتر إلى التخفيف 500 ميكرومتر). استبدال مركب مع المياه في عينات لتحليل NC في غياب المجمع.
        3. إضافة في كل أنبوب 1 ميكرولتر من 80 μ، M NC واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في RT.
        4. مزيج 15 ميكرولتر من TAR مطوية مع 15 ميكرولتر من مطوية cTAR في أنبوب واستخدام هذا الحل TAR + cTAR في الخطوة التالية.
        5. بعد 15 دقيقة الحضانة، إضافة إلى كل عينة 5 ميكرولتر من الحل مزيج TAR + cTAR واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في RT.
        6. بعد 15 دقيقة الحضانة، إضافة 3 ميكرولتر من GLB SDS، ماصة كل أنبوب 3 مرات ووضع أنبوب على الجليد. الحفاظ على عينات ثابتة على الجليد حتى الخطوة التحميل.
          ملاحظة: من خطوة 3.5.8 على وتحليلها يمكن أن يؤديها مع جميع العينات (السيرة الذاتية من 3.5.7).
    8. إزالة الغطاء لجهاز هلام. تحميل 13 ميكرولتر من كل عينة في الآبار. تحميل نماذج التالية النظام التي أعلن عنها في الشكل (4).
    9. استبدال غطاء لجهاز هلام. إرفاق يؤدي لجهاز الجل على امدادات الطاقة. تأكد من أن أقطاب موصولة في فتحات الصحيحة في ملحق السلطةذ.
    10. بدوره على السلطة وتشغيل هلام لمدة 2 ساعة و 30 دقيقة في الجهد المستمر من 200 V، حتى هاجر الصبغة إلى 1.5 سم فوق الجزء السفلي من هلام.

4. إزالة تلطيخ جل وجل

  1. بعد الكهربائي، وإيقاف إمدادات الطاقة، وقطع الخيوط الكهربائية. إيقاف صنبور الماء من نظام التبريد وقطع خراطيم المياه من جوهر.
  2. إزالة الغطاء، وإذا تم تبريد النظام، وإزالة النواة التبريد وتصب قبالة العازلة من كلا المجلسين.
  3. تفكيك بلطف ساندويتش هلام من الجهاز وإزالة جميع المشابك من لوحات الزجاج. لإزالة جل من لوحات، ودفع أحد الفواصل إلى جانب لوحات وتطويعه بلطف لسحب ما يصل، وبعيدا عن لوحة من الزجاج العليا. فهم ركنين من هلام ورفع تشغيله برفق لإزالته من الزجاج.
  4. وضع الجل في وعاء مناسب مع الأحماض النووية حل تلطيخ المطلوب لل30-45 دقيقة مع التحريك.
  5. بعد تلطيخ، ووضع الجل على نظام التصوير نقل transilluminator للكشف عن الأحماض النووية إشارة مضان في النظام هلام.

Representative Results

ويبين الشكل 1 نتيجة تمثيلية من قفيصة منواة التليين وساطة الكهربائي (NAME) الفحص، يقوم ط) مع المؤتلف بروتين كامل طول، والثاني) من دون البروتين، أي خلط cTAR + TAR واحتضان ما يصل إلى 1 ساعة على RT، والثالث ) نفس الفحص يؤديها مع (12-55) NC، الببتيد الاصطناعية تفتقر إلى 11 الأحماض الأمينية المجال N-المحطة. وكان تقرير التقييم الثالث مطوية مسبقا وcTAR المختلط وتشكيل TAR مضاعف متغاير صلب / تم رصد cTAR بحضور كامل طول المؤتلف NC (الممرات تبقى من الشكل 1)، في حالة عدم وجود بروتين (الممرات المركزية في الشكل (1) )، وبحضور من اقتطاع (12-55) NC الببتيد (الممرات الصحيحة في الشكل 1). الضوابط هي: مطوية cTAR، مطوية TAR، وصلب هجين (TAR / cTAR)، التي تم الحصول عليها من خلال تمسخ الحراري للهياكل مطوية ثابت من تقرير التقييم الثالث للcTAR تليها annealin البطئز (14).

قدرة NC لتفسد اثنين مستقرة تسلسل الحمض النووي في الحلزون مضاعف متغاير بمد هو واضح بشكل واضح: كامل طول البروتين NC يؤدي على الفور إلى تشكيل TAR / cTAR الهجين: 0 'يشير إلى الحد الأدنى من الوقت يمر بين إضافة NC ل العينات وإضافة عازلة هلام التحميل، الذي يتوقف رد الفعل. ويتحقق تشكيل كامل بالفعل بعد 15 'فترة حضانة. الزيادة في شدة مضاعف متغاير صلب يوازي الانخفاض في شدة مطوية cTAR وTAR أليغنوكليوتيد]. ويتحقق تشكيل مضاعف متغاير أيضا في وجود شكل اقتطاع، أي (12-55) NC، مؤكدا النشاط البيولوجي من الببتيد الاصطناعية. سوف في غياب البروتين أو الببتيد لا لوحظ تشكيل مضاعف متغاير، وتقرير التقييم الثالث و[أليغنوكليوتيد cTAR لا يصلب في درجة حرارة الغرفة في مضاعف متغاير (الشكل 1). فيكل التجارب، وتشكيل سريع وسيطة غير مستقرة ("المجمعات وسيطة" في الشكل رقم 1) التي تقلل مع مرور الوقت لوحظ، على الدوام مع الآلية المقترحة الصرف حبلا من خلال دبابيس الشعر من cTAR وTAR حتى الأحماض النووية الصحيحة للطي (17).

واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكن من التجربة هو عدم وجود SDS في المخزن المؤقت جل تحميل. في غياب SDS في GLB يظهر نتيجة للتفاعل في الشكل 2 ومقارنة نتائج مع GLB + SDS. وكان تقرير التقييم الثالث مطوية مسبقا وcTAR المختلط وحضنت لمدة 3 ساعة على RT لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية مع كامل طول البروتين NC المؤتلف. بعد مرور فترة الحضانة تم تقسيم العينات في اثنين: واحد نصف هلام العازلة تحميل دون SDS (GLB) وأضافت، في حين أن النصف الآخر كان GLB مع SDS (GLB SDS). تم تحميل عينات على هلام، وتصور الموقف من الأحماض النووية العصابات بعد هلام تديرهاصبغ تلطيخ. عندما كان NC الحالي ولكن تم تحميلها العينات مع GLB، تم نقل جميع الأحماض النووية العصابات الأعلى: هذا ومن المتوقع ويشير إلى ملزمة قوية بين البروتين والأحماض النووية. وتظهر النتائج مع GLB SDS في اليمين المتطرف من هلام: إضافة SDS يبدل طبيعة البروتين والنشرات الأحماض النووية من مجمع مستقرة مع البروتين، والسماح للمقارنة مع الضوابط.

يتم استخدام فحص الاسم لتقييم قدرة خيوط intercalators لتحقيق الاستقرار في الهياكل الحمض النووي ديناميكية وتمنع NC النشاط كوصي 14 intercalators خيوط هي جزيئات العطرية مستو الاستعاضة عن السلاسل الجانبية ضخمة تقع في مواقع نقيض من نظام عصابة، مثل أنثراكوينون هو مبين في الشكل 3A. 18 هذه intercalators قادرة على خيط من خلال الحلزون المزدوج من الأحماض النووية، وتحديد مكان أخيرا سلاسل جانبهم في كل أخدود من ضعفالحلزون. 19،20

ويبين الشكل 3B نتائج الفحص الاسم في وجود مركب 1، intercalator خيوط معروف، 18 بحضور كامل طول NC أو من الببتيد اقتطاع. في كلتا الحالتين، يتم تقليل تشكيل هجين TAR / cTAR التي كتبها NC عن طريق زيادة تركيز intercalator، بينما، في الوقت نفسه، ومقدار TAR الحرة وزيادة cTAR. شكل اقتطاع من البروتين تفتقر الذيل N-محطة (12-55NC) هو أكثر حساسية لتثبيط نشاطه: تم التحقق من هذا الاختلاف مع جميع مركبات اخضعت للاختبار حتى الآن.

الفحص الاسم يمكن أن يؤديها بطريقتين، إما عن طريق ما قبل يحتضنها مجمع الاختبار مع NC، تليها إضافة [أليغنوكليوتيد مطوية (وضع NC-حضن مسبق)، أو عن طريق preincubating مجمع اختبار لمدة 15 دقيقة مع ركائز الحمض النووي مطوية ، تليها إضافة NC وحضانة أخرى لمدة 15 دقيقة (بنسبة ضئيلة من العلاقات العامةوضع eincubation). على الرغم من أن فترة حضانة العام هو نفسه في اثنين من وسائط مختلفة، وحضن مسبق مع [أليغنوكليوتيد مطوية قبل إضافة NC يسمح لمزيد من الوقت لخيوط من intercalators في الحمض النووي مطوية. وهذا يؤدي إلى استقرار أقوى من هياكلها ديناميكية وإلى تثبيط أسهل من الأنشطة كوصي NC. وبالتالي فإن تحليل الفحص الاسم في وضعي يعزز الاختلافات في آلية عمل مثبطات NC، كما هو مبين في الشكل (4): عندما تم تحليل مركب 1 حسب الاسم في وضع بنسبة ضئيلة من حضن مسبق (الشكل 4، والممرات في اليسار) فإنه يدل تثبيط قوية من الصلب NC بوساطة، في حين لوحظ أقل بكثير تثبيط في وضع NC-حضن مسبق (الشكل 4، والممرات في اليمين). يرجى ملاحظة أن لتحديد تركيزات المثبطة بينما فحص مجموعات من المركبات ذات الصلة مع هذا الاختبار وفي هذه الظروف، كل جتربةمنة يجب أن يؤديها على الأقل في ثلاث نسخ باستخدام تركيزات المتقاربة (خاصة حول قيمة IC 50) (14).

الشكل (1)
الشكل 1: اسم الفحص مع كامل طول NC ومع اقتطاع (12-55) NC TAR مطوية وcTAR، كل 1 ميكرومتر، وحضنت مع المؤتلف NC أو مع (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) ل0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة و 1 ساعة. استخدمت TAR وcTAR المحتضنة في غياب البروتين (0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة و 1 ساعة) كما المراقبة السلبية. TAR مطوية، مطوية cTAR وTAR الهجين / cTAR تم الحصول عليها بعد تمسخ الحراري تليها كانت تستخدم في المختبر الصلب والضوابط. وكان رد فعل ثم توقفت عن استخدام GLB SDS. تم حل عينات على هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator.

الشكل 2
الشكل 2: تأثير SDS العازلة في هلام تحميل (GLB) عند تحليل TAR / cTAR الصلب التي كتبها NC TAR وcTAR، prefolded في TNMg 1X، وحضنت مع كامل طول المؤتلف NC (oligos / NC = 1/8) لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو في 37 ° C. GLB أو GLB SDS ثم تم إضافتها إلى عينات المحتضنة مع NC. الضوابط: TAR، cTAR وTAR الهجين صلب / cTAR (كل 1 ميكرومتر). تم إجراء الكهربائي باستخدام هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator. تم تعديل هذا الرقم من الشكل S4 من: Sosic، A. وآخرون التصميم والتركيب والتقييم البيولوجي للTAR والمجلدات cTAR كما HIV-1 قفيصة منواة مثبطات MedChemComm 4، 1388-1393، دوى: 10.1039 / c3md00212h (2013) .

"> الشكل (3)
الشكل (3): (A) التركيبة الكيميائية للخيوط intercalator 1. (ب) تأثير خيوط intercalator 1 المقررة من قبل اسم الفحص. مطوية TAR وcTAR، كل 1 ميكرومتر، وحضنت في وجود تركيزات أشار المجمع 1 مع كامل طول NC أو مع (12-55) NC، كل 8 ميكرومتر. TAR مطوية، مطوية cTAR وTAR مضاعف متغاير الموسعة / استخدمت cTAR والضوابط. وكان رد فعل ثم توقفت عن استخدام GLB SDS. تم حل عينات على هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator.

الشكل (4)
الشكل 4: بنسبة ضئيلة من حضن مسبق مقابل سائط NC-حضن مسبق: الآثار على اسم الفحص بنسبة ضئيلة من حضن مسبق وزارة الدفاع.البريد: TAR مطوية ومطوية cTAR، كل 1 ميكرومتر، تم preincubated مع تركيزات المشار إليها من خيوط intercalator 1 لمدة 15 دقيقة، وبعد ذلك لمدة 15 دقيقة إضافية في وجود كامل طول NC (8 ميكرومتر) NC-حضن مسبق. الوضع: تركيزات المشار إليها من خيوط intercalator 1 تم preincubated مع كامل طول NC (8 ميكرومتر) لمدة 15 دقيقة، وبعد ذلك لمدة 15 دقيقة إضافية في وجود TAR مطوية ومطوية cTAR، كل 1 ميكرومتر. TAR مطوية، مطوية cTAR وTAR مضاعف متغاير الموسعة / استخدمت cTAR والضوابط. وجميع ردود الفعل توقفت أخيرا باستخدام GLB SDS. تم حل عينات على هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator.

Discussion

الاسم هو الفحص الذي يسمح لتقييم بسرعة تثبيط النشاط كوصي من البروتين قفيصة منواة من HIV-1، هدفا للاهتمام في البحث عن أدوية جديدة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. NC anneals سريع في درجة حرارة الغرفة والأحماض النووية التي لولاها لتمسخ الحراري في درجة حرارة عالية تليها الصلب الدقيق للطي مستقر. الفحص لا يمكن أن يؤديها مع أي من كامل طول NC أو مع اقتطاع (12-55) NC: في كلتا الحالتين هي صلب اثنين من الأحماض النووية (RNA ونسخة من DNA التكميلية) بسرعة. وهذا يتفق مع الملاحظة الأدب مع NC الببتيد اقتطاع: يبدأ الصلب من قبل ذوبان كفاءة تنبع من cTAR تليها تفاعل حلقة قمية المكملة له، وهو ضعيف الموقع ملزمة NC، مع تسلسل تكميلية من TAR حلقة قمية، تنتهي خلال عدة سيطة غير مستقرة إلى هجين صلب الموسعة. 21

NC هو البروتوكول الاضافي مستقرة جداعين وبعض المشاكل أثناء أداء الاسم يمكن ان تحدث. من المهم جدا ولكن لإضافة SDS تقدم طازجة في تحميل جل المستخدمة العازلة لوقف رد الفعل: إذا كان هذا لم يتحقق، فإن جل لا تظهر عصابات الحمض النووي في المواضع الصحيحة. في الواقع، NC هو حمض ملزمة البروتين النووي، بحيث لتصور بشكل صحيح TAR / cTAR مضاعف متغاير من قبل الكهربائي للهلام SDS يجب أن تكون موجودة في جل للتحميل العازلة لتفسد البروتين والافراج عنها من مجمعها ضيق مع الأحماض النووية. وهذا هو أيضا استكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكن من التجربة، أي تشكيل عصابات تحولت خلال الفترة السابقة هلام. هذا التأثير واضحا بشكل خاص عندما كان يعمل على كامل طول NC، كما في الشكل 2، ويرتبط وجود الذيل N-محطة الأساسي للغاية، وجود تأثير لتجميع قوي على الأحماض النووية.

وجود الذيل الأساسي محطة يجعل رد الفعل الصلب أكثر صعوبة أن يكون مستعمل، كما تظهرن في الشكل (3) باستخدام مركب 1، خيوط intercalator التمثيلية، أي بزيادة intercalator درجة من الكفاءة خاصة في استقرار الهياكل الجذعية حلقة من القطران وcTAR. في الواقع، يفضل هذا النوع من التفاعل مع الأحماض النووية عندما الانتفاخات والحلقات يقطع استمرارية الحلزون المزدوج، مما يسمح للخيوط أسهل من بدائل ضخمة في أزواج قاعدة. استقرار TAR وcTAR من قبل هذه المجلدات الحمض النووي تم تحليلها من قبل تحديد الزيادة في درجة حرارة انصهار من [أليغنوكليوتيد اثنين (14). وعلاوة على ذلك، فإن الزيادة في درجة حرارة انصهار يرتبط مع تثبيط الصلب يحفزه HIV-1 NC، مما أدى إلى تشكيل المخفضة للTAR مضاعف متغاير / cTAR ومما يدل على أن intercalators خيوط هي فئة مثيرة للاهتمام من لدنة لهياكل ديناميكية من RNA مثل عنصر TAR 14

آلية عمل لجأت لهذه كومبوجهاز الأمم المتحدة الإنمائي يمكن التحقق من صحة أبعد عن طريق إجراء فحص الاسم في صيغ بديلة مختلفة، كما هو مبين في الشكل (4): في حالة intercalators تتعزز تثبيط مضاعف متغاير صلب عند المحتضنة المخدرات مع اثنين من oligos مطوية. المركبات التي تعمل مع آلية مختلفة للعمل، مثل المواد اللاصقة مباشرة من البروتين NC، ستكون أقل تأثرا وضع حضن مسبق مختلف. اسم الفحص التي أجريت في طريقتين بالتالي يمكن أن تستخدم لفحص المكتبات من المركبات لتحديد مثبطات NC، وكذلك لتقييم آلية المفترضة عمل يضرب إيجابية أثناء البحث عن العقاقير المضادة للفيروس نقص المناعة البشرية تستهدف NC. ومن الواضح أن استخدام هذه التقنيات وحدها عند المطالبة بالتعويض عن آلية عمل محددة من مثبطات NC حددت ليست كافية، وهناك حاجة أخرى فحوصات الكيمياء الحيوية المناسبة للحفاظ على فرضية العمل (14).

وأخيرا، فإنه يجب التأكيد على أن الاسم يستخدم للغايةالانزيمات المنقى، إما المؤتلف أو الاصطناعية، وإعطاء المعلومات الثمينة على "في المختبر" تثبيط NC بواسطة مركبات اخضعت للاختبار. هذا هو "القوة والضعف" للمقايسة: الاسم يمكن أن تكمل أيضا فحص الظاهري ونهج النمذجة الجزيئية في الخطوات الأولية لبرامج اكتشاف الأدوية، مما يتيح لبناء بسرعة وتحليل العلاقات هيكل النشاط في نهاية المطاف إعادة توجيه التوليف والمخدرات التصميم. لكن، وكما فحوصات الكيمياء الحيوية الأخرى المستخدمة في مشاريع التنمية المخدرات في فيروس نقص المناعة البشرية، اسم لن تعطي معلومات عن آثار مثبطات المفترضة في الخلايا المصابة بالفيروسات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. Metabion International AG Store the stock  solution at -20 °C 
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.   Metabion International AG Store the stock aliquot at -80 °C 
(12-55)NC peptide EspiKem srl Store the stock solution at -20 °C
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120 086 Autoclave before use
0.5 ml tubes Eppendorf 0030 121 023 Autoclave before use
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µl Sarstedt 701,130,210
Biosphere Filter Tips 2-20 µl Sarstedt 70,760,213
Biosphere Filter Tips 200 µl Sarstedt 70,760,213
Syringe Filter 0.22 µm Biosigma srl 51,798
Ethanol Carlo Erba 414631
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich 71725-50G
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-1L
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 71376-1KG
Boric Acid Sigma-Aldrich B0252-2.5KG
Ethylenediaminetetraacetic Acid Sigma-Aldrich E5134-500G
Magnesium Perchlorate Sigma-Aldrich 222283-100G Store the 1 M solution at -20 °C
Glycerol Sigma-Aldrich 49770-1L
Bromophenol Blue GE Healthcare Life Sciences 17-1329-01
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-100ML
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A7460-500G Prepare the 10% solution freshly before use
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) Merck Millipore 1006401000 Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting
Tris ultrapure Applichem A1086,1000
DEPC-treated water Ambion AM9922
Centrifuge 5415R Eppendorf 22,621,408
NanoDrop 1000 spectrometer Thermo Scientific
UV-VIS spectrometer Lambda 20 Perkin Elmer
Protean II xi Cell Bio-Rad 165-1803
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
SybrGreen II RNA Gel Staining Lonza 50523 Make the 1/10,000 dilution in TBE 1x. Store it in the dark at 4 °C for two weeks.
Geliance 600 Imaging System Perkin Elmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Druillennec, S., et al. A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).
  2. Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus. Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).
  3. Thomas, J. A., Gorelick, R. J. Nucleocapsid protein function in early infection processes. Virus Res. 134, 39-63 (2008).
  4. Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function. RNA Biol. 7, 724-734 (2010).
  5. Zeng, Y., et al. Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).
  6. Basu, V. P., et al. Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription. Virus Res. 134, 19-38 (2008).
  7. Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA. J Virol. 71, 5178-5188 (1997).
  8. Godet, J., Mely, Y. Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein. RNA Biol. 7, 687-699 (2010).
  9. Darlix, J. L., et al. Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).
  10. Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1. Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).
  11. Vo, M. -N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).
  12. Beltz, H., et al. Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis. J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).
  13. Mori, M., et al. Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1. Curr Top Microbiol Immunol. , Forthcoming Forthcoming.
  14. Sosic, A., et al. Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors. MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).
  15. Tabarrini, O., et al. Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives. Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).
  16. Hagan, N., Fabris, D. Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element. Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).
  17. Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease. Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).
  18. Zagotto, G., et al. Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates. Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).
  19. Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution. Chem Biol. 10, 663-672 (2003).
  20. Gooch, B. D., Beal, P. A. Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides. J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).
  21. Kanevsky, I., et al. Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).

Tags

علم المناعة، العدد 95، HIV-1، والبروتين قفيصة منواة، NCp7، TAR-RNA، DNA، [أليغنوكليوتيد، الصلب، جل الكهربائي، الاسم
قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sosic, A., Cappellini, M.,… More

Sosic, A., Cappellini, M., Scalabrin, M., Gatto, B. Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors. J. Vis. Exp. (95), e52474, doi:10.3791/52474 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter