Abstract
Vi præsenterer en procedure for at måle med høj præcision zink isotopforhold i mus organer. Zink er sammensat af 5 stabile isotoper (64 Zn, 66 Zn, 67 Zn, 68 Zn og 70 Zn), der er naturligt fraktioneret mellem museorganer. Vi viser først, hvordan at opløse de forskellige organer med henblik på at frigøre Zn-atomer; dette trin realiseres ved en blanding af HNO 3 og H 2 O 2. Vi derefter rense zinkatomer fra alle de andre elementer, især fra isobare interferenser (f.eks Ni), ved anionbytningskromatografi i en fortyndet HBr / HNO 3 medium. Disse første to trin udføres i en ren laboratorium ved hjælp renhed kemikalier høje. Endelig er isotopforhold målt ved anvendelse af et multi-kollektor induktivt koblet-plasma mass-spektrometer, i lav opløsning. Prøverne injiceres ved hjælp af en spray kammer og isotopfraktionering induceret af masse-spektrometer er korrektionented ved at sammenligne forholdet af prøverne i forholdet en standard (standard bracketing teknik). Denne fulde typiske procedure producerer et isotopforhold med en 50 ppm (2 sd) reproducerbarhed.
Introduction
Målingen af høj præcision (bedre end 100 ppm / atommasse enhed) zink stabil isotop sammensætning har kun været muligt for omkring 15 år takket være udviklingen af multi-collector plasma-source masse-spektrometre og er siden blevet det meste anvendt i Earth og planetariske videnskaber. Ansøgningerne til det medicinske område er nye og har et stort potentiale som biomarkører for sygdomme, der modificerer metabolismen af zink (f.eks Alzheimers sygdom). Dette papir rapporterer en metode til måling med høj præcision de naturlige stabile isotopforhold af zink i forskellige museorganer. Det samme ville gælde for humane prøver. Metoden består i at opløsningen af de organer, den kemiske oprensning af zink fra resten af atomerne, og derefter analyse af isotopforholdet på en masse-spektrometer.
Kvaliteten af Zn isotopiske målinger er afhængig af kvaliteten af den kemiske oprensning (renhed af Zn, lav blank compARED til mængden af Zn til stede i prøven, høj kemisk udbytte af proceduren) og om kontrol med den instrumentelle bias. Den høje renhed af det færdige Zn fraktion er nødvendig for at fjerne både isobare interferenser og ikke-isobarisk interferens, der skaber en matrix effekt. Isobare nuklider skaber direkte interferens (f.eks 64 Ni). Ikke-isobare interferenser generere såkaldte "matrix" effekt, og ændre den analytiske præcision af målingerne ved at ændre tilstanden af ionisering i forhold til rent zink standard, som prøverne sammenlignet med 1. En lav blank (<10 ng) indikerer, at der ikke er nogen forurening af prøverne med ekstern Zn, der ville bias målte isotopsammensætning. Som Zn isotoper kan fraktioneres under ionbytningskromatografi 2, indsamling af alle de Zn-atomer sikrer, at ingen isotopfraktionering forekommer, hvilket indebærer, at den kemiske procedure bør have en fuld udbytte. Endelig er en korrektion af det instrumentale isotopfraktionering under massespektrometri måling gøres via "standard bracketing" metode.
Derfor, for at de største problemer opnå præcise målinger styrer ekstern kontaminering (dvs. lav blank), der producerer en fuld udbytte kemisk rensning, der er ren med alle andre atomer eller molekyler, og korrigere instrumental isotopfraktionering på masse-spektrometer. I dette papir vil vi beskrive vores analytiske protokol til at adskille Zn fra musen organer samt massespektrometri målinger.
Ekstraktionen sker ved hjælp en lav mængde fortyndede syrer (HBr / HNO 3 medier) på mikro-søjler (0,5 pi og 0,1 ul) af anionbytterharpiks. Det har en fuld udbytte og målingerne har en ekstern reproducerbarhed bedre end 50 ppm på 66 Zn / 64 Zn-forhold. En anden fordel ved method er, at det er meget hurtigt. Metoden er derfor meget velegnet til medicinske videnskaber, i hvilken man nødt til at analysere et stort antal prøver i forhold til geovidenskabelige, hvor disse analytiske metoder blev udviklet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Procedurer, der involverer dyr er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Université Paris Diderot.
1. Fremstilling af materialer
- Sub-kog destillere 1 I af syrerne (HNO3, HBr) for at rense dem fra urenhed.
- Rengør bægre og tip adapter i en varm (~ 100 ° C) koncentreret HNO3 syrebad i mindst to dage.
- Vask pipettespidserne i en kold 3N HNO 3 bad i flere dage og skyl individuelt tre gange med deioniseret vand.
2. Prøvefremstilling
- Anesthetize mus ved intraperitoneal injektion af ketamin og xylazin. Vurdere anæstesi ved tå knivspids metode.
- Opsaml blod ved en hjertepunktur i nærvær af heparin i 1,5 ml rør.
- Adskille plasmaet fra blodceller ved centrifugering (10 min, 1500 x g) og overføre plasmaet til c polypropylenryogenic hætteglas bruger polypropylen tips.
- Fjern de resterende blod fra organer ved at skære den hepatiske vene og injicere DPBS gennem hjertet. Vurdere død af musen ved cervikal dislokation.
- Høste organer med sterile rustfrit stål instrumenter, befri dem af omgivende fedt hvis nogen, og snap-fryse dem i polypropylen kryogene hætteglas.
3. Kemisk Rensning
- Først opløses prøverne i en blanding af ~ 1 ml koncentreret (30%) H 2 O 2 og ~ 1 ml koncentreret (~ 15 M) HNO3. Har alle disse trin inde i en emhætte.
- Placer hele organ af interesse i en 15 ml Teflon bægerglas. Derefter tilføje H 2 O 2 / HNO 3 til bægerglasset 5. Hold bægerglasset åbne i et par minutter for at undgå stænk på grund af omsætningen af oxidation af det organiske stof og frigivelsen af CO 2.
- Endelig satte bægeret på en varm plade ved about 100 ° C i et par timer, eller indtil opløsningen er fuldstændig klar.
- Åbne bægerglas og tørre opløsningen på en varm plade ved ca. 100 ° C.
- Når prøven er tør, tilsættes 1 ml 1,5 N HBr til prøverne; lukke bægerglas og lad det opløse på en varmeplade ved 100 ° C i et par timer.
- Mellemtiden forberede pi kolonner 500.
- Tilføj 500 ul af AG1X8 200-400 mesh harpiks til kolonnen og sætte det på søjlen rack med en skraldespand bæger under den. Vask harpiksen ved skiftevis: 5 ml 18,2 MOhm ⋅ cm vand, 5 ml 0,5 N HNO3, 5 ml vand, 5 ml 0,5 N HNO3, og derefter 5 ml vand. Betingende for harpiksen med 5 ml 1,5 N HBr.
- Fjern bægerglassene fra varmepladen og sætte dem i ultralydsbad i ca. 30 minutter, og derefter lade bægerglassene køle ned til stuetemperatur.
- Når bægeret afkøles, og harpiksen vaskes, åbne bægerglas. Sæt spidsen adapter til than sprøjte, tilføje en pipettespids; pipetteres de 1 ml prøve og indlæse det på harpiksen (meget langsomt for ikke at agitere harpiks).
- Når al væsken passerer gennem søjlen, tilsættes 5 ml 1,5 N HBr.
- Når de 5 ml 1,5 N HBr passere gennem søjlen, udskifte trash bægerglas med en ren 15 ml bægerglas.
- Der tilsættes 5 ml 0,5 N HNO3 2,5 ml ad gangen. På dette stadium Zn elueres fra harpiksen.
- Når 5 ml HNO3 passerer gennem søjlen, fjernes bægerglasset og placer den på en varmeplade ved 100 ° C, indtil tørret.
- Fjern kolonnen fra kolonnen indehaveren; trash harpiksen (bruge en ny harpiks til hver prøve).
- Når prøven er tør, gentag protokol med samme volumen af syrer på en mindre kolonne (100 pi), og derefter placere den på en varmeplade, indtil tørret. Prøven er nu klar til masse-spektrometri.
4. Masse-spektrometri Måling
- Analyser Zn isotopiske kompomensætning på en multi kollektor-induktivt koblet plasma-massespektrometer (MC-ICP-MS).
- Brug maskinen parametre sammenfattet i tabel 1.
- Anbring Faraday kopper at samle sig ved masse (m / z) på 62 Ni, 63 Cu, Zn 64, 65 Cu, 66 Zn, 67 Zn og 68 Zn.
- Forbered en opløsning indeholdende 500 ppb Zn i 0,1 M HNO 3 til isotopanalyse.
- Analyser 500 ppb opløsning af Zn ved hjælp af en spray kammer kombineret med en 100 ul / min teflon forstøver. For hver prøve måler 30 scanninger (1 blok af 30 cykler), hvori integrationen for hver scanning er 8,389 sek.
- Korriger baggrunden ved at trække on-top nul intensiteter fra en blindprøve (0,1 M HNO 3 løsning, der bruges til at re-opløse prøverne).
- Kontrol og korrekt mulige 64 Ni isobarisk interferens ved at måle intensiteten af 62 Ni top.Antag at 64 Ni / 62 Ni-forholdet er naturligt (0,2548), korrekt denne værdi fra den instrumentale masse bias, og fjern derefter 64 Ni på massen 64 som:
64 Zn real = 64 Zn målt - 64 Ni = 64 Zn målt - (64 Ni / 62 Ni) naturlige x 62 Ni målt. - Korrigere instrumentale masse fordomme ved bracketing hver af prøverne med en 500 ppb standardopløsning af JMC Lyon Zn standard (eller en anden tilgængelig standard som IRMM-3702). Udfør standard bracketing ved at dividere den 66 Zn / 64 Zn-forhold på prøven ved gennemsnittet af 66 Zn / 64 Zn forholdet mellem de to standarder målt før og efter prøven minus 1 og ganget med 1,000 (se ligning 1). Typisk ekstern præcision på JMC Lyon Zn standard er 0,05 permil / amu (2 standardafvigelse, 2 sd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I 1,5 N HBr, de vigtigste zinkarter (ZnBr3-) former meget stærke komplekser med anionbytterharpiks, mens de fleste andre elementer ikke interagerer med harpiksen. Zink udvindes derefter ved at ændre mediet til fortyndet HNO3, ændre artsbestemmelse af Zn til Zn2 + som frigives fra harpiksen 6,7.
Isotopforhold typisk udtrykkes som dele pr 1.000 afvigelser i forhold til en standard:
med x = 66 eller 68. Henvisningen anvendte materiale er Zn "Lyon" standard JMC 3-0749 L 1. Den "Lyon" standard er den mest bredt anvendte referencemateriale til at normalisere Zn isotop data. Alle isotopiske resultater rapporteret derfor relativ. Ved hjælp af denne henvisning den isotopiske sammensætning af Jordens feller δ 66 Zn er 0,28 ± 0,05 8. Siden JMC-Lyon standarden er ikke let tilgængelige, i mangel af denne standard alternativet er at bruge standard IRMM-3702 som reference under målingerne og konvertere resultaterne ved hjælp af henvisning 9 som: 66 Zn JMC-Lyon = 66 Zn IRMM-3702 0,29. Den typiske råemne er <10ng.
Typiske resultater opnået med denne fremgangsmåde er repræsenteret i figur 1, som en tre-isotop plot (δ 68 Zn vs δ 66 Zn) for forskellige museorganer. Tabel 2 og 3 rapportresultater af replikerede eksperimenter i en typisk jordbaseret sten (en Hawaii basalt) og muse røde blodlegemer.
Figur 1. δ 68 Zn vs δ 66 Zntil forskellige mus organer. Den typiske fejl bar er 0,07 permil for δ 66 Zn og 0,15 for δ 68 Zn er vist på figuren. Data fra henvisning 15.
| MC-ICP-MS-indstillinger | Neptune |
| RF-effekt (W) | 1.300 |
| Acceleration potentiale (V) | 10.000 |
| Gasstrømningshastigheder | |
| Ar kølevæske (l / min) | 18 |
| Ar hjælpemotor (l / min) | 1 |
| Ar prøve (l / min) | 1-1,2 |
| Løsning optagelse sats (molution | 100 |
| Analyseparametre | |
| Antallet af blokke | 1 |
| Antal målinger pr blok | 30 |
| Integration tid (s) | 8,389 |
| Typisk Zn koncentrationen af prøver og standard (ppb) | 500 |
| Typisk sendeeffektivitet V / ppm | 25 |
Tabel 1: MC-ICP-MS indstillinger for Zn isotop målinger på Institut de physique du Globe de Paris.
| Prøver | δ 66 Zn | 2SE | δ 68 Zn | 2SE | n a |
| replikere 1 | 0,34 | 0.01 | 0,68 | 0.04 | 4 |
| replikere 2 | 0,34 | 0.01 | 0.68 | 0.01 | 3 |
| replikere 3 | 0,34 | 0.02 | 0,67 | 0.02 | 4 |
| replikere 4 | 0,36 | 0,06 | 0,7 | 0,09 | 4 |
| replikere 5 | 0,31 | 0.02 | 0,65 | 0,06 | 4 |
| replikere 6 | 0,33 | 0.01 | 0,68 | 0.02 | 3 |
| replikere 7 | 0,32 | 0,06 | 0,63 | 0,1 | 6 |
| Gennemsnitlig | 0,33 | 0.03 | 0,67 | 0.05 | 7 |
| 2SD | 0.04 | 0.05 | |||
| en n = antal gentage måling ved MC-ICP-MS |
Tabel 2: Zn isotopsammensætning Hawaii basalt K179-1R1-170.9 hver gentagelse repræsenterer en fuld kemisk rensning og gennemsnittet af flere uafhængige masse-spektrometer målinger.. Data fra henvisning 8.
| Mus nummer | δ 66 Zn | δ 68 Zn |
| 11 | 0,82 | 1.6 |
| 12 | 0,79 | 1,55 |
| 13 | 0,84 | 1,65 |
| 14 | 0,87 | 1.72 |
| Gennemsnitlig | 0,83 | 1,63 |
| 2SD | 0.07 | 0.15 |
Tabel 3: Zn isotopiske sammensætning af knogler fra mus Hver gentagelse repræsenterer en fuld kemisk rensning.. Data fra henvisning 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reproducerbarheden af målingerne evalueres ved replikerede analyser af de samme prøver udført i forskellige analytiske sessioner. For eksempel 6 har vi gentaget samme terrestriske sten 7 gange, og vi opnåede resultater er rapporteret i tabel 2.
Som forventet fra teorien om isotopfraktionering 10 og målt i ethvert solsystem materiale hidtil (fx meteorit 11-13, planter 3-5, dybhavsarter sedimenter 14, dyr 15-17), resultaterne følger en masse- afhængig lov (se figur 1). δ 68 Zn er omkring dobbelt δ 66 Zn (figur 1), fordi massen forskellen mellem 68 Zn og 64 Zn er to gange forskellen mellem 66 Zn og 64 Zn. Dette viser, at vores målinger er fri for isobare interferenser (der ville drive data såaf den lineære), og at zink isotoper er fraktioneret ud af den samme isotop pool.
For mus organer, har den begrænsede mængde Zn i hvert organ forhindret os i at udføre mange gentagelser af et enkelt organ 15. Imidlertid kan vi estimere en højere grænse for reproducerbarheden ved at sammenligne data for det samme væv for forskellige mus af samme alder og samme stamme (for eksempel til knoglerne af 16 uger gamle mus, tabel 3). Denne reproducerbarhed er større (0,04 vs 0,07 for δ 66 Zn), end hvad der blev estimeret ud fra basaltiske klipper, hvilket ikke overraskende, fordi den omfatter heterogeniteten af prøverne samt den isotopiske variabilitet mellem de forskellige mus. Det er derfor en overvurdering af reproducerbarhed, og vi mener, at præcisionen på hver enkelt organ ville svare til, hvad vi havde bestemt på basaltiske klipper. Vi kan roligt gå ud fra reproducerbarhed bedre end 0,10 for ^8; 66 Zn (2 sd), der repræsenterer en præcision 10 gange større end variabiliteten rapporteret mellem visse organer (se figur 1 og reference 15).
Måling af stabile isotop sammensætning af Zn vil blive anvendt i fremtiden som et diagnostisk værktøj til sygdomme, der modificerer Zn balance i kroppen. For eksempel zink-rige plaques er forbundet med Alzheimers sygdom ændrer koncentrationen af zink i serum og da hjernen og serum har forskellige isotopiske sammensætning 15 Zn isotoper kunne anvendes til at påvise tidlige fase af sygdommen.
De fleste alternative metoder til at måle Zn isotopiske sammensætning af MC-ICP-MS inddrage kemisk rensning i koncentreret HCI medier på større kolonner end den her 1-4 anvendes. Vores metode er baseret på mikro-søjler og fortyndede syrer har lave blanke og producerer data, der er to gange mere præcise (50 ppm vs 100 ppm 2 sd). I Addition, vores metode er meget hurtigt (på grund af den lille størrelse af kolonnerne og den lille mængde syre anvendt) og er meget velegnet til at analysere store mængde af prøver (som regel behov i kliniske studier). Enkelheden i den metode ville være velegnet til anvendelse i et automatisk kemisk rensning, som vil tillade målinger af et stort antal prøver.
En begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at kun store bulk-prøver kan analyseres (den procedure anvender ~ 1 ug Zn). Reducere størrelsen af prøverne er afgørende, når der beskæftiger sig med ædle kliniske prøver. Denne metode er også begrænset til bulk-målinger, mens det for nogle programmer i situ analyser kan være nødvendig. Fremtidige forbedringer på teknikken bør være i forhold til at forbedre in situ isotopiske målinger ved at kombinere en laser-ablation system med den plasma mass-spektrometer (LA-MC-ICP-MS). Dette vil give målingerne af rumligt små prøver uden prior kemisk rensning (som har tendens til forurene prøverne). Desuden in situ målinger vil tillade måling af Zn isotopiske sammensætning på levende væv. Så vidt vi ved har der kun været ét forsøg til at måle zink isotopforhold anvendelse af en sådan teknik 18 og fremgangsmåden er stadig ikke præcist nok, men er blevet gjort målinger af høj præcision isotopforhold af LA-MC-ICP-MS for Fe 19 og B 20 og raffinering af teknikken ved hjælp af moderne lasere kan føre til et større gennembrud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
FM anerkender støtte fra ANR gennem en chaire d'Excellence IDEX Sorbonne Paris Cité, at INSU gennem en PNP tilskud, Institut Universitaire de France samt LABEX UniverEarth programmet på Sorbonne Paris Cité (ANR-10-LabX-0023 og ANR -11-IDEX-0005-02). Vi takker også støtte fra Det Europæiske Forskningsråd under Det Europæiske Fællesskabs H2020 rammeprogram / ERC tilskudsaftale # 637503 (Pristine).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter | Thermo-Fisher | ||
| Anion-exchange resin AG1 X8 200-400 | Bio-Rad | 140-1443-MSDS | |
| Teflon beakers | Savillex | 200-015-12 | |
| In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon |
References
- Marechal, C. N., Telouk, P., Albarede, F. Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma-source mass spectrometry. Chemical Geology. 156 (1), 251-273 (1999).
- Marechal, C. N., Albarede, F. Ion-exchange fractionation of copper and zinc isotopes. Geochim. Cosmochim. Acta. 66 (9), 1499-1509 (2001).
- Weiss, D. J., Mason, T. F. D., Zhao, F. J., Kirk, G. J. D., Coles, B. J. Isotopic discrimination of zinc in higher plants. New Phytologist. 165 (3), 703-710 (2005).
- Jouvin, D., Louvat, P., N, M. F. C. Zinc isotopic fractionation: why organic matters. Environ Sci Technol. 43 (15), 5747-5754 (2009).
- Moynier, F., et al. Isotopic fractionation and transport mechanisms of Zn in plants. Chemical Geology. 267 (3-4), 125-130 (2009).
- Moynier, F., Herzog, G., Albarede, F. Isotopic composition of zinc, copper, and iron in lunar samples. Geochim. Cosmochim. Acta. 70 (24), 6103-6117 (2006).
- Moynier, F., et al.
- Chen, H., Savage, P., Teng, F. Z., Helz, R., Moynier, F. Zinc isotope fractionation during magmatic differentiation and the isotopic composition of the bulk Earth. Earth Planet. Sci. Lett. 369-370, 34-42 (2013).
- Moeller, K., et al. Calibration of the new certified materials ERM-AE633 and ERM-AE6447 for copper and IRMM 3702 for zinc isotope amount ratio determination. Geostd. Geoan. Res. 36 (2), 177-199 (2012).
- Bigeleisen, J., Mayer, M. Calculation of equilibrium constants for isotopic exchange reactions. J. Chem. Phys. 15, 261-267 (1947).
- Luck, J. M., Ben Othman, D., Albarede, F. Zn and Cu isotopic variations in chondrites and iron meteorites: Early solar nebula reservoirs and parent-body processes. Geochim. Cosmochim. Acta. 69 (22), 5351-5363 (2005).
- Moynier, F., Dauphas, N., Podosek, F. A Search for 70Zn Anomalies in Meteorites. Astrophys. J. 700 (2), L92-L95 (2009).
- Paniello, R., Day, J., Moynier, F. Zn isotope evidence for the origin of the Moon. Nature. 490 (7420), 376-380 (2012).
- Pichat, S., Douchet, C., Albarede, F. Zinc isotope variations in deep-sea carbonates from the eastern equatorial Pacific over the last 175 ka. Earth and Planetary Science Letters. 210 (1-2), 167-178 (2003).
- Moynier, F., Fujii, T., Shaw, A., Le Borgne, M. Heterogeneous of natural Zn isotopes in mice. Metallomics. 5 (6), 693-699 (2013).
- Balter, V., et al. Bodily variability of zinc natural isotope abundance in sheep. Rapid Com. Mass. Spec. 24, 605-612 (2010).
- Balter, V., et al. Contrasting Cu, Fe, and Zn isotopic patterns in organs and body fluids of mice and sheep, with emphasis on cellular fractionation. Metallomics. 5 (11), 1470-1482 (2010).
- Urgast, D. S., et al. Zinc isotope ratio imaging of rat brain thin sections from stable isotope tracer by LA-MC-ICP-MS. Metallomics. 4, 1057-1063 (2012).
- Marin-Carbonne, J., Rollion-Bard, C., Luais, B. In-situ measurements of iron isotopes by SIMS: MC-ICP-MS intercalibration and application to a magnetite crystal from the Gunflint chert. Chem. Geol. 285 (1-4), 50-61 (2011).
- Fietzke, J., et al. Boron isotope ratio determination in carbonates via LA-MC-ICP-MS using soda-lime glass standards as reference material. J. Anal. Atom. Spec. 25, 1953-1957 (2010).
