Abstract
Мы представляем процедуру измерения с высокой точностью соотношения изотопов цинка в органах мыши. Цинк состоит из 5 стабильных изотопов (64 Zn, Zn, 66 67, 68 Zn Zn и 70 Zn), которые, естественно, фракционированных между органами мыши. Покажем сначала, как распустить различные органы для того, чтобы бесплатно атомы Zn; Этот шаг реализуется с помощью смеси HNO 3 и H 2 O 2. Затем очистить атомов цинка от всех других элементов, в частности, из изобарических помех (например, Ni), с помощью анионообменной хроматографии в разбавленных HBr / HNO 3 среде. Эти первые два шага выполняются в чистом лаборатории с использованием химических веществ с высокой степенью чистоты. Наконец, изотопные измеряются с помощью мульти-коллектор с индуктивно-связанной плазмы масс-спектрометр, в низком разрешении. Образцы вводят с помощью камеры распыления и изотопного фракционирования, вызванную масс-спектрометра является correcTed, сравнивая соотношение количества образцов в соотношении стандарта (стандартной методике вилка). Это полный Типичная процедура производит соотношение изотопов с 50 млн (2 SD) воспроизводимости.
Introduction
Измерение высокой точности (лучше, чем 100 частей на миллион / атомная единица массы) цинка стабильный изотоп состав было возможно только в течение примерно 15 лет благодаря развитию мульти-коллекторных плазменный источник масс-спектрометров и с тех пор в основном применяются в Земле и планетарных наук. Приложения к области медицины являются новыми и имеют большой потенциал в качестве биомаркеров для болезней, которые изменяют метаболизм цинка (например, болезни Альцгеймера). Эта статья сообщает метод измерения с высокой точностью природных стабильных изотопов цинка в различных органах мыши. То же самое применимо к образцам человека. Суть метода состоит в растворении органов, химической очистки цинка из остальных атомов, а затем в анализе соотношение изотопов на масс-спектрометре.
Качество Zn изотопных измерений зависит от качества химической очистки (чистоты Zn, низкое пустым оценочногоared к количеству Zn, присутствующего в образце, с высоким химический выход из процедуры) и на контроле инструментальной смещения. Высокой чистоты конечного Zn фракции необходимо удалить обе изобарических помех и неизобарических помех, которые создают эффект матрицы. Изобарические нуклиды создать прямые помехи (например, 64 Ni). Неизобарических помехи генерируют так называемую "матрицу" эффект и изменить аналитическую точность измерений при изменении состояния ионизации по сравнению с чистого цинка стандарта, к которому образцы по сравнению с 1. Низкий пустым (<10 нг) указывает, что нет загрязнение образцов внешним Zn, которые смещения измеренного изотопного состава. Как Zn изотопы могут быть фракционированию во ионообменной хроматографии 2, совокупность всех атомов Zn гарантирует, что изотопный фракционирования не происходит, что означает, что химическая процедура должна иметь полный выход, Наконец, коррекция инструментальной изотопного фракционирования при измерении масс-спектрометрии делается с помощью метода "стандарт" брекетинга.
Таким образом, основные трудности для получения точных измерений контролируют внешнего загрязнения (т.е. низкой пустым), производя полный выход химическую очистку, которая очищена от каких-либо других атомов или молекул, и коррекции инструментальный изотопного фракционирования на массового спектрометра. В этой статье мы опишем наш аналитический протокол, чтобы отделить Zn из органов мыши, а также измерений масс-спектрометрические.
Добыча производится с использованием малое количество разбавленных кислот (HBr / HNO 3 СМИ) на микро-колонки (0,5 мкл и 0,1 мкл) анионообменной смолы. Он имеет полное выход и измерения имеют внешний воспроизводимость лучше, чем 50 частей на миллион по соотношению 66 Zn / Zn 64. Еще одно преимущество метOD, что это очень быстро. Способ, таким образом, очень хорошо адаптированы к медицинских наук, в которой нужно анализировать большое количество образцов по сравнению с геонауках, где были разработаны эти аналитические методы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры с участием животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) в Университете Париж Дидро в.
1. Подготовка материалов
- Суб-кипят перегонять 1 л кислот (HNO 3, HBr) для того, чтобы очистить их от примесей.
- Очистите стаканы и наконечник адаптер в горячей (~ 100 ° С) сосредоточены ванну HNO 3 кислоты, по крайней мере два дня.
- Вымойте наконечники в холодной 3 н HNO 3 бане в течение нескольких дней и промыть отдельно три раза деионизированной водой.
2. Подготовка образцов
- Обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина. Оценка анестезии по методу палец пинча.
- Собирают кровь сердечной пункцией в присутствии гепарина в 1,5 мл пробирки.
- Отделите плазму от клеток крови центрифугированием (10 мин, 1500 мкг) и передать плазму полипропилена Cryogenic флаконы, используя подсказки полипропиленовые.
- Удалите остатки крови из органов за счет сокращения печеночных вен и инъекционных DPBS через сердце. Оценка гибель мышей путем смещени шейных позвонков.
- Урожай органы стерильными инструментами из нержавеющей стали, освободить их от окружающих жир, если таковые имеются, и оснастки заморозить их в полипропиленовые флаконы криогенных.
3. Химическая очистка
- Во-первых, распустить образцов в смеси ~ 1 мл концентрированной (30%) H 2 O 2 и ~ 1 мл концентрированной (~ 15 м) HNO 3. У всех этих шагов внутри вытяжного шкафа.
- Поместите весь орган интерес в 15-миллилитровую тефлоновую мензурку. Затем добавьте H 2 O 2 / HNO 3 в стакан 5. Хранить стакан открыт в течение нескольких минут, чтобы избежать брызг за счет реакции окисления органического вещества и выделением СО 2.
- Наконец, поставить стакан на горячей плите при Абоут 100 ° С в течение нескольких часов или до решения совершенно ясно.
- Открыть стакан и высушить раствор на горячей плите при температуре около 100 ° С.
- После того, как образец сухой, добавьте 1 мл 1,5 N HBr к образцам; закрыть стакан, и пусть он распустить на горячей плите при 100 ° С в течение нескольких часов.
- Между тем приготовить 500 мкл колонки.
- Добавить 500 мкл сетки смолы AG1X8 200-400 на колонку и положить его на полку колонки с мусорном стакане под ним. Промыть смолы чередованием: 5 мл 18,2 МОм ⋅ см воды, 5 мл 0,5 н HNO 3, 5 мл воды, 5 мл 0,5 н HNO 3, а затем 5 мл воды. Используйте кондиционер смолы с 5 мл 1,5 N HBr.
- Удалить стаканы из горячей плите и поместить их в ультразвуковой ванне в течение 30 мин, а затем позволить стаканы остыть до комнатной температуры.
- После того, как стакан охлаждают и смолу промывают, открыть мензурку. Положите адаптер наконечника Тон шприц, добавьте пипетки; пипетки на 1 мл образца и загрузить его на смоле (очень медленно, чтобы не перемешивать смолу).
- После того как все жидкость проходит через колонку, добавляют 5 мл 1,5 N HBr.
- После того, как 5 мл 1,5 N HBr через колонку, заменить мусора стакан с чистой 15 мл химический стакан.
- Добавляют 5 мл 0,5 н HNO 3 2,5 мл за один раз. На этом этапе Zn элюируют из смолы.
- После того, как 5 мл HNO 3 проходит через колонку, снимите стакан и поместить его на горячей плите при 100 ° С до тех пор, пока сушат.
- Удалить столбец из держателя колонны; мусор смолы (использовать новую смолу для каждого образца).
- После того, как образец высохнет, повторите протокол с таким же объемом кислот на меньшем колонке (100 мкл), а затем поместить его на горячей плите, пока не высушили. Образец готов к масс-спектрометрии.
4. Масс-спектрометрия-Измерение
- Анализ изотопного компо Znложение на нескольких коллектор-индуктивно-связанной плазмы масс-спектрометра (МС-ICP-MS).
- Используйте параметры машины приведены в таблице 1.
- Поместите чашки Фарадея, чтобы собрать в массе (m / z) 62 Ni, Cu 63, 64 Zn, Cu 65, 66, 67 Zn Zn и 68 Zn.
- Приготовьте раствор, содержащий 500 частей на миллиард Zn в 0,1 М HNO 3 для изотопного анализа.
- Проанализировать 500 частей на миллиард раствор Zn с помощью распылительной камеры в сочетании с 100 мкл / мин тефлоновой распылитель. Для каждого образца, измерения 30 сканирований (1 блок из 30 циклов), в которых время интегрирования каждой развертки 8,389 сек.
- Исправьте фон путем вычитания на пик интенсивности нулевые от контрольного раствора (0,1 М HNO 3 раствора, используемого для повторного растворения образцов).
- Контроль и правильно можно 64 Ni изобарической вмешательство путем измерения интенсивности пика 62 Ni.Предположим, что / 62 Соотношение 64 Ni Ni естественно (0,2548), правильно это значение из инструментальной предвзятости массовой, а затем удалить 64 Ni от массы 64, как:
64 Zn реального = 64 Zn измеряется - 64 Ni = 64 Zn измеряется - (64 Ni / 62 Ni), естественно х 62 Ni измерить. - Откорректируйте инструментальную массовое смещение в скобки каждого из образцов с 500 частей на миллиард стандартного раствора стандарта СМК Лион Zn (или другого доступного стандарта, например IRMM-3702). Выполнение стандартного брэкетинг путем деления Zn соотношение образца 66 Zn / 64 от среднего значения Zn отношение двух стандартов измеренных до и после образца минус 1 и умноженное на 1000. 66 Zn / 64 (смотри уравнение 1). Типичный внешний точность по стандарту СВК Лион Zn 0,05 permil / нуклон (2 стандартное отклонение, 2 SD).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В 1,5 N HBr, основные виды цинка (ZnBr3-) формы очень сильные комплексы с анионообменной смолой, тогда как большинство других элементов не взаимодействуют со смолой. Цинк затем извлекают путем изменения среды в разбавленной HNO 3, изменение видообразования Zn в Zn2 +, который высвобождается из смолы 6,7.
Изотопные, как правило, выражается в частях на 1000 отклонения по отношению к стандарту:
с х = 66 или 68. справочные материалы используется Zn "Лион" стандарт СВК 3-0749 L 1. Стандарт "Лион" является наиболее широко используется справочный материал для нормализации изотопных данных Zn. Все изотопные результаты являются, следовательно, относительная. Используя эту ссылку изотопный состав Земли Fили δ 66 Zn 0,28 ± 0,05 8. Так стандарт СВК-Лион не легко доступны, в отсутствие данного стандарта альтернативой является использование стандартного IRMM-3702 в качестве ссылки во время измерений и преобразования результатов, используя ссылку 9, как: 66 Zn СВК-Лион = 66 Zn IRMM-3702 0,29. Типичный заготовка <10 нг.
Типичные результаты, полученные с помощью этого метода представлены на рисунке 1, в три изотопа участка (δ 68 Zn против δ 66 Zn) для различных органов мыши. Таблица 2 и 3 приведены результаты экспериментов реплицированными типичной земной породы (Гавайский базальт) и мыши красные кровяные клетки.
Рисунок 1. δ 68 Zn против δ 66 Znдля различных органов мыши. типичный бар ошибка 0,07 permil для δ 66 Zn и 0,15 для δ 68 Zn показано на рисунке. Данные ссылки 15.
| Настройки МС-ИСП-МС | Нептун |
| ВЧ-мощность (Вт) | 1300 |
| Ускорение потенциал (V) | 10000 |
| Расход газа | |
| Ар охлаждающей жидкости (л / мин) | 18 |
| Вспомогательный Аг (л / мин) | 1 |
| Образец Аг (л / мин) | 1-1.2 |
| Скорость поглощения раствора (molution | 100 |
| Параметры анализа | |
| Количество блоков | 1 |
| Количество измерений в блоке | 30 |
| Время интеграции (с) | 8,389 |
| Типичный Zn концентрация образцов и стандарта (частей на миллиард) | 500 |
| Типовой КПД передачи V / млн | 25 |
Таблица 1: Параметры МС-ИСП-МС для изотопных измерений Zn в Институте де Телосложение дю глобус де Пари.
| Образцы | δ 66 Zn | 2se | δ 68 Zn | 2se | н |
| повторить 1 | 0.34 | 0.01 | 0.68 | 0.04 | 4 |
| повторить 2 | 0.34 | 0.01 | 0.68 | 0.01 | 3 |
| повторить 3 | 0.34 | 0.02 | 0.67 | 0.02 | 4 |
| повторить 4 | 0.36 | 0.06 | 0,7 | 0.09 | 4 |
| повторить 5 | 0.31 | 0.02 | 0,65 | 0.06 | 4 |
| повторить 6 | 0.33 | 0.01 | 0.68 | 0.02 | 3 |
| повторить 7 | 0,32 | 0.06 | 0.63 | 0,1 | 6 |
| Средний | 0.33 | 0.03 | 0.67 | 0,05 | 7 |
| 2SD | 0.04 | 0,05 | |||
| п = число измерений повторного от MC-ICP-MS |
Таблица 2: Zn изотопного состава Гавайев базальт K179-1R1-170.9 каждой повторности представляет полный химическую очистку и среднем несколько независимых измерений масс-спектрометр.. Данные ссылки 8.
| Количество мыши | δ 66 Zn | δ 68 Zn |
| 11 | 0.82 | 1.6 |
| 12 | 0.79 | 1.55 |
| 13 | 0.84 | 1.65 |
| 14 | 0.87 | 1.72 |
| Средний | 0.83 | 1.63 |
| 2SD | 0.07 | 0,15 |
Таблица 3: Zn изотопный состав костей мышей каждой повторности представляет собой полную химическую очистку.. Данные ссылки 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Воспроизводимость измерений оценивается через воспроизведены анализа тех же образцов, проведенных в различных аналитических сессий. Например 6, мы воспроизвели ту же скалу земной 7 раз, и мы получили результаты, представленные в таблице 2.
Как и ожидалось из теории изотопного фракционирования 10 и измеренным в любом солнечного вещества системы до сих пор (например, метеорит 11-13, растения 3-5, глубоководные отложения 14, 15-17 животных), результаты следовать масс- зависит право (рисунок 1). δ 68 Zn примерно в два раза δ 66 Zn (рисунок 1), поскольку разность масс 68 и 64 Zn Zn в два раза разница между 66 и 64 Zn Zn. Это показывает, что наши измерения свободны от помех изобарических (что бы ездить данные изот прямой линии) и, что цинк изотопов фракционируют из того же изотопного бассейна.
Для органов мыши, ограниченное количество Zn в каждом органе помешало нам выполнять многие повторов одного органа 15. Тем не менее, можно оценить более высокий предел воспроизводимости путем сравнения данных по той же ткани для различных мышей того же возраста и того же штамма (например, для костей 16-недельных мышей, таблица 3). Это воспроизводимость больше (0,04 против 0,07 для δ 66 Zn), чем то, что, по оценкам от базальтовых пород, которые не удивительно, потому что она включает в себя гетерогенность выборок, а также изотопный изменчивость между различными мышей. Поэтому переоценка воспроизводимости, и мы считаем, что точность на каждом отдельном органе было бы похоже на то, что мы определяли на базальтовых пород. Мы можем смело предположить, воспроизводимость лучше, чем 0,10 для ^8; 66 Zn (2 SD), которая представляет собой точность в 10 раз больше, чем изменчивость отчетный между определенными органами (см рисунок 1 и ссылку 15).
Измерение стабильный изотопный состав Zn будет использоваться в будущем в качестве диагностического инструмента для заболеваний, которые изменяют Zn баланса организма. Например, богатых цинком бляшки, связанные с болезнью Альцгеймера изменять концентрацию цинка в сыворотке и так как мозг и сыворотки имеют различные изотопный состав 15 Zn изотопы могут быть использованы для выявления ранней стадии болезни.
Большинство альтернативных методов измерения изотопного состава Zn по MC-ICP-MS привлекать химическую очистку в концентрированной HCl СМИ на больших колонках, чем той, которая используется здесь 1-4. Наш метод основан на микро-колонн и разбавленных кислот имеет низкие заготовки и производит данные, которые в два раза точнее (50 млн против 100 млн 2 SD). В Additион, наш метод очень быстро (из-за небольшого размера столбцов и небольшим количеством кислоты, используемой) и очень хорошо подходит для анализа большого количества образцов (как правило, необходимо в клинических исследованиях). Простота метода будет хорошо подходит для использования в автоматическом химической системы очистки, которая позволила бы измерения большого количества образцов.
Одно ограничение этого подхода состоит в том, что только большие объемные образцы могут быть проанализированы (процедура использует ~ 1 мкг Zn). Уменьшение размера образцов имеет решающее значение при работе с драгоценными клинических образцов. Этот метод также ограничен сыпучих измерений, а для некоторых применений в анализах на места могут быть необходимы. Дальнейшего совершенствования на технике должно быть в отношении с улучшением в точке изотопных измерений путем объединения системы лазерной абляции с плазменной масс-спектрометра (LA-MC-ICP-MS). Это позволит измерений пространственно небольших образцов без рRIOR химическая очистка (которая, как правило, загрязняют образцы). Кроме того, на месте измерения позволит измерение изотопного состава Zn на живых тканях. Насколько нам известно, был только одну попытку измерить отношения изотопов цинка, используя такую технику 18 и метод все еще не достаточно точным, однако, измерения высокой точности соотношения изотопов LA-MC-ICP-MS было сделано для Fe 19 и B 20 и переработки техники с использованием современных лазеров может привести к крупным прорывом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
FM-подтверждает финансирование от НРУ через Chaire d'Совершенство IDEX Сорбонна Париж Сите, Insu через PNP гранта, Институт Университетский де Франс, а также программа Labex UniverEarth Сорбонны в Париже Сите (ANR-10-LabX-0023 и НРУ -11-IDEX-0005-02). Мы также благодарим финансирование от Европейского исследовательского совета при Европейского сообщества H2020 рамочной программы / ERC грантовое соглашение # 637503 (Нетронутый).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter | Thermo-Fisher | ||
| Anion-exchange resin AG1 X8 200-400 | Bio-Rad | 140-1443-MSDS | |
| Teflon beakers | Savillex | 200-015-12 | |
| In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon |
References
- Marechal, C. N., Telouk, P., Albarede, F. Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma-source mass spectrometry. Chemical Geology. 156 (1), 251-273 (1999).
- Marechal, C. N., Albarede, F. Ion-exchange fractionation of copper and zinc isotopes. Geochim. Cosmochim. Acta. 66 (9), 1499-1509 (2001).
- Weiss, D. J., Mason, T. F. D., Zhao, F. J., Kirk, G. J. D., Coles, B. J. Isotopic discrimination of zinc in higher plants. New Phytologist. 165 (3), 703-710 (2005).
- Jouvin, D., Louvat, P., N, M. F. C. Zinc isotopic fractionation: why organic matters. Environ Sci Technol. 43 (15), 5747-5754 (2009).
- Moynier, F., et al. Isotopic fractionation and transport mechanisms of Zn in plants. Chemical Geology. 267 (3-4), 125-130 (2009).
- Moynier, F., Herzog, G., Albarede, F. Isotopic composition of zinc, copper, and iron in lunar samples. Geochim. Cosmochim. Acta. 70 (24), 6103-6117 (2006).
- Moynier, F., et al.
- Chen, H., Savage, P., Teng, F. Z., Helz, R., Moynier, F. Zinc isotope fractionation during magmatic differentiation and the isotopic composition of the bulk Earth. Earth Planet. Sci. Lett. 369-370, 34-42 (2013).
- Moeller, K., et al. Calibration of the new certified materials ERM-AE633 and ERM-AE6447 for copper and IRMM 3702 for zinc isotope amount ratio determination. Geostd. Geoan. Res. 36 (2), 177-199 (2012).
- Bigeleisen, J., Mayer, M. Calculation of equilibrium constants for isotopic exchange reactions. J. Chem. Phys. 15, 261-267 (1947).
- Luck, J. M., Ben Othman, D., Albarede, F. Zn and Cu isotopic variations in chondrites and iron meteorites: Early solar nebula reservoirs and parent-body processes. Geochim. Cosmochim. Acta. 69 (22), 5351-5363 (2005).
- Moynier, F., Dauphas, N., Podosek, F. A Search for 70Zn Anomalies in Meteorites. Astrophys. J. 700 (2), L92-L95 (2009).
- Paniello, R., Day, J., Moynier, F. Zn isotope evidence for the origin of the Moon. Nature. 490 (7420), 376-380 (2012).
- Pichat, S., Douchet, C., Albarede, F. Zinc isotope variations in deep-sea carbonates from the eastern equatorial Pacific over the last 175 ka. Earth and Planetary Science Letters. 210 (1-2), 167-178 (2003).
- Moynier, F., Fujii, T., Shaw, A., Le Borgne, M. Heterogeneous of natural Zn isotopes in mice. Metallomics. 5 (6), 693-699 (2013).
- Balter, V., et al. Bodily variability of zinc natural isotope abundance in sheep. Rapid Com. Mass. Spec. 24, 605-612 (2010).
- Balter, V., et al. Contrasting Cu, Fe, and Zn isotopic patterns in organs and body fluids of mice and sheep, with emphasis on cellular fractionation. Metallomics. 5 (11), 1470-1482 (2010).
- Urgast, D. S., et al. Zinc isotope ratio imaging of rat brain thin sections from stable isotope tracer by LA-MC-ICP-MS. Metallomics. 4, 1057-1063 (2012).
- Marin-Carbonne, J., Rollion-Bard, C., Luais, B. In-situ measurements of iron isotopes by SIMS: MC-ICP-MS intercalibration and application to a magnetite crystal from the Gunflint chert. Chem. Geol. 285 (1-4), 50-61 (2011).
- Fietzke, J., et al. Boron isotope ratio determination in carbonates via LA-MC-ICP-MS using soda-lime glass standards as reference material. J. Anal. Atom. Spec. 25, 1953-1957 (2010).
