Protocol
注：すべての実験プロトコルは、フランスの動物実験や倫理委員会によって承認され、番号A-75から2065に「サービスの保護らサンテAnimales、エンバ」によって検証された。サンプルサイズは、実験の再現性を確実にするために選択され、動物の倫理規定の3Rに応じている。
マウスの作製
- 麻酔
- イメージングの短時間（1時間未満）のために、ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kgの）を含有する生理食塩水200μlを腹腔内注射してマウスを麻酔し。
- あるいは、（4時間まで）イメージングの長期間適合マスクを介して、O 2 / N 2 Oの70/30混合物で気化イソフルラン2.5％の吸入で、マウスを麻酔し。
- 注：この方法は、より安定した無意識のために提供し、薬のシリアル腹腔内注射を避けることができます。 マウスを麻酔したら、ニッパーで足パッドの刺激を通じて無意識をチェック。
- 血管染色/追加の染色
- 血管の染色：尾静脈に静脈内にローダミン - デキストランを200μl（2 MDA、生理食塩水緩衝液中10mg / ml）を注入する。
- 好中球の染色のために：尾静脈に静脈内に生理食塩水100μl中Ly6G-PE（クローン1A8）2μgのを注入する。
- 固定化
- 固定化のために、顕微鏡に及び麻酔ガス吸入器に適合したカスタムメイドの定位ホルダーを使用しています。
注：sterotacticホルダーは、動物の頭を締め、2金属板ブラケット、固定されている1と他のリムーバブルと適応性を持つ金属支持体である。 - 呼吸動きからの分離を確実にするために、保持プレート間のマウスの頭部をインストールします。 SKをストレッチする保持プレートとヘッドと耳を締めインチ安定性と動物の呼吸福祉のために確認してください。
- 固定化のために、顕微鏡に及び麻酔ガス吸入器に適合したカスタムメイドの定位ホルダーを使用しています。
- 頭皮を削除
- 慎重に眼との接触を避け、無菌のアプリケーターで頭皮の髪を濡らし、エタノール70％使用しています。
- 完全に前頭骨に頭頂骨の後方から頭皮を削除するには、滅菌ハサミやニッパーで皮膚をカットします。大規模な出血を防ぐために、目と耳から3ミリメートルまで遠ざけること。頭蓋骨（骨膜）をカバー疎性結合組織を削除します。暖かいPBSに浸したペーパータオルで残りの髪を洗ってください。
- 液浸システムのセットアップ
- 分布を制御するための小さなゲージの針を用いて頭蓋骨に直接外科的接着剤で直径18mmのゴムリングを貼り付けます。 （30μlのに十分であるべきである）の漏洩を防止するために、ゴムリングの全周を接着。
- PBSに浸したペーパータオルでリング下に最後にもう一度頭蓋骨をきれいにし、その後の完全な浸漬し、37℃のPBSを追加頭蓋骨。眼の乾燥を避けるために、マウスのそれぞれの眼にNaClの0.9％溶液または特定の眼軟膏のドロップを追加します。目的の下に定位ホルダーをドラッグします。
- 約ダイレクトトランスミッションを介し顕微鏡接眼レンズを使用してフィールドを配置します。
2.二光子イメージングの取得
- 選択的に680から1080ナノメートルまで調節可能で、NIR光の140fsパルスを提供するサファイア結晶レーザ、レーザパワー制御のための音響光学変調器：チタンと結合し、多光子顕微鏡を使用する。 2ダイクロイックミラー（565 nmおよび690 nm）で、610分の565と550分の500バンドパスフィルタの組み合わせ（3蛍光チャネルの同時録画を可能にする）3外部の非デスキャン検出器（NDD）を含む構成を使用して、プランアポクロマート485ショートパスフィルターは、水浸対物レンズ（NA = 1）×20。
- anaesの良いhomeothermyを可能にするために加熱室を設定thetizedマウス。、
注：温度が、より安定性のためにセッションを画像化する1時間前に設定されることがあります。我々のケースでは、32°Cで麻酔したマウス（36~37℃）の最適な体温を得るために選択され、4時間後まで維持される。この温度は、使用されるシステム（デジタルプローブは、この点を確認するために使用することができる）に適合させることができる。また、使用される加熱チャンバは、黒/暗い、外光の混入を避けるために、システム（目的および電動プレート）の一部を覆う。 - システムの電源を入れます
- サファイアレーザー、その後全体の顕微鏡システム：TIの電源をオンにします。取得ソフトウェアを起動します。 870 nmのレーザー波長範囲を設定する。記録のために適切なNDDを選択します。
注：この例では、第二高調波発生（SHG）19と、シアン蛍光タンパク質（ECFP）は485ショートパスフィルタの後NDDによって検出される。 550分の500バンドパスフィルタ及びローダミン - デキストランをtで検出された後ECFPもNDDによって検出される彼NDD 610分の565バンドパスフィルタの後。
- サファイアレーザー、その後全体の顕微鏡システム：TIの電源をオンにします。取得ソフトウェアを起動します。 870 nmのレーザー波長範囲を設定する。記録のために適切なNDDを選択します。
- 取得の設定を調整
- ソフトウェアの「ライブ取得」イメージングコマンドを使用し、顕微鏡、方向コントロールを使用して、ECFP及びローダミン信号の領域にフォーカスを調整します。最小限の光損傷を有する最良の信号対雑音比を得るために、最小限にレーザパワーを設定する。
注：使用される電力設定は、関心領域の深さに応じて変化する。典型的には、AOMの設定は、15ミリワットの周りの目的を超えてレーザパワーを表して約20％に設定される。各NDDは、光退色および光損傷を低減することがPMTのゲインに電力を増加させる方がよい。典型的な取得の設定は、単一の1.58マイクロ秒のピクセル滞留時間でスキャンし、1.5倍率512×512ピクセルの解像度である。
- ソフトウェアの「ライブ取得」イメージングコマンドを使用し、顕微鏡、方向コントロールを使用して、ECFP及びローダミン信号の領域にフォーカスを調整します。最小限の光損傷を有する最良の信号対雑音比を得るために、最小限にレーザパワーを設定する。
- 関心領域を選択します
- 記録パラメータが設定されると、再び「ライブ」の取得コマンドを使用リアルタイムで監視すべき所望の（x、y、z）の欄を選択するための組織を調査する。
注：通常、我々は両方の血管および実質領域を含むフィールドを選択しました。 - 「位置」ソフトウェアコマンドを使用してフィールドを登録します。
注：このコマンドは異なる遠いフィールドのx、y、z座標を記憶する。 - 同じ手順を使用して、（3まで）興味のある追加のフィールドを選択し、登録します。
- 選択した倍率で、必要量に応じて第一記憶した位置にある「zスタック」ソフトウェアコマンドを使用して、3次元zスタックを設定します。最初の深い位置し、次に最も高い位置を記憶します。深さのレーザパワーを正規化する。
注：複数の付随フィールドイメージングのために、我々は12μmの厚さのボリュームを取得するフィールドごとに3μmのZ-段階で区切られた5スライスを獲得する。これらの設定は、研究細胞の種類に適合させることがあります。
- 記録パラメータが設定されると、再び「ライブ」の取得コマンドを使用リアルタイムで監視すべき所望の（x、y、z）の欄を選択するための組織を調査する。
- 起動買収
- 選択する220と、時系列「ソフトウェアコマンドと時間間隔の持続時間とサイクル数を選択します。 「実験を開始する「ソフトウェアコマンドを選択することで、必要な時間の経過と期間に応じてタイムラプスイメージングを開始します。
注：私たちのケースでは、30分のリアルタイムを表す60サイクルの間に各30秒1のボリュームを取得する。短い時間の経過は、血管内の速い細胞ローリングを追跡するために行うことができる。この場合、薄いzスタックと2以下の異なるフィールドを同時に記録することができる。 - セットアップの定期的なモニタリング。
- 常にそれが無意識であることを確認するために動物を監視します。
注：動物のウィスカーまたは脚の振動復活の指標である。動物の呼吸がぎくしゃくしている場合には、イソフルランの量をわずかに減少させることができる。取得中の強力な組織ドリフトは、マウスの復活の指標である。 - 目的が適切に浸漬していることを確認します。 37℃のPBS betweeリニュー2件の買収（30分）をn個。
注：買収時の信号のプログレッシブ消失は、PBS漏れの指標である。
- 常にそれが無意識であることを確認するために動物を監視します。
- 選択する220と、時系列「ソフトウェアコマンドと時間間隔の持続時間とサイクル数を選択します。 「実験を開始する「ソフトウェアコマンドを選択することで、必要な時間の経過と期間に応じてタイムラプスイメージングを開始します。
- 手続きの終了
- 必要な動画が記録されると、急速に蘇生する前に頚椎脱臼により動物を安楽死させる。
NOTE：創傷治癒は、長手方向の撮像を実行するための可能性を制限24〜48時間でかさぶたの形成をもたらす。
- 必要な動画が記録されると、急速に蘇生する前に頚椎脱臼により動物を安楽死させる。
3.データ分析
- ドリフト補正
- 3D自動追尾のためのIMARISビットプレーンソフトウェアを使用してください。
- IMARIS上の3D画像シーケンスを開きます。 SELECTコマンドを「スポット」、そして均一分野で配布可能な場合は、4種類のアンカーポイントの最低すべての時点のマニュアルトラッキング（マウスクリック+シフト）を生成します。
- 「編集トラック」タブで「正しいドリフト」コマンドを使用して、ドリフト補正を適用します。
- トンの確認彼のx補正、yおよびzは、特に内の品質は人為的な揺れを回避する。
注：補正が十分でない場合は、他のアンカーポイントを試してみてくださいまたは分析からのビデオを除外する。
- 細胞追跡
- コマンド "新しいスポットを追加」と「トラックスポットの経時"アルゴリズム設定を選択してください。次のステップに進みます。
- 「ソースチャンネル」コマンドを使用して、関心の全チャネルのいずれかの自動細胞トラッキング手順を適用します。 10μmとしたオブジェクト（すなわち、細胞）の直径。次のステップに進みます。
注：選択は、オブジェクトと測定された信号の特異性の区別に依存します。要するに、全チャネル上の自動追尾が検出された信号が対象物に特異的である場合にのみ可能である。 SHG及びECFPの両方が485ショートパスフィルタの後NDDによって検出されるため、トラッキングは5後NDDによって記録ECFP信号を使用して、より特異的かつ効率的になる00/550バンドパスフィルタ。クラスタ化または高密度のパックされたオブジェクトは、3.1.2のステップに類似した個々のオブジェクトを手動で選択が必要になります。 - 「品質」フィルタの種類を選択して、非特異的オブジェクトの追跡を除外するようにしきい値を設定。次のステップに進みます。
- 2スポット間の「最大距離」と「ギャップサイズ」の正確なパラメータを指定して「ブラウンアルゴリズムモーション」を選択してください。トラックの発生を検証します。
- トラックが自動的に計算されると、「トラック継続時間」フィルタの種類を選択し、（4時間点を表す）を120秒より短いトラックを排除するためにしきい値を設定。
- 必須：自動追尾した後、トラックの品質をチェック。
- オブジェクトは、トラックパスに従うことを確認するためにタイムバーをアンロール。 「編集」タブで利用可能なトラックポイント補正のオプションを使用しない場合は、次の「削除」コマンド（任意のトラックpを削除して虚偽または不適切なトラックを削除個別に「切断」コマンド）を使用してOINT。トラックパスが不足している時点（マウスクリック+シフト）を追加し、不連続である場合には、所定のトラック上のすべての点を選択し、「編集トラック」タブでコマンドを「接続」を使用します。
- 定量パラメータ
- 「環境設定」コマンドで「統計」タブを選択し、リスト内の関心の動的パラメータを選択します。選択してコマンドおよび生成されたExcelファイルを保存」ファイルにすべての統計情報をエクスポート」。
注：いくつかの動的なパラメータを直接、トラックの長さ、瞬間速度、平均速度などのソフトウェアから得られ、真直度を追跡している。運動係数6、20を決定することができるが、ソフトウエアにより直接提供されない。 - 各セルについて、時間（ΔT）の各期間の変位の平均値を算出（30秒タイムラプス映画のために、ΔTは30、60、90秒、などとなります）。時間間隔の関数としての平均二乗変位をプロットする。曲線の直線部分の傾きを計算することによって、運動性係数を得る。
- 「環境設定」コマンドで「統計」タブを選択し、リスト内の関心の動的パラメータを選択します。選択してコマンドおよび生成されたExcelファイルを保存」ファイルにすべての統計情報をエクスポート」。
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Representative Results
マウスの頭蓋骨構造は、生体内イメージングによって骨髄生理学を勉強する良い機会を提供しています。フロント頭頂領域の周りに薄くなる骨は、それが骨の摩耗なし髄ニッチへのアクセスを得ることが可能である。1 MacBlueトランスジェニックマウスの頭蓋骨の広い2Dフィールドを表す図 。骨基質は、主にSHG 19によってIは容易に検出可能なコラーゲンで構成されている。ローダミン-デキストランの注射は、骨髄の血管網を染色し、骨基質と血管14との間に実質骨髄ニッチの同定を可能にする。 ECFP細胞は骨髄の二つの区画に分布するが、骨基質には存在しない。単球は、手動で、組織内でのそれらの位置に応じて分類される。全細胞が容器のサイズを無視し、脈管構造内にあるとき、血管の単球が定義されている。唯一の大きな収集細静脈は、当社のAから除外されているnalysis。細胞が血管系および骨基質との間に配置されたときに実質球が定義されている。
興味のある特定の領域のタイムラプスイメージング（補足ビデオ1、2）血管（ 図2A）または実質（ 図2B）、単球のどちらかのために時間をかけて個々のセル軌道の計算が可能。トラックの長さは実質単球の表示は、血管の単球に比べて変位を減少させたことを示しています。時間の経過とともに変位の解析は、両方の区画（ 図2C）における単球の平均速度を比較します。時間の関数としての平均二乗変位は、ランダムな動きの空間的広がりの尺度である。運動性係数（議論の項を参照）曲線の直線部分の勾配によって決定され、細胞移動のより良いアイデアを提供している。血管の単球の運動性係数（MC =71μm²/秒）運動coefficieよりも高い実質単球のNT（MC =4.4μm²/秒）。
取得の時間分解能は、平均細胞速度に適合させなければならない。ローリング血管単球は短い時間遅延内の重要な変位を行うことができます。より正確な細胞追跡のために、取得の時間間隔を小さくすることが好ましい。 図3は、2つの異なる時間分解能でトラッキング球の図を示す。 30秒の時間間隔は、10秒の時間間隔に比べて精度ならびに（緑色の点線内）の経路の長さを減少させる。
最後に、 図4は、単球に付随して、別の細胞サブセットを分析する可能性を示している。 Ly6Gは、成熟したマウスの好中球の特異的マーカーである。抗Ly6Gの注射は直接in vivoでのイメージングシーケンス染色好中球の前に蛍光色素（この場合Phycoは、erythrin）5分と組み合わせる。このアプローチは、追加の薄暗いを提供分析のensionと異なる細胞サブセットの挙動を比較するための可能性。このようなアプローチは、単球の区画内のサブセットを定義するために使用することができる。
頭蓋骨骨髄組織の図1広視野。MacBlueマウスから頭蓋定常骨髄のインビボ二光子レーザー走査顕微鏡画像。 （赤）血管系は、撮像セッションの前に2MDaローダミンデキストラン5分の尾無駄注入により染色される。骨は二次高調波発生（青色）によって可視化される。 ECFP +単球（シアン）は実質ニッチ（血管系と骨の間の暗い領域）内および血管内に配置されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.リアルタイム細胞追跡。代表的なトラックパス（A）中の単球の時間に沿って血管系および（B）実質。各セルのトラック（緑線）はソフトウェアによって自動的に生成されます。赤い斑点追跡セルの質量中心を表す。血管と実質球との間の（C）平均速度の比較。マン·ホイットニーの統計分析は、***血管および実質単球のために表現され、時間の関数としてのp <0.001。（D）の平均二乗変位（MSD）を表し、実行された。線形曲線は、非環境に制約でランダムウォークを示すのに対し、漸近曲線は、経時的に細胞の拘束された変位を示す。運動性係数は、セルの変位の程度を示し、およびcの傾きによって決定される線形回帰によって計算urve。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ローリング単球の研究において、図3の時間間隔の分解能代表的画像シーケンスが増加時間分解能は、ローリング細胞軌道の精度を改善することを示す。 10秒の時間間隔で（上）画像シーケンス。 30秒の時間間隔で（下）画像シーケンス。トラックパスの品質が向上し、同じまたは反対のための2つの異なるセルを考慮するリスクが低減される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
髄好中球および単球の生体内共局在で図4。この図は、蛍光色素と組み合わせて特異的なモノクローナル抗体を注入することにより、単球と同時に、インビボでの別の細胞サブセットを検出する可能性を示している。 Ly6G-PE抗体2μgの5分MacBlueマウスの頭蓋骨骨髄イメージングの前に静脈内に注入された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
実質単球の補足ビデオ1.移動行動。MacBlueマウスの頭蓋骨骨髄実質における単球の定常状態移動活性のインビボ 3D-イメージング。 ECFP +信号がシアンである。各セル（赤点）のための渡り鳥の経路は緑色で表示されます。
血管の単球の補足ビデオ2.移動行動。MacBlueマウスの頭蓋骨骨髄血管系における単球の定常状態移動活性のインビボ 3D-イメージング。 ECFP +信号がシアンである。 （2M ダ）ローダミン - デキストランは、骨髄血管（赤色）を区別するために、撮像セッションの前に注射した。各セル（赤点）のための渡り鳥の経路は緑色で表示されます。
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Discussion
インビボイメージング方法の重要な点は、画像の持続時間を最大にし、炎症細胞の動態に影響を与える可能性のある細菌汚染および炎症の危険性を最小限にするために、焦点の安定性を確保するためである。骨髄へのアクセスを得るために行わ手術が最小であるように、頭蓋骨骨髄のイメージングは、これらの目的に従う。滅菌材料および防腐剤の使用は、細胞恒常性摂動を誘発する可能性があり、感染の危険性を制限することが不可欠である。
定位ホルダーの開発は挑戦することが、各システム（顕微鏡の対物と電動ステージとの距離、麻酔用ガス吸入器の使用）のための具体的なカスタマイズを必要とするかもしれません。より広い撮像面へのアクセスのためにできるだけ水平にマウスの頭を取得することが重要である。動物が配置されると、それは数分requirすると予測される焦点面の良好な安定性を得るために、編。したがって、獲得記録を起動する前に、組織のドリフトをチェックすることをお勧めします。関心の領域の選択と一緒に、このプロセスはしばらく続くことができるので、それはまた、定期的にケタミン/キシラジンが使用された場合、動物は意識不明であることを確認するために、漏れや蒸発缶などの目的を適切に浸漬するかどうかを確認することをお勧めします起こる。
頭蓋骨上のゴムリングの良い位置合わせは、プロセス内の別の重要なステップを表します。シアノアクリレート接着剤は、安定性とシールの点で良好な結果を提供するが、一方は頭蓋骨を覆う組織の関心領域へのアクセスをブロックすることができる接着剤の過剰負荷を防止する必要がある。カバーガラスのない頭蓋骨に直接投入の利点は、骨のより深い領域へのアクセスを得ることです。頭蓋骨は、平面ではないので、また、これは詐欺に撮像領域を制限しない図1に表示されているように、広い撮像視野を可能頭蓋骨とカバーガラスの間にタクト面、。
すべてのイメージング技術については、取得速度と解像度の品質間の選択は妥協である。したがって、数および単位時間当たりの画像の品質が制限され、その選択は宛科学的問題に依存する。実質単球が遅い運動性または無茎性であるのに対し、一般的に、血管の単球が速く、細胞を展開しています。ローリング細胞の正確なトラッキングは、 図2に示すように、無茎性細胞のための高撮像レートが無用と高xは、取得の高い時間分解能が必要とy、zの解像度は、例えば、樹状突起の突出活性を分析するために好ましいことがある。高速セルは、zでの変位の長い追跡を取得するために、より厚いボリュームを必要とする。
時間の関数としての平均二乗変位は、ソフトウェアIMARISによって提供されない。プリンツィプルこの表現の任意の遭遇又は構造的収縮せず、バリスティック走行オブジェクトに対して、それが移動した距離は、時間間隔（ 図2D）に比例するであろう、という事実に基づく。このようにスロープの直線性は、非制約された環境でのランダムウォークを示している。対照的に、曲線の漸近形は、細胞集団の経時的な制約の変位を反映する。この計算の第2の利点は速度が時々質量中心の人為的変位によって過大評価されることである。これは突出活性を持つ遅い運動性細胞のために特に重要です。したがって、線形回帰によって計算曲線の傾きによって運動性係数の計算はcellover時間21の実際の変位を示す。
生体内で Ly6G染色はイメージング処理中に分析の新しいパラメータを追加する可能性を示している（ 図3 ら ） を示唆していないそれらの移動度の欠陥を観察しなかった。血管の好中球の98％以上が適切にラベル付けされているが、骨髄の好中球の染色はあまり効率的であり、そして平均蛍光強度が強く、骨髄実質に向かって抗体の減少のアクセスを示唆し、低減された（データは示さず）。細胞機能のためのローダミンデキストラン、量子ドット、または、DAPI、ヨウ化プロピジウムのようなアポトーシスまたは壊死細胞の他の特定の染料、SYTOX 22、 または蛍光レポーターは、活性酸素種23の製造として、撮影時の尾静脈を介して静脈内に追加することができプロセスとは、そのような細胞死、食作用および好中球細胞外トラップとして機能特性を定量化するための良い機会を提供しています。マソら 12は、きれいに二つの異なる血管の色素を使用良好なコントラストの実質および血管系への低および高分子量を有する。蛍光染料の選択は、異なる蛍光レポーターの同時取得を可能にすることが重要です。実際には、励起波長が全て使用される蛍光色素との間の最良の妥協点を得るために適宜選択される。
本明細書で使用されるプロトコルの研究は、これまで困難であった、 生体内で細胞区画の生物学的活性を分析することが可能となる。骨髄組織の組織学的分析は、通常、薄切片を可能にするために、骨脱灰の長い準備を必要とし、それは組織の静的なビューを提供する。ダイナミックビューは実質および骨髄正弦波の間のセルの交換速度を強調しています。この迅速なプロセスは、炎症シ グナル5またはプレコンディショニングmyeloaplasive化学療法の際に細胞動員メカニズムのより良い理解を持つために解読するための重要なステップである養生法6。我々は、細胞血管内6のイベントを報告しているが、このプロセスは、定常状態での低周波にかろうじて検出可能である。しかし、炎症性シグナル伝達の際に強化される可能性がある。そのようなCCR2、CX3CR1またはCXCR4ケモカイン受容体は高度に血管内のプロセスに関与している、従って、これらの受容体の遺伝的無効化の使用は、細胞移動の経路における新規の基本的な洞察を提供しなければならない
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Acknowledgments
著者は編集の援助のためにアンダロンとピエールルイLoyherに感謝したい、2光子顕微鏡と支援を飼育したマウスのための動物施設「NAC」とカミーユBaudessonの支援についてPlateforme ImageriePitié-Salpêtrière（PICPS）。これらの結果につながる研究グラント契約の下で欧州共同体の第7次フレームワークプログラム（FP7 / 2007から2013）から資金提供を受け、N 304810を°いる - RAIDの、そしてnは241440-Endostem、INSERMから、大学ピエール·マリー·キュリーから "出現を° 「ラから「協会ラルシェルシュシュルルがんを注ぐ」とから「通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ」プログラムの創発2012（ANR-EMMA-050）」から、「リーグコントル·ルがん。 PHはラ "リーグコントル·ル癌」によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
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