Abstract
We presenteren een procedure om te meten met een hoge precisie zink isotopenverhoudingen in muis organen. Zinc bestaat uit 5 stabiele isotopen (64 Zn, 66 Zn, 67 Zn, 68 Zn en 70 Zn) die natuurlijk gefractioneerd tussen muis organen. We tonen eerst hoe de verschillende organen te lossen teneinde de Zn atomen vrij; Deze stap wordt uitgevoerd door een mengsel van HNO 3 en H 2 O 2. Vervolgens zuiveren de zinkatomen van alle andere elementen, met name van isobare interferenties (bijvoorbeeld Ni) door anion-uitwisselingschromatografie in een verdunde HBr / HNO 3 medium. Deze eerste twee stappen worden uitgevoerd in een schone laboratorium met behulp van zeer zuivere chemicaliën. Tenslotte worden de isotoop verhoudingen gemeten met een multi-collector inductief gekoppeld plasma massa spectrometer, in lage resolutie. De monsters worden geïnjecteerd met een sproeikamer en isotopische fractionering geïnduceerd door de massaspectrometer is correctieted door vergelijking van de verhouding van de monsters aan het formaat van een standaard (standaard bracketing techniek). Deze volledige typische procedure produceert een isotoop verhouding met een 50 ppm (2 sd) reproduceerbaarheid.
Introduction
De meting van hoge precisie (meer dan 100 ppm / atomaire massa-eenheid) zink stabiele isotopensamenstelling alleen mogelijk gedurende ongeveer 15 jaar door de ontwikkeling van multi-collector plasma-source massaspectrometers en is sindsdien vooral toegepast in Earth en planetaire wetenschappen. De toepassingen op medisch gebied zijn nieuw en bezitten een groot potentieel als biomarkers voor ziekten die het metabolisme van zink (bijvoorbeeld ziekte van Alzheimer) te wijzigen. Dit artikel meldt een methode voor het meten met een hoge precisie de natuurlijke stabiele isotoop verhoudingen van zink in verschillende muis organen. Hetzelfde zou gelden voor menselijke monsters. De werkwijze omvat het oplossen van de organen, de chemische zuivering van zink uit de rest van de atomen en de analyse van de isotopenverhouding een massaspectrometer.
De kwaliteit van Zn isotoopmetingen is afhankelijk van de kwaliteit van de chemische zuivering (zuiverheid Zn, lage lege compingared de hoeveelheid Zn in het monster, hoge chemische opbrengst van de procedure) en de controle van de instrumentele voorspanning. De hoge zuiverheid van het uiteindelijke Zn fractie zijn nodig om isobare interferenties als niet-isobare interferentie die een matrix effect te verwijderen. Isobaric nucliden creëren directe storingen (bv 64 Ni). Non-isobare interferenties genereren zogenaamde "matrix" effect en pas analytische nauwkeurigheid van de metingen door het veranderen van de toestand van de ionisatie in vergelijking met de zuiver zink standaard waaraan de monsters worden vergeleken met 1. Een lage blank (<10 ng) aan dat er geen contaminatie van monsters door externe Zn dat doen neigen de gemeten isotopensamenstelling. Aangezien Zn isotopen tijdens ionenwisselingschromatografie 2 kan worden gefractioneerd, het verzamelen van de Zn atomen wordt voorkomen dat isotopische fractionering optreedt, hetgeen inhoudt dat de chemische procedure een volledige opbrengst moeten. Tenslotte wordt de correctie van de instrumentele isotopenfractionatie tijdens de massaspectrometrie meting uitgevoerd via de "standaard bracketingprogramma" methode.
Daarom is de belangrijkste problemen bij het verkrijgen nauwkeurige metingen bestuurt de uitwendige besmetting (bijv laag spatie), waardoor een volledige opbrengst chemische zuivering die vrij van andere atomen of moleculen, en tegen de instrumentele isotopische fractionering op de massaspectrometer. In dit document zullen we ons analyseprotocol beschrijven Zn scheiden van de muis organen en de massa-spectrometrie metingen.
De extractie wordt gedaan met behulp van een lage hoeveelheid verdunde zuren (HBr / HNO 3 media) op micro-kolommen (0,5 pi en 0,1 pl) van anionenwisselingshars. Het heeft een volledige opbrengst en de metingen extern reproduceerbaarheid beter dan 50 ppm op 66 Zn / Zn 64 verhouding. Een ander voordeel van het method is dat het zeer snel. De werkwijze is dus zeer goed aangepast aan de medische wetenschappen, waarbij men moet een groot aantal monsters in vergelijking met geosciences, wanneer deze analytische methoden ontwikkeld analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: procedures waarbij dieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Université Paris Diderot.
1. Voorbereiding van Materialen
- Sub-kook destilleren 1 L van de zuren (HNO3, HBr) om ze te zuiveren van verontreinigingen.
- Reinig de bekers en tip adapter in een hete (~ 100 ° C) geconcentreerd HNO 3 zuurbad ten minste twee dagen.
- Was de pipetpunten in een koude 3 N HNO 3 bath enkele dagen en spoel individueel driemaal met gedeïoniseerd water.
2. Monstervoorbereiding
- Verdoven de muizen door intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine. Beoordelen verdoving door de teen knijpen methode.
- Verzamel het bloed door een cardiale punctuur in de aanwezigheid van heparine in 1,5 ml buizen.
- Scheid het plasma van bloedcellen door centrifugeren (10 min, 1500 x g) en giet het plasma polypropyleen cryogenic flacons met polypropyleen tips.
- Verwijder de resterende bloed van organen door het snijden van de leverader en het injecteren van DPBS door het hart. Beoordelen van de dood van de muis door cervicale dislocatie.
- Oogst de organen met steriele roestvrijstalen instrumenten, hen te bevrijden van de omliggende vet indien aanwezig, en snap-vries ze in polypropyleen cryogene flesjes.
3. Chemische Zuivering
- Eerst Los de monsters in een mengsel van ~ 1 ml geconcentreerde (30%) H 2 O 2 en ~ 1 ml geconcentreerde (~ 15 M) HNO 3. Doe al deze stappen in een zuurkast.
- Plaats het gehele orgaan van belang in een 15 ml Teflon beker. Voeg vervolgens de H 2 O 2 / HNO3 aan de beker 5. Houd het bekerglas geopend gedurende enkele minuten om spatten als gevolg van de reactie van de oxidatie van de organische stof en de afgifte van CO 2 voorkomen.
- Tot slot zet de beker op een hete plaat bij about 100 ° C gedurende enkele uren of totdat de oplossing helder is.
- Open het bekerglas en drogen van de oplossing op een hete plaat bij ongeveer 100 ° C.
- Zodra het monster droog is, voeg 1 ml van 1,5 N HBr om de monsters; Sluit het bekerglas en laten smelten op een hete plaat bij 100 ° C gedurende enkele uren.
- Ondertussen bereidt de 500 pi kolommen.
- Voeg 500 ul van de AG1X8 200-400 mesh hars om de kolom en zet het op de kolom rek met een prullenbak beker eronder. Was de hars door afwisselende: 5 ml van 18,2 MQ ⋅ cm water, 5 ml 0,5 N HNO 3, 5 ml water, 5 ml 0,5 N HNO 3, en 5 ml water. Conditioneer de hars met 5 ml van 1,5 N HBr.
- Verwijder de bekers uit de hete plaat en leg ze in een ultrasoon bad voor ongeveer 30 minuten, en laat de bekers afkoelen tot kamertemperatuur.
- Zodra de beker wordt gekoeld en de hars wordt gewassen, opent de beker. Zet de tip adapter aan tHij spuit, voeg een pipet tip; pipet de 1 ml van het monster en te laden op de hars (heel langzaam om de hars niet te ageren).
- Nadat alle vloeistof door de kolom, voeg 5 ml van 1,5 N HBr.
- Zodra de 5 ml van 1,5 N HBr pass kolom vervangt de prullenbak bekerglas met een schone beker 15 ml.
- Voeg 5 ml 0,5 N HNO 3 2,5 ml per keer. In dit stadium Zn wordt uit de hars geëlueerd.
- Zodra 5 ml van HNO 3 gaat door de kolom, verwijder de beker en plaats het op een hete plaat bij 100 ° C tot gedroogd.
- Verwijder de kolom uit de kolom houder; trash de hars (gebruik een nieuwe hars voor elk monster).
- Zodra het monster droog is, herhaalt het protocol met hetzelfde volume van zuren op een kleinere kolom (100 pi) en plaats het op een hete plaat tot gedroogd. Het monster is nu klaar voor de massa-spectrometrie.
4. Massa-spectrometrie Measurement
- Analyseer de Zn isotopen compositie op een multi-collector inductief gekoppeld plasma massaspectrometer (MC-ICP-MS).
- Gebruik de machineparameters samengevat in tabel 1.
- Plaats de Faraday cups te verzamelen aan massa (m / z) van 62 Ni, 63 Cu, 64 Zn, 65 Cu, 66 Zn, 67 Zn en 68 Zn.
- Bereid een oplossing met 500 ppb Zn in 0,1 M HNO 3 voor isotoopanalyse.
- Analyseer de 500 ppb oplossing van Zn door opgespoten chamber met 100 pl / min teflon vernevelaar. Voor elk monster, gemeten 30 scans (1 blok 30 cycli) waarbij de integratietijd van elke scan is 8,389 sec.
- Corrigeer de achtergrond door het aftrekken van de on-peak zero intensiteiten van een blanco-oplossing (de 0,1 M HNO 3 oplossing die wordt gebruikt om opnieuw ontbinding van de monsters).
- Controle en correct mogelijke 64 Ni isobare interferentie door meting van de intensiteit van de 62 Ni piek.Neem aan dat de 64 Ni / 62 Ni-verhouding is natuurlijk (0,2548), juist deze waarde van het instrumentale massa bias, en verwijder vervolgens de 64 Ni op de massa 64 als:
64 Zn echte = 64 Zn gemeten - 64 Ni = 64 Zn gemeten - (64 Ni / 62 Ni) natuurlijke x 62 Ni gemeten. - Corrigeer de instrumentale massa vertekening door bracketing elk van de monsters met een 500 ppb standaard oplossing van het JMC Lyon Zn-standaard (of een andere beschikbare standaard, zoals IRMM-3702). Voer de standaard bracketing door 66 Zn / Zn 64 verhouding van het monster te delen door het gemiddelde van de 66 Zn / Zn 64 verhouding van de twee standaarden gemeten voor en nadat het monster minus 1 en vermenigvuldigd met 1000 (zie vergelijking 1). Typische externe precisie op de JMC Lyon Zn standaard 0.05 permil / amu (2 standaarddeviatie, 2 sd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In 1,5 N HBr, voornamelijk zink species (ZnBr3-) vormen sterke complexen met het anion-uitwisselende hars, terwijl de meeste andere elementen geen interactie met de hars. Zink wordt vervolgens hersteld door het medium verdunde HNO3, veranderen de speciatie van Zn Zn 2+ dat vrijkomt uit de hars 6,7.
Isotopenverhoudingen zijn meestal uitgedrukt in delen per 1.000 afwijkingen ten opzichte van een standaard:
met x = 66 of 68. De verwijzing gebruikte materiaal is de Zn "Lyon" standaard JMC 3-0749 L 1. De "Lyon" standaard is de meest algemeen gebruikte referentiemateriaal voor Zn isotopen data te normaliseren. Alle isotopische gerapporteerde resultaten zijn daarom relatief. Met deze verwijzing de isotopensamenstelling van de Aarde fof δ 66 Zn is 0,28 ± 0,05 8. Omdat de JMC-Lyon standaard niet gemakkelijk beschikbaar is, bij het ontbreken van deze standaard het alternatief is om de standaard IRMM-3702 gebruiken als referentie tijdens de metingen en zetten de resultaten met behulp van referentie-9 als: 66 Zn JMC-Lyon = 66 Zn IRMM-3702 0,29. De typische leeg is <10 ng.
Typische resultaten verkregen met deze methode worden weergegeven in de figuur 1, als een drie-isotoop perceel (δ 68 Zn vs δ 66 Zn) voor verschillende muis organen. Tabel 2 en 3 verslag van de resultaten van gerepliceerde experimenten van een typische aardse rock (een Hawaiiaanse basalt) en muizen rode bloedcellen.
Figuur 1. δ 68 Zn vs δ 66 Znvoor verschillende muis organen. De typische foutenbalk is 0,07 permil voor δ 66 Zn en 0,15 voor δ 68 Zn weergegeven in de figuur. Gegevens van referentie 15.
| MC-ICP-MS instellingen | Neptunus |
| RF vermogen (W) | 1300 |
| Versnellingspotentiaal (V) | 10.000 |
| Gasstroomsnelheden | |
| Ar koelvloeistof (l / min) | 18 |
| Ar extra (l / min) | 1 |
| Ar monster (l / min) | 1-1,2 |
| Oplossing opnamesnelheid (molution | 100 |
| Analyse parameters | |
| Aantal blokken | 1 |
| Aantal metingen per blok | 30 |
| Integratie tijd (s) | 8,389 |
| Typische Zn concentratie van de monsters en de standaard (ppb) | 500 |
| Typische transmissie efficiency V / ppm | 25 |
Tabel 1: MC-ICP-MS-instellingen voor de Zn isotoop metingen bij het Institut de Physique du Globe de Paris.
| Samples | δ 66 Zn | 2SE | δ 68 Zn | 2SE | n a |
| repliceren 1 | 0.34 | 0.01 | 0.68 | 0.04 | 4 |
| repliceren 2 | 0.34 | 0.01 | 0.68 | 0.01 | 3 |
| repliceren 3 | 0.34 | 0.02 | 0.67 | 0.02 | 4 |
| repliceren 4 | 0.36 | 0.06 | 0.7 | 0.09 | 4 |
| repliceren 5 | 0.31 | 0.02 | 0.65 | 0.06 | 4 |
| repliceren 6 | 0,33 | 0.01 | 0.68 | 0.02 | 3 |
| repliceren 7 | 0.32 | 0.06 | 0.63 | 0.1 | 6 |
| Gemiddelde | 0,33 | 0.03 | 0.67 | 0.05 | 7 |
| 2SD | 0.04 | 0.05 | |||
| a n = aantal terugkerende meting door MC-ICP-MS |
Tabel 2: Zn isotopische samenstelling van het Hawaii basalt K179-1R1-170.9 Ieder repliceren vertegenwoordigt een volledige chemische zuivering en het gemiddelde van verschillende onafhankelijke massa-spectrometer metingen.. Gegevens uit referentie 8.
| Mouse nummer | δ 66 Zn | δ 68 Zn |
| 11 | 0.82 | 1.6 |
| 12 | 0.79 | 1.55 |
| 13 | 0.84 | 1.65 |
| 14 | 0.87 | 1.72 |
| Gemiddelde | 0,83 | 1.63 |
| 2SD | 0.07 | 0.15 |
Tabel 3: Zn isotoopsamenstelling van beenderen van muizen Ieder repliceren vertegenwoordigt een volledige chemische zuivering.. Gegevens van referentie 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De reproduceerbaarheid van de metingen wordt geëvalueerd door middel gerepliceerd analyses van dezelfde monsters tijdens verschillende analytische sessies uitgevoerd. Zo 6, hebben we dezelfde aardse steen 7 keer herhaald en worden de resultaten weergegeven in tabel 2 verkregen.
Zoals verwacht van de theorie van de isotopische fractionering 10 en zoals gemeten in elk zonnestelsel materiaal tot nu toe (bijv meteoriet 11-13, planten 3-5, diepzeesedimenten 14, dieren 15-17), de resultaten volgt een massa- afhankelijke recht (zie figuur 1). δ 68 Zn ongeveer tweemaal δ 66 Zn (figuur 1), aangezien het verschil in massa tussen 68 en 64 Zn Zn tweemaal het verschil tussen 66 Zn en 64 Zn. Dit toont aan dat onze metingen zijn vrij van isobare interferenties (dat zou de gegevens uit te drijvenvan de rechte lijn) en dat zink isotopen zijn gefractioneerde uit dezelfde isotoop zwembad.
Voor mouse organen, heeft de beperkte hoeveelheid Zn in elk orgaan ons belet van vele herhalingen van één orgaan 15. Wij kunnen schatten een hogere grenswaarde voor de reproduceerbaarheid door gegevens voor hetzelfde weefsel voor verschillende muizen van dezelfde leeftijd en dezelfde stam (bijvoorbeeld de botten van 16 weken oude muizen, Tabel 3). Deze reproduceerbaarheid is groter (0,04 versus 0,07 voor δ 66 Zn) dan uit basaltrotsen, hetgeen niet verrassend omdat het ook de heterogeniteit van de monsters en de isotopische variatie tussen de verschillende muizen werd geschat. Het is daarom een overschatting van de reproduceerbaarheid, en wij geloven dat de precisie op elke afzonderlijke orgaan vergelijkbaar met wat we hadden vastgesteld op basaltrotsen zou zijn. We kunnen veilig aannemen reproduceerbaarheid beter dan 0,10 voor de ^8, 66 Zn (wg 2), die een nauwkeurige 10 keer groter dan de gerapporteerde variabiliteit tussen bepaalde organen (zie figuur 1 en referentie 15) representeert.
Het meten van de stabiele isotopensamenstelling van Zn wordt gebruikt in de toekomst als diagnostisch middel voor ziekten die het Zn balans van het lichaam modificeren. Bijvoorbeeld, de zinkrijke plaques geassocieerd met de ziekte van Alzheimer verandert de concentratie van zink in het serum en aangezien de hersenen en het serum verschillende isotopensamenstelling 15 Zn isotopen kunnen worden gebruikt om vroeg stadium van de ziekte op te sporen.
De meeste alternatieve methoden voor de Zn isotopensamenstelling door MC-ICP-MS meten betrekken chemische zuivering in geconcentreerde HCl media op grotere kolommen dan de hier 1-4 gebruikt. Onze methode op basis van micro-kolommen en verdunde zuren heeft een lage blanks en produceert gegevens die twee keer nauwkeuriger (50 ppm vs 100 ppm 2 sd). In Addition, onze methode is zeer snel (vanwege de kleine afmetingen van de kolommen en de kleine hoeveelheid zuur medium) en is zeer geschikt voor het analyseren hoeveelheid stalen (zoals gewoonlijk vereist in klinische studies). De eenvoud van de werkwijze zouden goed geschikt voor gebruik in een automatische chemische zuiveringsinstallatie waarbij de metingen van een groot aantal monsters mogelijk maakt.
Een beperking van deze benadering is dat alleen grote bulk monsters kunnen worden geanalyseerd (de procedure gebruikt ~ 1 ug Zn). Het verminderen van de grootte van de monsters is cruciaal bij het omgaan met kostbare klinische monsters. Deze werkwijze is eveneens beperkt tot massa metingen, terwijl voor sommige toepassingen in situ analyse nodig zijn. Toekomstige verbetering van de techniek moet in verband met de verbetering in situ isotoopmetingen een combinatie van een laser-ablatie systeem met plasma massaspectrometer (LA-MC-ICP-MS). Dit zou de metingen van ruimtelijk kleine monsters zonder p toestaanrior chemische zuivering (waarbij doorgaans de monsters besmetten). Bovendien, in situ metingen de meting van de Zn isotopensamenstelling op levende weefsels mogelijk. Voor zover wij weten is er slechts één poging om zink isotoopverhoudingen met een dergelijke techniek 18 te meten en de methode is nog steeds niet nauwkeurig genoeg, maar metingen van hoge precisie isotopenverhouding door LA-MC-ICP-MS is gedaan voor Fe 19 en B 20 en zuiveren van de techniek met moderne lasers kan leiden tot een grote doorbraak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
FM erkent de financiering van de ANR via een chaire d'Excellence IDEX Sorbonne Paris Cité, de INSU door een PNP subsidie, het Institut Universitaire de France evenals de Labex UniverEarth programma op Sorbonne Paris Cité (ANR-10-LabX-0023 en ANR -11-IDEX-0005-02). We danken ook de financiering van de Europese Onderzoeksraad in het kader van de Europese Gemeenschap H2020 kaderprogramma / ERC subsidieovereenkomst # 637.503 (Pristine).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter | Thermo-Fisher | ||
| Anion-exchange resin AG1 X8 200-400 | Bio-Rad | 140-1443-MSDS | |
| Teflon beakers | Savillex | 200-015-12 | |
| In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon |
References
- Marechal, C. N., Telouk, P., Albarede, F. Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma-source mass spectrometry. Chemical Geology. 156 (1), 251-273 (1999).
- Marechal, C. N., Albarede, F. Ion-exchange fractionation of copper and zinc isotopes. Geochim. Cosmochim. Acta. 66 (9), 1499-1509 (2001).
- Weiss, D. J., Mason, T. F. D., Zhao, F. J., Kirk, G. J. D., Coles, B. J. Isotopic discrimination of zinc in higher plants. New Phytologist. 165 (3), 703-710 (2005).
- Jouvin, D., Louvat, P., N, M. F. C. Zinc isotopic fractionation: why organic matters. Environ Sci Technol. 43 (15), 5747-5754 (2009).
- Moynier, F., et al. Isotopic fractionation and transport mechanisms of Zn in plants. Chemical Geology. 267 (3-4), 125-130 (2009).
- Moynier, F., Herzog, G., Albarede, F. Isotopic composition of zinc, copper, and iron in lunar samples. Geochim. Cosmochim. Acta. 70 (24), 6103-6117 (2006).
- Moynier, F., et al.
- Chen, H., Savage, P., Teng, F. Z., Helz, R., Moynier, F. Zinc isotope fractionation during magmatic differentiation and the isotopic composition of the bulk Earth. Earth Planet. Sci. Lett. 369-370, 34-42 (2013).
- Moeller, K., et al. Calibration of the new certified materials ERM-AE633 and ERM-AE6447 for copper and IRMM 3702 for zinc isotope amount ratio determination. Geostd. Geoan. Res. 36 (2), 177-199 (2012).
- Bigeleisen, J., Mayer, M. Calculation of equilibrium constants for isotopic exchange reactions. J. Chem. Phys. 15, 261-267 (1947).
- Luck, J. M., Ben Othman, D., Albarede, F. Zn and Cu isotopic variations in chondrites and iron meteorites: Early solar nebula reservoirs and parent-body processes. Geochim. Cosmochim. Acta. 69 (22), 5351-5363 (2005).
- Moynier, F., Dauphas, N., Podosek, F. A Search for 70Zn Anomalies in Meteorites. Astrophys. J. 700 (2), L92-L95 (2009).
- Paniello, R., Day, J., Moynier, F. Zn isotope evidence for the origin of the Moon. Nature. 490 (7420), 376-380 (2012).
- Pichat, S., Douchet, C., Albarede, F. Zinc isotope variations in deep-sea carbonates from the eastern equatorial Pacific over the last 175 ka. Earth and Planetary Science Letters. 210 (1-2), 167-178 (2003).
- Moynier, F., Fujii, T., Shaw, A., Le Borgne, M. Heterogeneous of natural Zn isotopes in mice. Metallomics. 5 (6), 693-699 (2013).
- Balter, V., et al. Bodily variability of zinc natural isotope abundance in sheep. Rapid Com. Mass. Spec. 24, 605-612 (2010).
- Balter, V., et al. Contrasting Cu, Fe, and Zn isotopic patterns in organs and body fluids of mice and sheep, with emphasis on cellular fractionation. Metallomics. 5 (11), 1470-1482 (2010).
- Urgast, D. S., et al. Zinc isotope ratio imaging of rat brain thin sections from stable isotope tracer by LA-MC-ICP-MS. Metallomics. 4, 1057-1063 (2012).
- Marin-Carbonne, J., Rollion-Bard, C., Luais, B. In-situ measurements of iron isotopes by SIMS: MC-ICP-MS intercalibration and application to a magnetite crystal from the Gunflint chert. Chem. Geol. 285 (1-4), 50-61 (2011).
- Fietzke, J., et al. Boron isotope ratio determination in carbonates via LA-MC-ICP-MS using soda-lime glass standards as reference material. J. Anal. Atom. Spec. 25, 1953-1957 (2010).
